最新脂肪干细胞的体外培养专业知识讲座
体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究
【 摘
要 】 目的 通过分离 、 培养脂肪问充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞 ， 为心肌再
胶原酶消化分离成人脂肪来源的问充质 干细胞并进行传代培养 ， 置相差显微 倒
生提供 良好 的干细胞来源。 方法
镜观察细胞形态 ， 流式细胞仪测定 Ｃ ２ 、 Ｄ １Ｃ ３ 、Ｄ ４及细胞周期 ， Ｔ绘制细胞生长 曲线。用第 ３ Ｄ ９ Ｃ ３ 、Ｄ ４Ｃ ４ ＭＩ 代细胞 进行诱导分化 ， 观察不 同浓度 ５ 氮杂胞苷 （－ ｚ ， ， ， ，０ １ ，０Ｉ ｏ Ｌ 及不 同作用 时间（２ ２ ，８ ７ ） 一 ５ Ａ ａ ｌ３ ５ ｌ ，５ ２ ｍ ｌ ） ｘ ／ １ ，４ ４ ，２ｈ 诱 导其向心肌细胞分化的差别 ， 采用最佳浓度 １ ｍ ｌ ， ０Ｉ ｏ Ｌ 最佳作用时间 ２ ￣ ／ ４ｈ进行实验 ， 分别在第 ７ ｌ ， ｌ２ 天用 ，４ ２ ，８ 免疫细胞荧光染色鉴定 心肌 细胞 一 横纹肌 、 肌球蛋 白重链 （ Ｃ 、 ＭＨ ）心肌肌钙蛋 白 Ｉｃ ｎ） （Ｔ Ｉ表达 ， ｌ 第 ４天反转 录一 聚合酶链反应 （ Ｔ Ｐ Ｒ） Ｒ — Ｃ 法检测心肌发育幸关 基因 Ｎ Ｘ ． Ｈ Ｋ ２５的表达 。结果 倒置相差显微镜下观察原代细胞 ， 可 见细胞呈梭型 、 圆形或椭圆形 ， 核 偶见双核 。 传代细胞 核原代细胞形态相似 ， 排列有了一定 的方 向性 。 流式细胞仪 检测结果显示 ， １３ ５ 第 、 、 代细胞均高表达 Ｃ ２ Ｄ ９和 Ｃ ４ ； Ｃ ３ 始终 表达很 弱 ， Ｄ４ 而 Ｄ １ 可认为呈阴性表达 ； Ｄ ４在第 Ｃ ３ １３ 、 代细胞弱表达 ， 在第 ５代细胞表达逐 渐减 弱为阴性 。细胞生长 曲线显示前 ３ｄ处于细胞潜 伏状 态 ， ４天进 第
ｓ ｕｒ ｆｓｅ ｃ ｌｓ ｆｒｍｙ ｅ ｒ ａ ｅ ｅ ｅ ａ ｉｎ Ｍ ｅｈｏｄｓ ｏ ｃｅｏ ｔｍ ｅ ｌ ｏ ａ ｄｉｌｒ ｇ ｎ ｒ ｔｏ ． ｏ ｔ ＡＤＭ Ｓ ｒ ｓ ｌｔ ｔ ｏｌｇ ｎａ ｅ ｄ ｇ ｓｉｎ ａ ｕ — Ｃｓ ｗｅ ｅ ｉｏａｅｄ ｗｉｈ ｃ ｌ ｅ ｓ ｉ ｅ ｔｏ ｎｄ ｃ ｌ ａ
脂肪干细胞
脂肪 Zuk, 2001, 2002；Sen, 2001；Von Heimburg D, 2001
神经 Safford, 2004；Ashjian, 2003；Rchman, 2004；杨立业, 2003, 2004
多向分化潜能
脂肪间充质干细胞向不同细胞分化是在特异性 诱导因子作用下进行的。
下面介绍常用的一些多向诱导分化因子及诱导 后的细胞特性。
脂肪间充质干细胞
Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells
汇报提纲
一. 研究背景 二. 脂肪干细胞优点及表面标记 三. 多向分化潜能 四. 猪脂肪干细胞分离培养、诱导分化及其建系 五. 应用前景及待解决的问题
一、研究背景
动物体内，脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和 赋形组织，还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细 胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致 肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此，脂肪细胞分化 的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之 一。
脂肪间充质 干细胞优点
最后，从经济和社会效益看，从脂肪组织中获 取干细胞可将原本认为是废弃物的脂肪，如临床上 脂肪抽吸术后的脂肪组织及动物屠宰后不可实用的 内脏脂肪等变为干细胞库的重要来源，具有极大的 经济与社会效益。
表面标记
关于脂肪间充质干细胞标志，目前尚无统一标 准。一般认为，脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干 细胞均表达CD44、CD105、STRO-1、CD166及 CD117。其中CD117是一种干细胞因子受体，在全 能或多能干细胞中表达，包括胚胎干细胞。
