血友病携带者与产前基因诊断_陆晔玲
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陆晔玲 1 丁秋兰 1 戴菁 1 王鸿利 2 奚晓东 3 王学锋 1 (1.上海交通大学医学院附属瑞金医院 临床输血科 , 上海 200025;2.上海血液学研究所 ;3.基因组学国家 重点实验室 )
摘要 :目的 建立 1种简便 、快速的血友病携带 者检测 与产前 诊断体 系 。 方法 对 38 个血友病 A家系 , 用 长链 PCR及序列特异 PCR作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 ;有家族史家系可联合 F8基因 内外的 8个多态 性 位点进行遗传 连锁 分 析 , DXS52(ST14)位 点多 态 性以 PCR产物 凝 胶 电 泳法 检 测 , 7 个 STR位 点 (F8Civs13、 CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的 多 态性 以多 重荧 光 PCR法检 测 , 产 前诊 断 加用 性别 位 点 (Amelo);对于散发家系 , 通过直接核苷酸测序查找先证者的基因 突变 , 继而对 家系女 性成员作 携带者 与产前 诊 断 。 对 12个血友 病 B家系采用直接核苷酸 测序法确定基因突 变 , 多重 荧光 PCR法检测 F9基因外 6 个 STR位 点 (DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性 。 结果 38个血友病 A家系 中 , 10名 先 证者的 F8基因内含子 22倒位检测为阳性 , 1例先证者为 F8基因内含子 1倒位阳性 , 对于有家族史的家系 , 综合 应用倒位检测和遗传连 锁分析 , 携带者与产前诊断率均为 100%;4个散发家系 均可找到 致病突变 ;38个血友 病 A家系的携带者及产前 诊断总诊断率为 94.81% 。 12 个血友 病 B家 系中有 10个家 系通过 直接 测序可 找到 突 变 , 联合 F9基因外 6 个 STR位点对血友病 B家系的遗传连锁分析的可诊断率为 96.88%。 结论 F8基因内 含 子 22及 1倒位筛检联合 F8基因内 、外多个位点 的遗传连锁分析可 以进行血 友病 A的 携带者及 产前诊 断 ;直 接 核苷酸测序可确定 F9基因突变 , 而联合基因外多个多态 性位点检测并进行遗传连锁分析 , 是血友 病 B携带者 检 测与产前诊断的简便 、快速的方法 。 关键词 :血友病 ;携带者检测 ;产前诊断 ;倒位检测 ;核苷酸测序 中图分类号 :R457.1 文献标识码 :A 文章编号 :1004-549X(2008)04-0259-06 Carrierdetectionandprenataldiagnosisofhaemophilia LUYeling, DINGQiulan, DAIJin, etal.Departmentof Transfusion, RuijinHospital, Shanghai200025, China AbstractObjects Toestablishasimple, rapidcarrierdetectionandprenataldiagnosissystem forhemophilia. Methods Thirty-eightHAfamiliesweretestedfortheintron22 and1 inversionsinfactorVIIIgenebyLD-PCRand PCR.Theremaininginversionnegativefamilies, butwithfamilyhistory, werescreenedusinglinkageanalysiswith8 combined polymorphic markers, including St14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073, and DXS1108.Forsporadicfamilies, thewholegenesequencingwasapplieddirectlytodetectthemutation.ForHBfamilies, linkageanalysiswith6 STRs, includingDXS1192, DXS1211, DXS8094, DXS8013, DXS1227 andDXS102, wasappliedtogetquickdiagnosticinformation.Thewholegenesequencingwasusedtogetthefinaldiagnosis.TherapidfluorescentPCRcombinedwithpolymorphism markerswereappliedforlinkageanalysisinHAandHBfamilies, respectively.Assoonasthepregnancywasidentified, additionalAmelositedetectionwouldbeperformed.Results In38 HA