高通量测序NGS数据分析中的质控
二代测序质控各参数标准
二代测序质控各参数标准一、引言二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）是一种高通量的基因组测序技术，广泛应用于生物医学研究、农业育种、疾病诊断等领域。
在二代测序过程中，质量控制（QualityControl，QC）是至关重要的一步，其中质控参数的设定和标准是关键。
本文将介绍二代测序质控各参数的标准。
二、样本质量评估1.完整性：样本应保持完整，无断裂或降解。
可通过测定样本的分子量、片段长度分布等指标进行评估。
2.浓度：样本浓度应在合理范围内，过高或过低的浓度都可能导致测序质量下降。
3.特异性：样本应具有特异性，不应包含其他杂质序列。
可通过序列特异性指数（Sequence-SpecificityIndex）进行评估。
三、测序数据质量评估1.序列深度：测序深度是指测得的有效序列数量。
理想情况下，测序深度应覆盖目标区域的每个碱基。
2.覆盖度：覆盖度是指测序序列对目标区域的整体覆盖程度。
理想情况下，应具有广泛的覆盖度，以保证准确性和可信度。
3.质量值分布：测序质量值应在合理范围内，过低或过高的质量值都可能导致错误率升高。
4.碱基错配率：碱基错配率是指非特异性碱基的比例。
应尽可能降低错配率，以保证结果的准确性。
四、质量控制标准1.严格控制样本质量和浓度，确保样本具有特异性。
2.确保测序深度和覆盖度达到预期要求，同时关注质量值和错配率。
3.对数据进行多维度分析，包括序列长度、GC含量、突变位点等，以确保结果的全面性和准确性。
4.根据实验需求和样本特性，制定合适的质控参数标准，并定期评估和调整。
5.建立完善的质控流程和标准，确保实验数据的可靠性和可信度。
五、结论二代测序质控各参数标准的设定和评估是质量控制的关键环节。
通过严格控制样本质量和浓度、确保测序深度和覆盖度、关注质量值和错配率、多维度分析数据等措施，可以提高二代测序的准确性和可信度。
同时，建立完善的质控流程和标准，定期评估和调整质控参数，可以确保实验数据的可靠性和可信度，为后续研究提供有力支持。
赛福基因公开课第四节《高通量测序（NGS）数据分析中的质控》
赛福基因公开课第四节《高通量测序（NGS）数据分析中的质控》大家好，很高兴今天有机会和大家一起来探讨高通量数据分析中质量控制的相关知识和技术。
这次探讨的内容包括三个方面：高通量测序和数据分析的基本流程，高通量数据分析中的原始数据质控和高通量数据分析中的比对结果质控。
首先，为什么需要做质量控制呢？我们知道，要想有一个好的分析结果，必须要有一个质量好的数据。
理想的情况是：高通量测序的结果里只有我们想要的序列,而且每个序列碱基的可信度都是100%。
但现实并非如此。
比如在建库过程中的各种物理化学原因或污染，测序仪本身的缺陷等，都会造成测序结果里有不利用分析的序列存在，比如碱基的质量过低或者含有其他来源的污染序列。
为了后续生信分析的的可靠性，就要把这些不利于分析序列部分或整条清除。
那怎样来查看数据质量，怎样处理不理想的数据以得到相对可靠的分析结果呢？首先我们来看看高通量数据分析的基本流程，看看哪些步骤应该做质控。
第一个部分：高通量测序和数据分析的基本流程。
在高通量数据测序和分析的流程中，首先，要从需要测序的组织里提取DNA，然后将提取的DNA片段化。
如果要测全基因组（全基因组测序即WGS）的话，这些片段就可以直接用来扩增和测序。
如果只要测外显子区域（全外显子测序即WES）的话，就要利用这些片段和探针对外显子区进行捕获和富集，然后对捕获的外显子区DNA进行测序。
如果这些测序得到的结果里只含有我们需要的序列而且测序仪识别的每个碱基都正确的话，下面所需要做的只是将序列比对到参考基因组，从比对结果里识别DNA变异，最后对识别到的变异进行功能注释用来寻找致病的变异。
但事实上，通过全基因组测序或全外显组测序得到的结果里不只是含有我们需要的序列，而且碱基的可信度也不是100%。
所以，为了得到可靠的生信分析结果，我们就必须做质控（quality control）。
如右边的示意图所示，质控包括拿到数据之后对原始数据的质控和比对到参考序列以后对原始比对结果的质控。
NGS数据质量评估方法与标准说明
NGS数据质量评估方法与标准说明一、引言在当前快速发展的基因组学研究中，下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术已成为重要的工具。
然而，随着数据量的增加，保证NGS数据质量的准确性和可靠性对于研究结果的解释和应用至关重要。
因此，本文将从NGS数据质量评估的方法和标准两个方面进行探讨与说明。
二、NGS数据质量评估方法NGS数据质量评估的目的是通过分析测序数据中的错误和偏差，确定数据的准确性和可靠性。
下面介绍几种常用的NGS数据质量评估方法。
1. 物理测序质量评估物理测序质量评估是通过分析测序reads中的错误类型和频率来评估测序数据的质量。
常用的质量评估工具包括FastQC、PRINSEQ等。
这些工具可以分析碱基质量、碱基序列分布、测序错误率等指标，并将结果以图表的形式展示出来。
研究人员可以通过这些指标来评估测序的准确性和可靠性，并选择合适的后续分析策略。
2. 比对质量评估比对质量评估是针对已经比对到参考序列的测序数据进行质量评估。
常用的比对质量评估工具包括SAMtools、Picard 等。
这些工具可以根据比对的结果，分析比对率、比对质量、插入和删除错误率等指标。
研究人员可以通过这些指标来评估测序数据的比对质量，进一步确定其准确性和可靠性。
3. 变异质量评估变异质量评估是针对检测到的 DNA 变异进行质量评估。
常用的变异质量评估工具包括GATK、VarScan等。
这些工具可以分析变异的类型、频率、覆盖度等指标，并通过统计学方法来评估变异的可靠性和真实性。
研究人员可以根据这些指标来判断变异是否具有生物学意义和研究价值。
三、NGS数据质量评估标准NGS数据质量评估标准是用于衡量测序数据质量的参考指标，旨在提供统一的标准和规范。
以下是常见的NGS数据质量评估标准。
1. 碱基质量阈值碱基质量阈值是评估DNA测序数据质量的重要指标之一。
常见的衡量方法是通过phred评分系统，通常设置阈值为Q20或Q30。
基因测序技术的高通量分析与质量控制方法研究
基因测序技术的高通量分析与质量控制方法研究随着生物学研究的不断深入和生物技术的迅猛发展，基因测序技术已成为一种关键的分析工具。
基因测序技术的高通量分析与质量控制方法的研究对于准确获取测序结果和确保实验结果的可靠性至关重要。
本文将围绕基因测序技术的高通量分析和质量控制方法展开讨论。