成肌诱导后的形态学观察
A
B
C
D
成肌诱导
成肌诱导第7天出现细胞球形变化(A)，诱导第14天开始出现接 触、融合。部分出现伪足，形态变长(B)，诱导第21天周围梭形细 胞明显减少，形成巨大的球形细胞(C,D)。上图为茜素红染色。
体外诱导脂肪干细胞向内皮细胞及成血管的分化
Ａ ｂｓｔ ｒ ａｃ ｔ
体外诱导脂肪干细胞向内皮细胞及成血管的分化☆
马 丽’ ，黄鲁 刚’ ，林 毕
１四川 大学 华 西医 院小 儿外科 ， 四川省 戍都 市 ６ １ ０ ０ ４ １ ２四川 大 学华 西 医院老年 医学 研 究室 ，四川 省成 都市 ６ １ ０ ０ ４ １
文革 旯 点 ：
实验 结果 表 明，脂肪 干细 胞培养 传代 有 其优越 性 ，能定 向分化 为 内皮细 胞并 成血 管 ，参 与缺 ｍ组织 血运
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． ２ ０ ９ ５ — ４ ３ ４ ４ ． ２ ０１ ３ ． １ ０ ０ ０ ４ 印： ／ ／ ｗ ｗｗ ｃ ＃ ｅ ￣ ｏ ｒ ｇ ］ 屿诵．黄鲁ｌ ： 《 ｆ ｊ 槌苹 ｛ 奉 申 ｝ 诱导 肪ｆ维匏 向内受绝匏及戒血管的分｛ 七 １ ｛ ． 国组织 Ｉ程研竞 ．２ ０ １ ３ ． ７ （ １ ０ ） ： １ ７ ３ ０ 一 、 ７ ３ ５
中 组织工ｆ 究
‘ ７ ７誊 ７ ０
２ ０ １ ３—０ ３—０ ５｝ Ｈ 版
～ ｃ 一 。
Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕｒ ｎ ａｌ ｏ ｆＴ ｉ ｓ ｓ ｕ ｅ Ｅｎ ｇ ｉ ｎｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｍａ ｒ ｃ ｈ ５ ．２ ０ １ ３ Ｖ ｏ １ ． １ ７． Ｎｏ． １ ０
导 细胞 行免 疫组 织化 学检 查 ＣＤ ３ １ 的 表达 。
文献标识码 Ａ 文章编号： ２ ０ ９ ５ ． ４ ３ ４ ４
（ ２ ０ １ ３ ） １ ０ — ０ １ ７ ３ ０ — ０ ６
结果 与结 论 ：免 疫组 织化 学检 测脂 肪干 细胞 的 ＣＤ ３ １ 表 达 阴性 ，诱 导细胞 Ｃ Ｄ ３ １可 见阳性表 达 。在 三维 立 体培 养摹 内诱导 的细胞 ２ ４ ｈ 逐 渐迁 徙成 团 ，伸出伪 足 ，诱导 １周细 胞形 成网格 样 交叉 ， ２周形成 较 长 血 管 ，后ｍ 管增 粗 ，并 出现分 又 ，Ｃ Ｄ ３ １阳性 表达 。 因此 ，脂肪 干细 胞体 外可 以被 诱导 向内皮 细 胞表 型 转 分 化， 并形 成血 管 ，提 示脂 肪 干细 胞可 以作 为促进 组织 工程 移植物 血 管化 的种 子细 胞 的理 想选 择 。
体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化
摘 要 目的 ： 外 分 离 培 养 成 人脂 肪 组 织 来 源 的 间 充 质 干 细 胞 ， 索 其 基 本 生 体 探 物 学 特 性 及 向心 肌 细 胞 诱 导 分 化 的 潜 能 ，为 心 肌 再 生 提 供 理 想 的 自体 干 细 胞 来 源 方 法 ： 验 于 ２０ — １ １ 实 ０ ５ ０ ／ ２在解 放 军 兰 州 军 区 兰 州 总 医 院 医 学 实 验 中心 完 成 取 本 院 微 创 外 科 中心 一 急 性 单 纯 性 阑 尾 炎患 者 大 网 膜 脂 肪 组 织
细胞周期及 Ｃ ４ Ｃ ３ Ｄ ４、Ｄ ４的 表 达 ， 第 ４代 细 胞 用 ５ 氮 胞 苷 诱 导 使 其 向 一 心肌细胞分化 ， 免疫 细 胞化 学 鉴定 心 肌 样 细 胞 。 结 果 ： 分 离 培 养 的 脂 肪 间 充 质 干 细 胞 经 传 代 纯 化 后 细胞 形 态 呈 均 一 显 ， 染 色 质 多 ， 染 电 核 核 常 异
・
基础 研 究 ・
体外培养成人脂肪问充质干细胞生物学特性及向心肌样细胞的诱导分化☆
张 卫 泽 ， 陈跃 武 ， 永 清 ， Ｊ琴 ， 陈 哈Ｊ＼ 马 凌 －秦 ， 勉 ， 志 斌 ｚ 洪
１ —７ ｈｎ ｌ ４ ｛ ｉａ Ｃ