families, introns22 and1 inversionswerefoundin10 and1 probands, respectively.ThediagnosticratesofSt14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073 andDXS1108 were61.11%, 76.67%, 71.43%, 70.59%, 62.50%, 10.00%, 75.00% and50.00%, respectively.Combininginversiondetectionandlinkageanalysis, thediagnosticrateofcarrierdetectionandprenataldiagnosisoffamilieswithHAfamilyhistorywereboth1 00%.Oneintron22 inversionand3 mutationsweredetectedin4 sporadicfamilies.Thetotaldiagnosticrateof38 HAfamilieswas94.81%. And10 mutationsweredetectedinthe12 HBfamilies.Combinedwiththelinkageanalysis, thetotaldiagnosticratewas 96.88%.Conclusions Introns22 and1 inversionscreeningcombinedwiththelinkageanalysis, usingthehighlyinformativepolymorphicmarkers, canbeusedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisinChineseHAfamilies.ThedirectsequencingofFⅨ withthelinkageanalysiscanbesuccessfullyappliedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisof HBfamilies. Keywords:Haemophilia;Carrierdetection;Prenataldiagnosis
· 260·
中国输血杂志 2008年 4月第 21 卷第 4期 ChinJBloodTransfusion, April, 2008, Vol.21, No.4
血友病 A(HA)和 B(HB)是常见的遗传性出 血病 , 呈 X性联隐性遗传 。由于缺乏根治措施 , 故 作携带者和产前诊断可避免血友病胎儿的出生 , 对 提高人口素质 , 减轻社会负担有重要意义 。 我们通 过对 HA家系作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 , 对 HB家系用直接核苷酸测序确定 F9基因突变 , 并联合应用对 2个基因相应 STR位点的遗传连锁 分析 , 建立了 1种简便 、快速的血友病携带者检测 与产前诊断的方法 , 现报道如下 。
DO I :10.13303/j .c jbt .issn.1004 -549x .2008.04.024
中国输血杂志 2008年 4月第 21 卷第 4期 ChinJBloodTransfusion, April, 2008, Vol.21, No.4
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
· 259·
· 论 著 ·
血友病携带者与产前基因诊断
献 [ 2]方法操作 , 根据扩增产物的片段长度进行判 断 :正常人的 LD-PCR产物片段为 12kb, 男性若发 生 F8基因内含 子 22 倒位 , LD-PCR产物片段为 11kb, 即可诊断为血友病 A;与其有血缘关系的女 性携 带 者 的 LD-PCR产 物 片 段 也 相 应 为 12 及 1 1kb。 1.4.2 PCR法检测 F8基因内含子 1倒位 按文献 [ 1, 4]方法操作 , 分别扩增 F8 基因内含子 1中的 Int1h-1片段及 F8 基因外的 Int1h-2 片段 , 产物经 琼脂糖凝胶电泳 25min后 , 紫外光下观察电泳条带 并摄影 。 1.4.3遗传连锁分析 间接诊断 。 1)PCR法检测 ST14(VNTR):参照文献 [ 2]引物及扩增条件 ;2)多 重 荧 光 PCR法 作 多 态 性 遗 传 分 析 :DXS15、 DXS9901、 G6PD、 DXS1073、 DXS1108、 F8Civs13、 CA22(图 1)和性别位点 (牙釉蛋白基因 ), 终产物 在 X染色体为 106bp, 在 Y染色体为 112bp。参考 文献 [ 1, 5]方法重新设计引物 (表 1), 所有引物有 着相同的退火温度 ;PCR反应分为 2组 (含引物 4 对 /组 ), 体 系均为 10μl, 含 1μl10 ×buffer, 0.4μl 25mmol/LMg2+, 0.2μl(dNTP各 2.5 mmol/L), 100ngDNA模板 , 0.3UHotstarTaqDNA聚合酶及 0.3μl引物混合液 (5μM);PCR反应条件 :95℃预 变性 15min, 94℃变性 20s, 62℃退火 40s, 72℃延伸 60s, 11 个 循环 , 每个 循 环退 火温 度 下降 0.5℃, 94℃变性 20s, 56℃退火 30s, 72℃延伸 60s, 20个循 环 , 72℃最后延伸 8min;结果用 Genescan和 Genotyper软件 (AppliedBiosystems)分析判断 。