首先，高通量分析方法的研究是基于下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术的基因测序领域中的一个关键方向。
传统的测序方法往往以Sanger测序为代表，但其低通量性和高成本限制了其在大规模测序中的应用。
而NGS技术的出现，以其高通量、高效率和低成本等特点，已经在基因组学、转录组学和蛋白质组学等多个研究领域得到了广泛应用。
高通量分析方法的研究主要集中在提高测序效率、降低误差率和优化实验流程等方面。
例如，基于改进的碱基识别算法和样本标记技术，可以提高碱基识别的准确性和测序的可靠性；基于微流控技术，可以实现高通量的并行测序，提高测序效率；基于引物设计和文库构建优化，可以减少错误扩增和文库损失，提高测序产出。
其次，质量控制方法在基因测序中起着至关重要的作用。
由于测序样本的复杂性和数据量的庞大，必然存在一定的测序误差。
因此，质量控制作为测序数据分析的重要环节，旨在准确识别和过滤掉低质量的测序数据，从而提高测序结果的可靠性。
常用的质量控制方法包括测序数据预处理、质量评估和质量过滤等。
测序数据预处理主要包括去除接头序列、低质量碱基修剪和过滤低质量的reads。
质量评估通常使用基于比对率和错误率的质量评分算法，如Phred质量评分系统，来评估测序数据的可靠性。
质量过滤则是通过设置阈值，并据此剔除低质量的测序数据，以提高后续分析的准确性。
在高通量测序中，质量控制方法的研究还面临一些挑战和问题。
首先，测序数据的体积庞大，如何高效地进行质量控制成为一个亟待解决的问题。
针对这一问题，研究人员提出了一些基于分布式计算和并行计算的质量控制方法，以提高处理速度和效率。
高通量测序数据分析的基本流程与软件介绍
高通量测序数据分析的基本流程与软件介绍高通量测序技术的广泛应用已经在基因组学、转录组学、表观基因组学等领域产生了巨大的影响。
高通量测序数据分析是将测序仪输出的原始数据转化为有意义的生物学信息的过程。
本文将介绍高通量测序数据分析的基本流程以及一些常用的软件工具。
1. 数据质控与预处理高通量测序数据的质量对后续分析结果至关重要。
首先，需要对测序数据进行质量控制，检查测序质量值、测序错误率、测序深度等指标，以评估数据的可靠性。
常用的质控软件包括FastQC和NGS QC Toolkit。
在质控后，还需要对原始测序数据进行预处理，包括去除接头序列、过滤低质量序列、去除PCR扩增引物等。
这些步骤可以使用Trimmomatic、Cutadapt等软件来完成。
2. 序列比对与变异检测在得到高质量的测序数据后，下一步是将测序reads比对到参考基因组或转录组上。
常用的比对软件有Bowtie、BWA、STAR等。
比对结果可以用于检测基因组上的变异，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失（Indel）等。
变异检测软件包括GATK、SAMtools等。
3. 基因表达分析基因表达分析是高通量测序数据分析中的一个重要方面。
它可以帮助我们了解哪些基因在不同条件下的表达水平发生了变化。
常用的基因表达分析流程包括表达定量、差异表达分析和功能富集分析。
表达定量是将测序reads映射到基因组或转录组上，并计算每个基因的表达水平。
常用的表达定量软件有HTSeq、featureCounts等。
差异表达分析可以帮助我们找到在不同条件下表达水平有显著变化的基因。
常用的差异表达分析软件有DESeq2、edgeR等。
功能富集分析可以帮助我们了解差异表达基因的功能特征，如富集通路、功能分类等。
常用的功能富集分析工具有DAVID、GSEA等。
4. 转录因子结合位点分析转录因子结合位点是转录因子与DNA结合的特定区域，对基因的调控起重要作用。
高通量测序数据可以用于预测转录因子结合位点。
【新知解读】二代测序核酸质控环节怎么做？看完就懂！
【新知解读】二代测序核酸质控环节怎么做？看完就懂！核酸质控是NGS（Next Generation Sequencing）实验中必不可少的环节，精确的NGS实验结果也离不开合格的核酸质控。
核酸质控主要是评估核酸的浓度，完整性、纯度及片段大小。
核酸样本涉及的下游实验很多，质控不合格会影响实验结果的准确性，甚至得到错误的结论。
NGS实验中使用质量差，如降解程度高的核酸样本建库可能导致文库浓度低，文库复杂度低，甚至文库构建失败等；文库浓度定量不准确可能导致测序实际分配数据量不均，或簇密度波动甚至导致实验失败。
详情可参考往期内容【新知解读】测序失败风险排查——多的是你不知道的事现在市面上主流的核酸质控方法有紫外可见吸收光度法（UV-Vis）（如Nanodrop）、荧光染料法（如Qubit）、琼脂糖凝胶电泳法（如Gel-electrophoresis）、自动化电泳法（如2100 Bioanalyzer）、荧光定量PCR法（如qPCR）等。
如何挑选合适的核酸质控方法来保证NGS实验的顺利进展？相信是小伙伴们十分关注的问题。
不要担心！今天小石头带大家来回顾各种核酸质控方法的原理及应用。
常用的核酸质控方法01紫外可见吸收光度法生物有机分子中的芳香环，具有紫外吸收的特性。
核酸，蛋白质、多肽、芳香基团、苯酚以及碳氢化合物均可吸收紫外光。
核酸在260 nm波长处具有最高吸收峰，蛋白质在280 nm波长处具有最高吸收峰，碳水化合物在230 nm波长处具有最高吸收峰。
根据朗伯-比尔（Beer-Lambert）光吸收定律：当一束平行单色光垂直入射通过均匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶液对光的吸收程度（K）与溶液的浓度（c）及液层厚度（b）的乘积成正比。
即：A=Kbc，式中K为吸光系数；A为吸光度；b为溶液液层厚度（或称光程长度）；c为溶液浓度。
一般在260 nm下，1 μg/ml DNA溶液在1 cm光径比色皿中的吸光系数为0.020，1 μg/ml RNA溶液在1 cm光径比色皿中的吸光系数为0.022。
高通量基因测序数据分析研究
高通量基因测序数据分析研究1. 引言随着NGS（Next Generation Sequencing）技术的快速发展，人们能够获取到前所未有的巨大的基因组学数据。
高通量基因测序（High-throughput sequencing）是NGS技术的一种，它快速且准确地生成了数量巨大的DNA序列数据。
这些数据包含了基因组的各个方面信息，如基因表达、突变等。
然而，为了从这些数据中获取有意义的信息，需要经过复杂的数据处理和分析流程。
本文将介绍高通量基因测序数据分析的基本原理和流程。
