(植物中)淀粉酶活性的测定

(植物中)淀粉酶活性的测定

一实验目的

本实验的目的在于掌握淀粉酶的提取及活性的测定方法。

二实验原理

植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，有α－淀粉酶及β－淀粉酶，其活性因植物生长发育时期不同而有所变化，其中以禾谷类种子萌发时淀粉酶活性最强。

α－淀粉酶和β－淀粉酶都各有其一定的特性，如β－淀粉酶不耐热，在高温下容易钝化，而α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下容易发生钝化。通常酶提取液中同时存在两种淀粉酶，测定时，可以根据他们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可以测出另一种酶的活性。将提取液加热到70℃维持15分钟以钝化β－淀粉酶，便可测定α－淀粉酶的活性。或者将提取液用pH3.6的醋酸在0℃加以处理，钝化α－淀粉酶，以测出β－淀粉酶的活性。

淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3,5－二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原成3－氨基-5-硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可以求出麦芽糖到含量。以麦芽糖的毫克数表示淀粉酶活性大小。

三实验材料

萌发的小麦、大麦或者豆类等（芽长1cm左右）

四实验仪器和试剂

1．仪器：

电子天平、研钵、100mL容量瓶（1个）、50mL量筒（1个）、刻度试管[25mL（9个）、10mL（1个）]、试管6支、移液管[1mL（2支）、2mL（2支）、10mL（2支）]、离心机、恒温水浴锅、7220型分光光度计

2．试剂：

1％淀粉溶液、0.4mol/LNaOH、

pH5.6的柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸20.01g，溶解后稀释至1 000mL；B、称取柠檬酸钠29.41g，溶解后稀释至1 000mL；取A液13.70mL与B液26.30mL 混匀即是。

3,5－二硝基水杨酸：精确称取3,5－二硝基水杨酸1g溶于20mL1mol/LNaOH 中，加入50mL蒸馏水，在加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL，盖紧瓶盖，勿让CO2进入。

麦芽糖标准液：称取化学纯麦芽糖0.100g溶于少量蒸馏水中仔细移入100mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。

五操作步骤

1．酶液的提取：

称取萌发的水稻种子0.5g（芽长1cm左右，置于研钵中加石英砂研磨成匀浆，移入25mL刻度试管中，用水稀释至刻度，混匀后在温室下放置，每隔数分钟振荡一次，放置20分钟后离心，取上清液备用。

2．α－淀粉酶活性的测定：

（1）取三支试管，编号注明1支为对照管，2支为测试管。

（2）于每管中各加入酶提取液1mL，在70℃恒温水浴中（水文的变化不应该超过±0.5℃），准确加热15分钟，在此期间β－淀粉酶受热钝化，取出后迅速在自来水中冷却。

（3）在试管中各加入1mLpH5.6的柠檬酸缓冲液。

（4）向对照管中加入4mL0.4mol/LNaOH，摇动2－3分钟，静止2分钟，以钝化酶的活性，再加入1％淀粉2mL。

（5）将测定管置40℃（±0.5℃）恒温水浴中保温15分钟，再加入40℃下预热的1％淀粉溶液2mL，摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温15min取出，迅速加入4mL0.4mol/LNaOH，以终止酶的活动，然后准备下一步糖的测定。

3．α－淀粉酶和β－淀粉酶总活性的测定：

取上述酶提取液1mL，放入刻度试管中，用蒸馏水稀释至10mL（稀释程度视酶活性的大小而定）。混合均匀后，取3支试管，1支为对照管，2支为测定管，各加入稀释的酶液1mL、pH5.6的柠檬酸缓冲液1mL。以上步骤重复α－淀粉酶测定的第（4）及（5）的操作，同样准备糖的测定。

4．麦芽糖的测定：

（1）标准曲线的制作：

取25mL刻度试管5个编写号分别加入麦芽糖标准液（1mg/mL）0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL，然后于各管加入蒸馏水使溶液为2mL，再各加3,5-二硝基水杨酸试剂2mL，置沸水中准确煮5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。用7220型分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录光密度，以光密度为纵坐标，以麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。

（2）样品的测定

取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1mL，分别加入25mL刻度管中，再加入1mL的水，3,5-二硝基水杨酸试剂2mL，混匀置沸水中准确煮5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至25mL，混匀。用7220型分光光度计在520nm 的波长下进行比色，记录吸光度，从麦芽糖标准曲线中计算出麦芽糖含量，用以表示酶的活性。

六结果计算

A: α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）

A1: α-淀粉酶对照管中麦芽糖量（mg）

B: α+β-淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量（mg）

B1: α+β-淀粉酶的对照管中的麦芽糖量（mg）