1 材料与方法
1.1 病例 来 源 1)HA家 系 :38 个 (4 个 无家 族 史 ), 全部 227名成员中 , 有 50名妇女需作携带者 诊断 , 其中 27 名须作产前诊断 ;2)HB家系 :12个 (4个无家族史 ), 全部 83名成员中有 24名女性需 作携带者诊断 , 其中 8名须作产前诊断 。 50 家系 中的先证者均为男性并经本院血液科按血友病诊 断标准确诊 。 1.2主要试剂及仪器 引物序列[ 1— 4] :见表 1(其中 内含子 22 倒位引物 , 由大连 Takara公司合成 , 其 它引物由上海申能博彩公司合成 ;长距离聚合酶链 反应 (LD-PCR)所用 La-Taq酶 (KA3001A, Takara 公司 );其它 PCR反应所用试剂 (E2101, 上海申能 博彩公司 );LD-PCR所需 deaza-dGTP(12954, 美国 PharmaciaBiotech公司 );PCR仪 (PTC-200型 , MJ Research公司 )。 1.3 外周血及羊水 DNA抽提 外周血 DNA抽提 按常规氯仿方法 , 羊水 DNA抽提方法为 :对需产前 诊断的女性 , 于孕 16— 22周在彩色 B超批量引下 抽取羊水 20ml, 立即 3 000r离心 20min※弃上清 , 加生理盐水 20ml混匀 ※3 000r离心 20min, 弃上 清 , 收集 沉淀 ※加白 细胞裂 解液 400μl, 25% SDS 8μl, 2mg/ml蛋白酶 k5μl, 混合后 置 37℃水浴 3h ※取出后加平衡酚 400μl, 3 000r离心 5min※吸取 上层液体并加入平衡酚 200μl※3 000r离心 5min 后取上层 液体 , 并加 入无水 乙醚 400μl, 混匀 ※3 000r离心 5min※弃上清 , 再加入无水乙醚 200μl, 混匀 ※3 000r离心 5min※弃上清 , 重复上一步骤一 次 ※加入 3M NaAc40μl及 冰 无水 乙 醇 1ml, 使 DNA析出 ※5 000r离心 5min见沉 淀 , 弃上清 ※ 70%乙醇洗涤一次 , 弃上清 ※干燥后加适量三蒸水 溶解 , -80℃保存待用 。 1.4 HA携带者和产前诊断方法 1.4.1 LD-PCR检测 F8基因内含子 22倒位 按文
摘要 :目的 建立 1种简便 、快速的血友病携带 者检测 与产前 诊断体 系 。 方法 对 38 个血友病 A家系 , 用 长链 PCR及序列特异 PCR作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 ;有家族史家系可联合 F8基因 内外的 8个多态 性 位点进行遗传 连锁 分 析 , DXS52(ST14)位 点多 态 性以 PCR产物 凝 胶 电 泳法 检 测 , 7 个 STR位 点 (F8Civs13、 CA22、DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073、DXS1108)的 多 态性 以多 重荧 光 PCR法检 测 , 产 前诊 断 加用 性别 位 点 (Amelo);对于散发家系 , 通过直接核苷酸测序查找先证者的基因 突变 , 继而对 家系女 性成员作 携带者 与产前 诊 断 。 对 12个血友 病 B家系采用直接核苷酸 测序法确定基因突 变 , 多重 荧光 PCR法检测 F9基因外 6 个 STR位 点 (DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102)的多态性 。 结果 38个血友病 A家系 中 , 10名 先 证者的 F8基因内含子 22倒位检测为阳性 , 1例先证者为 F8基因内含子 1倒位阳性 , 对于有家族史的家系 , 综合 应用倒位检测和遗传连 锁分析 , 携带者与产前诊断率均为 100%;4个散发家系 均可找到 致病突变 ;38个血友 病 A家系的携带者及产前 诊断总诊断率为 94.81% 。 12 个血友 病 B家 系中有 10个家 系通过 直接 测序可 找到 突 变 , 联合 F9基因外 6 个 STR位点对血友病 B家系的遗传连锁分析的可诊断率为 96.88%。 结论 F8基因内 含 子 22及 1倒位筛检联合 F8基因内 、外多个位点 的遗传连锁分析可 以进行血 友病 A的 携带者及 产前诊 断 ;直 接 核苷酸测序可确定 F9基因突变 , 而联合基因外多个多态 性位点检测并进行遗传连锁分析 , 是血友 病 B携带者 检 测与产前诊断的简便 、快速的方法 。 