2. 数据质控高通量基因测序数据的质量对下游数据分析的可靠性和准确性具有重要影响。
数据质量评估包括测序质量评估、读长长度分布、碱基分布、序列复杂性等。
一般情况下，数据质检的数据来源包括：测序仪器提供的仪器参数、FastQC、自定义脚本等。
数据质检的主要目标在于发现测序数据存在的问题或者错误，以便后续的处理和分析。
3. 序列比对将高通量基因测序得到的reads序列比对到参考序列是NGS数据分析流程中的一项重要工作。
序列比对的主要目的是找出reads在参考序列上的位置以及其与参考序列上的差异。
比对算法应该考虑到不同来源的误差，如测序误差、分析软件的误差等。
此外，还需要考虑基因组重复序列的影响。
4. 变异检测变异分析是高通量基因测序数据分析中的重要环节。
变异分析可以鉴定出基因组变异的类型及其精确位置，为研究人员深入理解生物现象提供重要信息。
变异检测的主要方法包括SNP/InDel检测、复杂变异检测、结构变异检测等。
变异检测的具体流程包括过滤低质量比对、去除fasta序列的重复在于变异检测等，流程多样，可以根据数据类型和研究目的进行调整。
5. 基因表达分析高通量基因测序不仅可以用于描述基因组中的变异信息，还可以用于研究基因的表达水平。
基因表达分析是通过将reads比对到参考基因组或转录组，计算每个转录本的读取数，进而计算差异表达，比如基因的上调或下调。
ngs hla分型流程
ngs hla分型流程
NGS（下一代测序）HLA分型是通过高通量测序技术对人类白细
胞抗原（HLA）基因进行分型的过程。
HLA基因编码了人体免疫系统
中的重要蛋白质，对于器官移植、疾病易感性和药物治疗反应等方
面具有重要意义。
下面是NGS HLA分型的流程：
1. 样品准备，首先需要从受试者的血液或组织样本中提取DNA。
这可以通过标准的DNA提取方法来实现。
2. 文库构建，提取的DNA样本需要通过文库构建过程进行准备，这包括DNA片段的制备、末端修饰和连接DNA测序接头等步骤。
3. 文库质控，对构建好的DNA文库进行质控，确保文库中的DNA片段长度和浓度符合测序要求。
4. 下一代测序，将文库进行高通量测序，通常采用Illumina
或Ion Torrent等平台进行测序。
在测序过程中，通过对DNA片段
进行大规模的并行测序，可以获得大量的测序数据。
5. 数据分析，得到的测序数据需要进行生物信息学分析，包括
序列比对、HLA基因的定量和定性分析等步骤。
这一步通常需要借
助专业的生物信息学软件和数据库进行。
6. 结果解读，最后，根据数据分析的结果进行HLA基因型的解
读和分型。
这包括确定HLA基因的等位基因，即确定受试者的HLA
基因型。
总的来说，NGS HLA分型是一个复杂的过程，涉及到样品准备、文库构建、高通量测序、数据分析和结果解读等多个环节。
通过这
一流程，可以准确地确定受试者的HLA基因型，为临床诊断和治疗
提供重要的信息。
NGS基因组数据分析关键影响因素探讨
NGS基因组数据分析关键影响因素探讨NGS（Next-Generation Sequencing，下一代测序）技术是一项革命性的DNA测序技术，可以高效、准确地测定基因组中的所有序列。
NGS技术已经广泛应用于生物学研究、医学诊断、农业科学等领域，对于揭示生物体的基因组结构、功能及其与疾病的关系具有重要意义。
在NGS基因组数据分析过程中，存在许多关键影响因素需要加以探讨，以提高分析结果的准确性。
首先，样本质量是影响NGS数据分析的关键因素之一。
样本的DNA质量直接影响到后续的测序和数据分析的效果。
因此，在进行NGS实验之前，需要对DNA样本进行质量检测，确保其达到测序的标准要求。
此外，样本的存储和处理也会影响到数据的质量。
正确的样本处理和储存方法可以有效防止DNA的降解和污染，减少误差的引入。
其次，测序深度也是NGS数据分析的关键因素之一。
测序深度是指对于每个碱基进行测序的次数。
过低的测序深度可能导致数据的覆盖率不足，从而影响到后续的位点分析和变异检测。
而过高的测序深度则会浪费资源，并增加数据处理的难度。
因此，合理地确定测序深度是非常重要的。
一般来说，研究中所关注的目标越小，所需要的测序深度就越低，相应地，关注的目标越大，所需要的测序深度就越高。
此外，数据质量控制也是NGS数据分析的一个关键环节。
由于NGS技术的特殊性，数据中往往存在着各种各样的错误。
因此，在进行分析之前，需要对原始数据进行质量控制，包括去除低质量的序列、去除接头序列和引物序列等。
同时，数据的质量评估也是不可忽视的一步，可以使用各种不同的指标对数据的质量进行评估，以准确判断数据的可靠性和可用性。
此外，选择合适的分析工具和算法也是NGS数据分析的关键因素之一。
目前，NGS数据分析涉及到的工具和算法非常多，每种工具和算法都有其特定的优缺点。
因此，在选择工具和算法时，需要根据研究的目的和数据的特点，进行合理的选择。
此外，对于那些没有现成工具和算法支持的研究问题，也可以进行相应的软件开发和算法优化。
高通量测序(NGS)数据分析中的质控
高通量测序错误总结一、生信分析部分1）Q20/Q30碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标，质量值越高代表碱基被测错的概率越小。
Q30 代表碱基的正确判别率是99.9% ，错误率为0.1% 。
同时我们也可以理解为1000 个碱基里有 1 个碱基是错误的。
Q20 代表该位点碱基的正确判别率是99% ，错误率为1% 。
对于整个数据来说，我们可以认为100 个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中，背景颜色沿y- 轴将坐标图分为 3 个区：最上面的绿色是碱基质量很好的区，Q 值在30 以上。
中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接受的区，Q 值在20-30 之间。
最下面红色的是碱基质量很差的区。
在一些生信分析中，比如以检查差异表达为目的的RNA-seq 分析，一般要求碱基质量在Q 在Q20 以上就可以了。
但以检查变异为目的的数据分析中，一般要求碱基质量要在Q30 以上。
一般来说，测序质量分数的分布有两个特点：1.测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。
2.有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高，质量值相对较低。
在图中这个例子里，左边的数据碱基质量很好，而右边的数据碱基质量就比较差，需要做剪切（trimming），根据生信分析的目的不同，要将质量低于Q20或者低于Q30的碱基剪切掉。
2）序列的平均质量这个是碱基序列平均质量报告图。
横坐标为序列平均碱基质量值，纵坐标代表序列数量。
通过序列的平均质量报告，我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普遍过低的情况。
一般来说，当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30，可以判断序列质量较好。
如这里左边的图，我们可以判断样品里没有显著数量的低质量序列。
但如果曲线如右边的图所示，在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰，说明测序数据中有一部分序列质量较差，需要过滤掉。
3）GC含量分布这个是GC含量分布报告图。
GC含量分布检查是检测每一条序列的GC含量。
高通量测序技术的临床应用及质量管理
高通量测序技术的临床应用及质量管理高通量测序技术，又称下一代测序技术（next generation sequencing，NGS），能够一次对大量核酸分子进行平行序列测定。
随着测序技术的发展及成本的降低，在临床遗传性疾病基因诊断、肿瘤的诊断、靶向治疗、液体活检、感染性疾病病原体筛查等方面得到了广泛应用。
由于NGS 检测步骤繁琐、流程复杂，对结果分析解读要求高，检测具有一定特殊性，在临床应用中伴随出现了许多问题，对其质量管理提出了新的挑战。
一、高通量测序技术在临床上的应用1.NGS在遗传病诊断中的应用：NGS技术的发展逐渐改变了遗传疾病诊断的方式。
根据不同文库构建方式，可分为全基因组（whole-genome sequencing，WGS）、全外显子（whole-exome sequencing，WES）、医学外显子、靶向基因测序等。
传统遗传病的研究方法是从临床表型到基因型分析，即所谓的“正向遗传学”研究方法。
随着NGS技术的发展，形成了以遗传信息为基础确定表型的“反向表型”研究方式，使临床医生能够根据个体的遗传变异准确预测疾病及相关临床表现。
当同种疾病不同患者的表型因人而异时，以基因型为基础的方法能够在疾病表征完全展现前对患者进行诊断，凸显了NGS技术在遗传性罕见疾病临床诊断中的优势［1］。
常用的研究方法包括：（1）使用WES或WGS分析具有相同临床特征的一组患者，筛选出不同患者中的相同变异；（2）先证者与父母或其他家庭成员同时进行WES或WGS 分析，并根据疾病遗传模式（常染色体显性、隐性、X连锁或新发变异）筛选出致病变异。
2.NGS在肿瘤诊断、靶向治疗以及预后监测中的应用：随着精准医学和测序技术的发展，NGS在肿瘤的早期筛查、诊断治疗、预后评估方面显示出独特优势。
NGS可用于识别癌症中常见的基因变异，包括单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）、小片段插入缺失、拷贝数变异（copy number variation，CNV）以及某些恶性肿瘤中的融合基因［2, 3］。
高通量测序标准操作规程
高通量测序标准操作规程高通量测序是一种能够同时测定多个DNA或RNA序列的技术，它已经成为生命科学研究中不可或缺的工具之一。
高通量测序标准操作规程则是指在高通量测序实验中，各项操作的标准化规程，以确保实验的准确性、可靠性和重复性。
以下是一个1200字的高通量测序标准操作规程示例。
一、引言高通量测序技术的发展使得基因组学、转录组学、蛋白质组学等研究领域取得了重大突破。
高通量测序标准操作规程旨在规范高通量测序实验流程，提供详细的操作步骤、实验条件和质量控制要求，确保实验结果的准确性和可靠性。
二、实验准备1. 准备样品：DNA或RNA样品应经过提取、纯化和定量，确保样品的完整性和浓度。
2. 准备引物和试剂：根据实验设计，选择合适的引物和试剂，并确保其质量良好。
3. 准备实验器材：包括离心管、PCR管、PCR仪、浮游电极手套、离心机、DNA测序仪等。
三、实验操作1. 样品制备(1) 将样品注射器中的样品转移至离心管中。
(2) 加入适量的缓冲液、酶切酶和特定的引物。
(3) 混匀离心管，置于适当的温度下反应一段时间。
(4) 利用离心机进行离心，去除离心管中的杂质。
(5) 将样品转移至PCR管中，进行PCR扩增反应。
2. 文库构建(1) 将PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。
(2) 提取目标片段，并使用DNA提取试剂进行纯化。
(3) 根据实验要求，进行连接反应、连接纯化和连接鉴定等步骤。
(4) 根据实验设计，选择合适的DNA纯化方法，提取纯化后的文库DNA。
3. 过滤片段(1) 准备合适的过滤器和物理过滤装置。
(2) 将文库DNA注入过滤器中，加入适量的缓冲液进行过滤。
(3) 收集过滤后的片段，并进行定量和质量评估。
4. 测序反应(1) 将过滤后的片段注入到测序仪中。
(2) 设置适当的实验参数，进行测序反应。
(3) 根据测序仪的要求，采集测序数据，并进行数据质量控制。
四、质量控制1. 实验前的质量控制(1) 样品质量控制：通过紫外吸收法检测DNA或RNA 样品的浓度和纯度。
各突变检测方法比较
各突变检测方法比较突变检测方法是一种可以通过分析DNA或RNA序列中存在的突变来确定个体基因组的方法。
随着生物技术的不断发展和突变检测技术的进步，现在有多种突变检测方法可供选择。
本文将比较常见的突变检测方法，包括Sanger测序、测序质控方法、聚合酶链反应（PCR）和下一代测序（NGS）。
1. Sanger测序：Sanger测序是最早、也是最常用的突变检测方法之一、它通过将DNA 复制成多个不同长度的碎片，然后利用DNA聚合酶合成更长的DNA链。
这些新合成的链具有DNA模板链上特定碱基的大小差异，其中每个碱基都用一种特定的荧光染料标记。
接下来，将这些DNA链分离并置于聚丙烯酰胺凝胶上，通过电泳将它们按长度排序。
最后，使用激光束照射这些凝胶，并使用荧光探测器来读取每种荧光染料的信号。
这种方法的优点是价格相对较低，可以处理较少的样本数，并且具有高度可靠性。
然而，它的缺点是无法处理大量的样本，且对于长度较长的DNA片段的检测效果较差，有时产生阅读错误。
2.测序质控方法：测序质控方法是一组评估测序结果质量的技术。
其中一种方法是使用外部引物扩增测序产品，并通过测定荧光峰的高度和面积来确定每个碱基的读取质量。
这种方法的优点是能够快速、可靠地评估序列质量，并检测可能存在的杂合突变。