关键词 :血友病 ;携带者检测 ;产前诊断 ;倒位检测 ;核苷酸测序 中图分类号 :R457.1 文献标识码 :A 文章编号 :1004-549X(2008)04-0259-06 Carrierdetectionandprenataldiagnosisofhaemophilia LUYeling, DINGQiulan, DAIJin, etal.Departmentof Transfusion, RuijinHospital, Shanghai200025, China AbstractObjects Toestablishasimple, rapidcarrierdetectionandprenataldiagnosissystem forhemophilia. Methods Thirty-eightHAfamiliesweretestedfortheintron22 and1 inversionsinfactorVIIIgenebyLD-PCRand PCR.Theremaininginversionnegativefamilies, butwithfamilyhistory, werescreenedusinglinkageanalysiswith8 combined polymorphic markers, including St14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073, and DXS1108.Forsporadicfamilies, thewholegenesequencingwasapplieddirectlytodetectthemutation.ForHBfamilies, linkageanalysiswith6 STRs, includingDXS1192, DXS1211, DXS8094, DXS8013, DXS1227 andDXS102, wasappliedtogetquickdiagnosticinformation.Thewholegenesequencingwasusedtogetthefinaldiagnosis.TherapidfluorescentPCRcombinedwithpolymorphism markerswereappliedforlinkageanalysisinHAandHBfamilies, respectively.Assoonasthepregnancywasidentified, additionalAmelositedetectionwouldbeperformed.Results In38 HA families, introns22 and1 inversionswerefoundin10 and1 probands, respectively.ThediagnosticratesofSt14, F8IVS13, CA22, DXS15, DXS9901, G6PD, DXS1073 andDXS1108 were61.11%, 76.67%, 71.43%, 70.59%, 62.50%, 10.00%, 75.00% and50.00%, respectively.Combininginversiondetectionandlinkageanalysis, thediagnosticrateofcarrierdetectionandprenataldiagnosisoffamilieswithHAfamilyhistorywereboth1 00%.Oneintron22 inversionand3 mutationsweredetectedin4 sporadicfamilies.Thetotaldiagnosticrateof38 HAfamilieswas94.81%. And10 mutationsweredetectedinthe12 HBfamilies.Combinedwiththelinkageanalysis, thetotaldiagnosticratewas 96.88%.Conclusions Introns22 and1 inversionscreeningcombinedwiththelinkageanalysis, usingthehighlyinformativepolymorphicmarkers, canbeusedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisinChineseHAfamilies.ThedirectsequencingofFⅨ withthelinkageanalysiscanbesuccessfullyappliedforcarrierdetectionandprenataldiagnosisof HBfamilies. Keywords:Haemophilia;Carrierdetection;Prenataldiagnosis
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中国输血杂志 2008年 4月第 21 卷第 4期 ChinJBloodTransfusion, April, 2008, Vol.21, No.4