然而，它无法提供详细的突变信息，只能评估总体测序质量，不适合检测具体的点突变。
3.PCR（聚合酶链反应）：PCR是一种通过体外合成DNA的方法，可以扩增从RNA或DNA模板中选择的特定DNA片段。
PCR通常用于扩增检测间隔较大或需要进行针对性突变检测的特定基因组区域。
PCR方法可以在少量和复杂的样本中进行突变检测，并具有较高的灵敏度。
它还可以用于分析特定基因或突变与疾病相关性的研究。
然而，PCR需要有关突变位置的先验信息，并且无法检测未知的突变。
4.下一代测序（NGS）：NGS是一种高通量、高效和成本效益高的测序技术，可以快速测定DNA或RNA样本中的所有变异。
高通量基因测序数据质量控制方法优化策略
高通量基因测序数据质量控制方法优化策略基因测序技术的快速发展为我们提供了大量的基因组数据，但这些数据往往包含噪音和错误，因此，高通量基因测序数据的质量控制变得尤为重要。
本文将介绍一些优化策略，以提高高通量基因测序数据的质量控制效果。
1. 质量值评估和修剪质量控制的第一步是评估每个碱基的质量值，通常使用Phred质量分数来衡量。
这些质量值反映了测序结果的准确性和可信度。
我们可以使用各种质量评估工具（如FastQC）来分析质量值，并对低质量的碱基进行修剪。
修剪操作可以通过截断或删除低质量的碱基来提高数据的准确性。
2. 异常序列处理高通量基因测序中常常会出现异常序列，如接头污染、多聚物和引物二聚体。
这些异常序列会影响测序数据的质量和分析结果的准确性。
为了处理这些异常序列，我们可以使用去接头工具（如Cutadapt）来去除接头序列，并使用去重工具（如PRINSEQ）来去除多聚物和引物二聚体。
3. 过滤低质量序列在高通量基因测序中，存在着一些低质量序列，如低质量的reads和PCR重复序列。
这些低质量序列会占据存储空间，并降低分析结果的准确性。
为了过滤低质量序列，我们可以使用质量过滤工具（如Trimmomatic）来去除低质量的reads，并使用去重工具（如PRINSEQ）来去除PCR重复序列。
4. 错误修正高通量基因测序中常常会出现错配错误和缺失错误。
为了修正这些错误，我们可以使用错误修正工具（如BayesHammer）来对读取序列进行错误校正。
通过利用测序重复性的特点，错误修正工具可以准确地修正错配错误和缺失错误，提高数据的准确性。
5. 参考序列比对为了进一步提高高通量基因测序数据的质量控制，我们可以将测序数据与参考序列进行比对。
比对工具（如BWA）可以将测序数据与参考序列比较，并将对应的reads与参考序列对齐。
通过比对，我们可以判断测序数据的准确性和一致性，并排除低质量的reads。
6. 元数据分析高通量基因测序数据的质量控制不仅包括对序列本身的质量评估，还包括对元数据的分析。
高通量测序数据的质量评估与质控处理
高通量测序数据的质量评估与质控处理高通量测序技术的快速发展使得我们能够在短时间内获得大量的基因组数据。
然而，随着数据规模的增加，我们也面临着更多的挑战，其中之一就是如何评估和处理高通量测序数据的质量。
本文将着重介绍高通量测序数据质量评估的方法和质控处理的策略。
在进行质量评估之前，我们需要了解高通量测序数据的特点。
高通量测序产生的数据通常以FASTQ格式存储，其中包含了测序reads的碱基序列和对应的质量值。
质量值反映了每个碱基被测序仪器正确识别的概率，通常以Phred质量分数（Phred score）表示。
较高的质量值表示较高的准确性，而较低的质量值则可能意味着测序错误。
质量评估是评估高通量测序数据准确性和可靠性的重要步骤。
常用的质量评估指标包括测序reads的平均质量值、碱基错误率、错配率、GC含量等。
通过这些指标，我们可以初步了解数据的质量状况。
首先，我们可以通过绘制质量箱线图来直观地观察数据质量。
箱线图可以展示测序reads的质量分布情况，包括中位数、上下四分位数等统计量。
通过观察箱线图，我们可以判断数据是否存在异常情况，如低质量的碱基或过多的测序错误。
其次，我们可以通过计算测序reads的GC含量来评估数据的质量。
正常情况下，健康的基因组具有相对稳定的GC含量。
如果数据中GC含量呈现明显的偏差，则可能存在样本污染或测序错误的情况。
另外，我们还可以应用质量评估工具，如FastQC和NGSQC等，来全面评估数据的质量。
这些工具可以自动分析测序数据的质量情况，并生成详细的质量报告。
通过查看报告中的各项指标，我们可以更准确地评估数据的质量，并发现任何可能的问题。
一旦完成数据的质量评估，我们可以根据评估结果进行质控处理。
质控处理的目标是去除低质量的数据，从而提高后续分析的准确性和可靠性。
常用的质控处理策略包括去除低质量的碱基、截断reads以去除低质量部分、去除含有接头序列的reads等。
首先，我们可以根据质量值对测序reads进行过滤。
高通量测序数据的质量评估与质控处理
高通量测序数据的质量评估与质控处理高通量测序技术的广泛应用为我们提供了大量的生物序列数据，但随之而来的是数据的质量问题。
为了确保测序数据的准确性和可靠性，必须进行质量评估和质控处理。
本文将介绍高通量测序数据质量评估的方法和常见质控处理步骤。
首先，我们需要对测序数据进行质量评估。
这是因为测序过程中存在多种错误，如碱基替代错误、测序读长测不准确等。
质量评估可以帮助我们了解数据中存在的错误类型和错误率。
质量评估常用的方法包括观察质量值分布、查看碱基的质量箱线图、计算错误率等。
质量值分布是指通过对每个碱基进行质量评分，得到一个质量值。
我们可以绘制质量值的分布曲线，观察曲线的形状来判断数据的质量情况。
碱基的质量箱线图可以展示碱基的质量分布情况，帮助我们快速识别错误。
另外，我们还可以通过统计错误率来评估数据质量。
错误率是指测序数据中碱基替代错误的频率。
通过计算错误率，我们可以了解数据中碱基替代错误的程度，从而判断数据的质量。
质量评估之后，我们还需要进行质控处理，以提高数据的质量和可靠性。
常见的质控处理步骤包括过滤低质量的碱基、去除接头序列、去除重复序列和修剪低质量的末端序列。
首先，过滤低质量的碱基是指将质量值低于一定阈值的碱基去除。
质量值低的碱基往往会影响数据的可信度和分析结果的准确性，因此需要将其去除。
其次，去除接头序列是指将测序过程中引入的接头序列去除。
引入接头序列是为了将样本DNA进行扩增和测序，但接头序列的存在会影响数据分析的准确性，因此需要将其去除。
另外，去除重复序列是指将具有相同序列的片段去除。
在测序过程中，由于PCR过程的存在，会出现误差序列的扩增，导致一些片段具有相同的序列。
这些重复序列可能会对分析结果产生误导，因此需要将其去除。
最后，修剪低质量的末端序列是指将序列的末端部分去除。
末端序列往往质量较低，包含了测序过程中的噪音和错误，因此需要将其去除。
在进行质控处理之后，我们可以得到高质量的测序数据，可以用于后续的数据分析和研究。
高通量测序技术中的数据质量控制指南
高通量测序技术中的数据质量控制指南高通量测序技术是一种用于对DNA或RNA进行快速测序的先进技术，它已成为生物医学和基因组学研究中不可或缺的工具。
然而，高通量测序技术产生的海量数据要经过严格的质量控制，以确保结果的准确性和可靠性。
在本文中，我们将讨论高通量测序技术中的数据质量控制指南，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
首先，数据质量控制主要关注的是测序数据中是否存在错误的碱基配对、测序深度的一致性以及技术重复性。
下面，我们将分别对这些方面进行详细讨论。
1. 错误的碱基配对检测：高通量测序技术中，由于各种原因（如测序错误、基因突变等），可能会出现错误的碱基配对。
为了准确评估测序质量，可以通过一系列工具和方法来检测和纠正这些错误。
常用的方法包括比对到参考基因组、利用质量得分曲线和错误概率等进行分析，以识别和纠正潜在的错误。
2. 测序深度的一致性：测序深度是指某个碱基在测序数据中被重复测序的次数。
为保证测序结果的准确性，我们需要控制每个位置的测序深度在一个合理的范围内，以避免测序的覆盖不均匀性。
测序深度过低可能导致某些区域的数据量不足，从而影响结果的可靠性；而测序深度过高则可能导致测序错误的增加。
因此，我们需要通过合理的样本准备、测序数据过滤和基于测序深度的具体分析策略来控制测序深度的一致性。
3. 技术重复性：技术重复性是指在同一实验条件下进行多次测序所得的数据之间的一致性。
保证技术重复性可以提高数据的可靠性，减少操作和实验误差的影响。
为了评估技术重复性，我们可以使用不同的统计方法和计算指标，如Pearson相关系数、Intra-class相关系数、Coefficient of Variation等来衡量重复测序之间的一致性。
除了上述核心指标外，还有一些其他的数据质量控制指标也值得考虑。
例如，检查测序文库的质量，包括DNA或RNA样本的纯度和完整性，以及测序过程中可能出现的不合理现象。
此外，还可以对质控后的数据进行可视化分析，如测序数据的质量分布图、错误碱基情况统计和测序深度的柱状图等，以便更好地理解和解释数据。
高通量测序技术在高质量氮素调控中的应用
高通量测序技术在高质量氮素调控中的应用随着世界人口的持续增长以及气候变化的威胁，粮食安全的问题一直备受关注。
而氮素作为植物生长所需的重要营养元素，其有效利用率的提高对于粮食生产至关重要。
高通量测序技术的发展，为深入了解植物对氮素的响应机制提供了更加便捷、高效的工具。
一、高通量测序技术的发展与优势高通量测序技术，即Next Generation Sequencing (NGS)技术，与传统的Sanger测序技术相比，具有更高的通量、更快的速度以及更低的成本。
这一技术的发展，为我们提供了更全面、深入的分子水平信息，不仅能够对基因型进行分析，更能够了解基因型与表型之间的关系，深入揭示生物体对环境因素的响应机制。
二、高通量测序技术在植物-氮素响应研究中的应用1. 深入了解植物-氮素响应的分子机制高通量测序技术可以通过RNA测序，大幅度提高样本处理的通量和灵敏度。
通过测序数据分析，可以了解植物在不同氮素供应下的基因表达情况。
比如，采用转录组测序技术，可以获得轻量子氨基酸转运基因的不同表达亚型，揭示植物不同氮素供应下的氨基酸转运机制。
通过组蛋白谱测序技术，可以揭示植物中基因组DNA甲基化和翻译后修饰的变化情况，理解氮素对植物生长发育的调节机制。
2. 分子育种NGS技术可以协助分子育种工作，实现植物品种的快速鉴定和标记辅助选择。
例如，利用转录组测序技术，可以筛选出在不同氮素供应下表达差异较大的基因，并对这些基因进行功能分析。
通过叶绿体基因组测序技术，可以查找针对不同氮素供应表现出优良表型的品种材料中的差异位点。
而这些位点可以用于制定标记辅助选育计划，使选育过程更加高效。
3. 植物-微生物互作关系的分析植物-微生物互作关系对于植物生长发育和环境适应具有重要影响。
而高通量测序技术，可以在深入了解植物-氮素响应机制的同时，同时研究植物与微生物之间的相互关系。
通过采用谷氨酰胺代谢通路基因的转录组测序和微生物社区分析方法，揭示氮素供应对不同根际微生物群落的影响，为研究植物根系菌群及其生理功能提供了理论基础。
基于NGS技术的DNA测序质量分析
基于NGS技术的DNA测序质量分析NGS（Next Generation Sequencing）技术是一种高通量测序技术，已经成为基因组研究、生物技术和医学研究等领域的重要工具。
DNA测序是NGS技术的核心内容，它可以大大加快DNA测序速度，从而使基因组、转录组和外显子组等各种分子水平的研究具有高通量的特性。
但是，由于高通量的特性使得NGS技术存在一定的误差率和复杂性，在进行DNA测序后需要对其质量进行分析。
本文将介绍基于NGS技术的DNA测序的质量分析方法。
一、引言DNA测序是NGS技术的核心步骤之一，它的重要性不言而喻。
在NGS技术中，DNA测序可以对基因组、转录组和外显子组进行分子水平的研究，并且可以为各种实际应用提供支持。
但是，多种因素如仪器、样品和反应体系等会影响DNA测序过程中的质量。
因此，进行DNA测序后需要对其质量进行分析，以验证其准确性和鉴定出任何可能的误差。
通过DNA测序的质量分析可以识别出低质量的序列、突变、插入和删除等常见的错误，还可以评估各生物体的相对测序读数，从而为后续的生物信息学分析提供高质量的数据基础。
二、DNA测序质量分析的主要方法基于NGS技术的DNA测序质量分析需要进行多种方法的结合，这些方法包括：1、原始序列质量分析原始序列质量分析是DNA测序过程中的第一步分析，用于评估其准确性和质量。
分析过程从反应过程开始，包括反应体系、凝胶电泳和样品制备等环节。
在反应过程中，不同的环节会对反应体系产生影响，从而导致反应产生错误。
因此，需要评估反应体系和质量。
凝胶电泳可以评估反应结果，判断是否纯化。
样品制备也可以被评估，以确定样品是否可用于测序。
2、碱基质量分析碱基质量分析是对测序得到的每个碱基质量的评估。
通过分析碱基质量，可以识别出测序过程中的错误，找到低质量的序列，从而识别可能存在的污染和假阳性读数。
基于NGS技术的DNA测序中，碱基质量通常以Phred华氏质量值（Phred score）进行表示，Phred score越高，表示碱基质量越高，相反，Phred score越低，表示碱基质量越差。