血友病 A(HA)和 B(HB)是常见的遗传性出 血病 , 呈 X性联隐性遗传 。由于缺乏根治措施 , 故 作携带者和产前诊断可避免血友病胎儿的出生 , 对 提高人口素质 , 减轻社会负担有重要意义 。 我们通 过对 HA家系作 F8基因内含子 22及 1倒位检测 , 对 HB家系用直接核苷酸测序确定 F9基因突变 , 并联合应用对 2个基因相应 STR位点的遗传连锁 分析 , 建立了 1种简便 、快速的血友病携带者检测 与产前诊断的方法 , 现报道如下 。
DO I :10.13303/j .c jbt .issn.1004 -549x .2008.04.024
中国输血杂志 2008年 4月第 21 卷第 4期 ChinJBloodTransfusion, April, 2008, Vol.21, No.4
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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血友病携带者与产前基因诊断
献 [ 2]方法操作 , 根据扩增产物的片段长度进行判 断 :正常人的 LD-PCR产物片段为 12kb, 男性若发 生 F8基因内含 子 22 倒位 , LD-PCR产物片段为 11kb, 即可诊断为血友病 A;与其有血缘关系的女 性携 带 者 的 LD-PCR产 物 片 段 也 相 应 为 12 及 1 1kb。 1.4.2 PCR法检测 F8基因内含子 1倒位 按文献 [ 1, 4]方法操作 , 分别扩增 F8 基因内含子 1中的 Int1h-1片段及 F8 基因外的 Int1h-2 片段 , 产物经 琼脂糖凝胶电泳 25min后 , 紫外光下观察电泳条带 并摄影 。 1.4.3遗传连锁分析 间接诊断 。 1)PCR法检测 ST14(VNTR):参照文献 [ 2]引物及扩增条件 ;2)多 重 荧 光 PCR法 作 多 态 性 遗 传 分 析 :DXS15、 DXS9901、 G6PD、 DXS1073、 DXS1108、 F8Civs13、 CA22(图 1)和性别位点 (牙釉蛋白基因 ), 终产物 在 X染色体为 106bp, 在 Y染色体为 112bp。参考 文献 [ 1, 5]方法重新设计引物 (表 1), 所有引物有 着相同的退火温度 ;PCR反应分为 2组 (含引物 4 对 /组 ), 体 系均为 10μl, 含 1μl10 ×buffer, 0.4μl 25mmol/LMg2+, 0.2μl(dNTP各 2.5 mmol/L), 100ngDNA模板 , 0.3UHotstarTaqDNA聚合酶及 0.3μl引物混合液 (5μM);PCR反应条件 :95℃预 变性 15min, 94℃变性 20s, 62℃退火 40s, 72℃延伸 60s, 11 个 循环 , 每个 循 环退 火温 度 下降 0.5℃, 94℃变性 20s, 56℃退火 30s, 72℃延伸 60s, 20个循 环 , 72℃最后延伸 8min;结果用 Genescan和 Genotyper软件 (AppliedBiosystems)分析判断 。
1 材料与方法
1.1 病例 来 源 1)HA家 系 :38 个 (4 个 无家 族 史 ), 全部 227名成员中 , 有 50名妇女需作携带者 诊断 , 其中 27 名须作产前诊断 ;2)HB家系 :12个 (4个无家族史 ), 全部 83名成员中有 24名女性需 作携带者诊断 , 其中 8名须作产前诊断 。 50 家系 中的先证者均为男性并经本院血液科按血友病诊 断标准确诊 。 1.2主要试剂及仪器 引物序列[ 1— 4] :见表 1(其中 内含子 22 倒位引物 , 由大连 Takara公司合成 , 其 它引物由上海申能博彩公司合成 ;长距离聚合酶链 反应 (LD-PCR)所用 La-Taq酶 (KA3001A, Takara 公司 );其它 PCR反应所用试剂 (E2101, 上海申能 博彩公司 );LD-PCR所需 deaza-dGTP(12954, 美国 PharmaciaBiotech公司 );PCR仪 (PTC-200型 , MJ Research公司 )。 1.3 外周血及羊水 DNA抽提 外周血 DNA抽提 按常规氯仿方法 , 羊水 DNA抽提方法为 :对需产前 诊断的女性 , 于孕 16— 22周在彩色 B超批量引下 抽取羊水 20ml, 立即 3 000r离心 20min※弃上清 , 加生理盐水 20ml混匀 ※3 000r离心 20min, 弃上 清 , 收集 沉淀 ※加白 细胞裂 解液 400μl, 25% SDS 8μl, 2mg/ml蛋白酶 k5μl, 混合后 置 37℃水浴 3h ※取出后加平衡酚 400μl, 3 000r离心 5min※吸取 上层液体并加入平衡酚 200μl※3 000r离心 5min 后取上层 液体 , 并加 入无水 乙醚 400μl, 混匀 ※3 000r离心 5min※弃上清 , 再加入无水乙醚 200μl, 混匀 ※3 000r离心 5min※弃上清 , 重复上一步骤一 次 ※加入 3M NaAc40μl及 冰 无水 乙 醇 1ml, 使 DNA析出 ※5 000r离心 5min见沉 淀 , 弃上清 ※ 70%乙醇洗涤一次 , 弃上清 ※干燥后加适量三蒸水 溶解 , -80℃保存待用 。 1.4 HA携带者和产前诊断方法 1.4.1 LD-PCR检测 F8基因内含子 22倒位 按文