ngs 原理
ngs 原理NGS（Next Generation Sequencing）是一种高通量测序技术，其原理是通过同时测序多个DNA分子，从而大大提高了DNA测序的速度和效率。
本文将从测序方法、数据分析和应用等方面介绍NGS的原理。
NGS的测序方法主要包括Illumina测序和Ion Torrent测序。
Illumina测序是通过将DNA分子固定在玻璃芯片上，然后利用荧光信号来测定DNA序列。
Ion Torrent测序则是利用DNA合成过程中释放的氢离子来测定DNA序列。
这两种方法都采用了并行测序的策略，即同时测序多个DNA分子，大大提高了测序的速度。
NGS的数据分析过程是十分重要的。
首先，需要对原始测序数据进行质控，去除低质量的序列。
然后，利用生物信息学工具将测序数据比对到参考基因组上，确定每个DNA分子的序列。
接着，可以对基因组进行变异分析、基因表达分析等，从而获得有关基因组的重要信息。
NGS在各个领域都有广泛的应用。
在基因组学研究中，NGS可以用于全基因组测序、外显子测序等，帮助科学家深入了解基因组的结构和功能。
在遗传学研究中，NGS可以用于检测基因突变、寻找致病基因等，对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
在生物多样性研究中，NGS可以用于分析环境样品中的微生物组成，帮助我们了解生物多样性的分布和演化。
此外，NGS还可以应用于药物研发、农业科学等领域。
总结起来，NGS是一种高通量测序技术，通过并行测序的策略大大提高了DNA测序的速度和效率。
通过对测序数据的分析，可以获得有关基因组的重要信息。
NGS在基因组学、遗传学、生物多样性研究等领域具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，NGS将在科学研究和医学诊疗中发挥越来越重要的作用。
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高通量测序错误总结一、生信分析部分1）Q20/Q30碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标，质量值越高代表碱基被测错的概率越小。
Q30代表碱基的正确判别率是99.9%，错误率为0.1%。
同时我们也可以理解为1000个碱基里有1个碱基是错误的。
Q20代表该位点碱基的正确判别率是99%，错误率为1%。
对于整个数据来说，我们可以认为100个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中，背景颜色沿y-轴将坐标图分为3个区：最上面的绿色是碱基质量很好的区，Q值在30以上。
中间的橘色是碱基质量在一些分析中可以接受的区，Q值在20-30之间。
最下面红色的是碱基质量很差的区。
在一些生信分析中，比如以检查差异表达为目的的RNA-seq分析，一般要求碱基质量在Q在Q20以上就可以了。
但以检查变异为目的的数据分析中，一般要求碱基质量要在Q30以上。
一般来说，测序质量分数的分布有两个特点：1.测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。
2.有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高，质量值相对较低。
在图中这个例子里，左边的数据碱基质量很好，而右边的数据碱基质量就比较差，需要做剪切（trimming），根据生信分析的目的不同，要将质量低于Q20或者低于Q30的碱基剪切掉。
2）序列的平均质量这个是碱基序列平均质量报告图。
横坐标为序列平均碱基质量值，纵坐标代表序列数量。
通过序列的平均质量报告，我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普遍过低的情况。
一般来说，当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30，可以判断序列质量较好。
如这里左边的图，我们可以判断样品里没有显着数量的低质量序列。
但如果曲线如右边的图所示，在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰，说明测序数据中有一部分序列质量较差，需要过滤掉。
3）GC含量分布这个是GC含量分布报告图。
GC含量分布检查是检测每一条序列的GC含量。
将样品序列的GC 含量和理论的GC含量分布图进行比较，用来检测样品数据是否有污染等问题。
理论上，GC含量大致是正态分布，正态分布曲线的峰值对应基因组的GC含量。
如果样品的GC含量分布图不是正态分布，如右图出现两个或者多个峰值，表明测序数据里可能有其他来源的DNA序列污染，或者有接头序列的二聚体污染。
这种情况下，需要进一步确认这些污染序列的来源，然后将污染清除。
4）序列碱基含量碱基含量模块是统计在序列中的每一个位置，四种不同碱基占总碱基数的比例。
它的目的是检测有无AT、GC分离的现象，而这种现象可能是测序或建库的系统误差所带来的，并且会影响后续的生信分析。
理论上，在随机的DNA文库中，G和C含量以及A和T含量在每个测序循环上应分别相等，在整个测序过程中，四条碱基含量线都出现波动，可能是样品库里有过多的接头序列的二聚体（图C，D）。
在建库过程中，如果加入的接头序列过量，两个接头序列可能会连在一起，中间没有要测序的插入序列，形成接头序列二聚体。
这些二聚体可以利用adapter trimmer 软件去除。
5）过量出现的序列过量序列模块是查看数据是否有污染的另一种方法。
如果某个序列的数量占全部序列的0.1%以上，FASTQC就定义该序列为over-represented。
这些over-represented序列通常标示着污染序列的存在。
这种污染如果是建库测序中的接头序列，fastqc可以检测并标示出可能的来源（possible source）。
但如果污染是由于其他来源的DNA，比如其他生物的DNA，FASTQC就没法判断污染序列的来源。
这就需要生信分析人员利用其他方法找出污染源。
比如将大量出现的序列和NCBI的DNA数据库进行blast，看看污染序列是否来自其他物种。
6）过量出现的Kmer检查是否有接头序列，还可以查看k-mer含量。
如果有些k-mer过量出现，很有可能有序列污染。
过量出现的k-mer可能会有三种情况：序列５'－端，序列中间，或者序列３'－端。
５’－端过量出现的k-mer是建库PCR扩增时PCR引物无法和DNA模板很好地结合导致的，是技术误差。
出现在中间的k-mer比较少见，可能是接头序列拼接到测序序列中间导致的。
3'-端出现过量k-mer往往标示着接头序列的污染。
7）接头序列含量对接头序列污染的查看还有一个更直观的模块，就是接头序列含量。
这里的两个例子中，左图没有显着的接头序列污染，右图的接头序列污染就比较显着。
8）去除duplication序列重复序列是怎么来的呢？在全基因组或全外显子组测序的建库过程中，需要进行多轮的PCR扩增。
由于扩增引物和不同模板结合力的差异，有些地方的序列扩增产物大于1。
这些重复序列的存在会造成等位基因频率的定义以及基因型识别不准确。
去除重复序列的原理是将所有比对到完全相同位置的序列对减少至一对。
一般用picardtools软件里的Markduplcate功能去除重复序列。
9）碱基质量分数重新校正对原始比对结果的另一个质量控制是对碱基的质量分数进行校正。
为什么要对碱基质量进行校正呢？这是因为由于各种系统误差，测序仪报告的碱基质量不精确，比实际质量分数偏高或者偏低。
系统误差和随机误差不同，不像随机误差，它其实是一种error。
这可能来自于测序反应中的物理化学原因，也可能是测序仪本身存在的缺陷造成。
碱基质量分数校正的原理是：利用机器学习的方法建立误差模要说明的一点是：碱基质量分数校正不能纠正碱基。
也就是说，我们无法通过这个方法确定一个低质量的A是否应该为T。
但可以告诉变异识别软件，它可以在多大程度上信任这个碱基A是正确的。
二、实验分析部分测序错误主要有三大类，分别来自样品制备、文库制备，以及测序和成像。
参考文献：The role of replicates for error mitigation in next-generationsequencing1）来源于样品制备的测序错误?1. 用户错误；例如，贴错标签。
虽然这是个低级错误，但肯定不会没犯过。
在芯片分析中，贴错标签和样品搞混可都是真事，有文献可查。
2. DNA或RNA的降解；例如，组织自溶，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织制备过程中的核酸降解和交联（甲醛固定样品会随机产生C-T转化，导致肺癌T790M假阳性增多）。
3. 异源序列的污染；例如，那些支原体和异种移植的宿主。
4. DNA起始量低。
早在2005年人们就发现，在PCR过程中，DNA起始量低的模板会以序列依赖的方式产生虚假的突变，主要是从G转变为A。
2）来源于文库制备的测序错误1. 用户错误；例如，一个样品的DNA残留到下一个，之前反应的污染。
2. PCR扩增错误。
这个同上面第4点。
3. 引物偏向；例如，结合偏向，甲基化偏向，错配导致的偏向，非特异性结合和引物二聚体的形成，发夹结构和干扰环，熔解温度太高或太低引入的偏向。
?4. 短捕获偏向，在高通量RNA测序的poly(A)富集过程中引入。
5. 独家突变；例如，那些由重复区域或独家变异的错配而引入的突变。
?6. 机器故障；例如，PCR循环温度不正确。
7. 嵌合读取。
?8. 条形码和/或接头错误；例如，接头污染，缺乏条形码多样性和不兼容的条形码。
3）来源于测序和成像的测序错误?1. 用户错误；例如，流动槽过载引起的簇crosstalk。
2. 移相；例如，不完整的延伸以及多个核苷酸而不是单个核苷酸的添加。
?3. “Dead”荧光基团，受损的核苷酸以及重叠信号。
4. 序列背景；例如，富含GC，同源和低复杂度的区域，及均聚物。
?5. 机器故障；例如，激光器、硬盘、软件和流体系统出故障。
6. 链的偏向。
?三、小知识1. 为什么碱基质量在序列的5’-端要差一些？答：这是由NGS的测序特点造成的。
NGS使用的是pyrosequencing (sequencing by synthesis)的方法。
在这个方法里，用来合成的4个碱基的混合物里A，C，T，G四个碱基分别带有绿色，蓝色，红色和黑色的荧光标记。
而且每个碱基上面都有一个blocker cap，使得每轮反应只能有一个碱基被加入到每个分子中。
然后把没有加入分子的游离碱基全部洗去后，对每个分子进行荧光检测来确定新加入的碱基是什么。
在下一轮开始之前，这个blocker cap要去被掉才可以加入下一个碱基。
如果某个序列的blocker cap没有能有效地去除，在下一个反应中就没有新的碱基加入，那这个序列的荧光和其他的序列是不一样的，这样总体的荧光强度就被消弱，碱基识别的可信度就被降低。
这种错误发生的概率很低，但随着测序长度的增加，这种错误的总数就越来越多，对荧光的影响就越来越大，测序的错误率就越来越大。
2. 什么是接头序列？为什么会有接头序列污染？为什么要清除接头序列？答：在构建高通量测序的DNA文库时，需要在待测的DNA片段两头分别连一段人工合成的DNA序列。
这两段人工合成的序列被称为接头序列。
接头序列里一般包含三个重要组成部分：区分样品的barcode序列，PCR? primer序列和测序引物结合的序列。
在一般情况下，待测的插入序列在5’-接头序列下游，5’-段的接头序列不会出现在测序结果序列里。
但当插入测序列过短时，测序反应会超过待测序列而测到3’-端的接头序列，从而造成接头序列的污染。
当reads中有接头序列，会导致比对错误和非比对的序列书面增加。
所以要清楚接头序列。
3. 测序深度不均一性是测序建库技术操作的问题，还是每个人的个体化差异导致不均一的现象？答：不均一的原因个体DNA和测序应该都有，看不同的情况。
比如我们曾经分析过一个WES, 在一个本应该检测到变异的基因，我们无论如何检测不到。
可视化发现该区域内没有reads。
而查看这段基因序列，发现是100% 的G。
而对测序仪来说，如果G含量超过80%，就很难成功测序。
而如果个体某段DNA含有比较多的SNP，捕获探针就无法很好和DNA杂交，而不能有效的捕获。
4. 测序是否越深越好?NGS属于“深度测序”，可以1次并行对几十万甚至上百万条DNA分子进行序列测定，从而实现每个位点被覆盖几十次甚至上百次。
通过计算测序得到的碱基总量与测序区域大小的比值，可以获得测序的平均深度，是评价测序质量的重要指标之一。
测序深度的增加使得目标区域覆盖的读长增多，获得区域的序列信息更为精确。
然而，测序深度的增加意味着测序成本的提高。
因此，在测序之前需对数据精确度和成本进行综合考虑，根据临床应用需求选择合理的测序深度。
测序深度的选择主要基于以下4个方面的考虑：首先，常规的测序项目采用普遍被接受或推荐的测序深度。
正常组织全基因组测序建议的测序深度为10X～30X。
有研究表明，30X的测序深度可以覆盖80%的全基因组信息，基本满足常规的全基因组测序需求。