解 放 军 兰州 军 区 兰 州 总 医 院Ｇ 内科 ，甘 肃 省 兰州 市 ７ ｏ ５ ；兰 州 大 ３ ０ ０ 学 临床 医 学院 ， 肃 省 兰 州 市 ７ ０ ０ ；解 放 军 兰州 军 区 兰 州 总 医院 医 甘 ３ ０ ０ 学 实验 中， ， 肃 省 兰 州 市 ７ ０ ５ 甘 ３００ 张 卫 泽 ☆ ， ，９ ５年 生 ， 肃 省和 政 县 人 ， 族 ，ｏ ２年 中 国 协 和 医 科 男 １６ 甘 汉 ２０ 大 学毕 业 ， 士 ， 任 医师 ， 博 主 主要 从 事心 血 管 内科 临 床 与 基 础 研 究
脂肪干细胞的体外培养PPT讲稿
脂肪干细胞成脂分化
ASC在特定促进因素下可分化为脂肪细胞，长期培养仍可维持此种分化能力。 脂肪细胞分化过程大致如下：
（1）脂肪干细胞向脂肪细胞定向分化，形成脂肪母细胞（一种尚未出现脂滴的 梭形细胞）；（2）脂肪母细胞经过生长抑制、克隆性增殖，形成前体脂肪细胞 （此时细胞刚开始出现脂滴）；（3）前体脂肪细胞经过生长抑制、克隆性增殖 和一系列基因表达的变化，形成不成熟脂肪细胞或多室脂肪细胞（内含大量小脂 滴）；（4）多室脂肪细胞随着脂肪在细胞中的沉积，小脂滴逐渐汇集成一个大 脂滴充满脂肪细胞的大部分，形成成熟脂肪细胞或单室脂肪细胞，成为成熟的脂 肪细胞。
Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细
胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以及来自间 叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细胞在ASC中的 含量甚低，不可能定向培养分化为其他组织细胞，但进一步确认和识别真正的 ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检
测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用，但鉴定脂肪干细胞的最好 方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功。
脂肪干细胞的表面标记
a)粘附分子：ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和 α4(CD49 d)；细胞间粘附分子1(ICAM 1，CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞 粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表 达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3，CD50)、整合 素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E selectin，CD62)； b)分子受体：可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体； c)细胞外基质蛋白和糖蛋白：ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin、 Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)； d)肌蛋白：能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记：不表达 造血细胞标志物CD14、CD31或CD45； f)补体调节蛋白：确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白； g)组织相容性抗原：表达类组织相容性蛋白HLA-ABC，而不表达类蛋白HLA-DR。
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识
脂肪组织来源的干细胞提取、制备及储存质量管理专家共识脂肪组织来源的干细胞(adipose tissue-derived stromal/stem cells，ASCs)是从脂肪组织中分离提取得到的，具有取材容易、对机体损伤小、体内储备量大、体外可大规模培养、可多向分化等优点。
ASCs在人体修复重建、免疫调节及组织再生等方面的应用成为近年来干细胞研究的重要内容，也是组织工程及再生医学的研究热点。
大量研究表明，自体脂肪组织移植到软组织缺损部位后，其中40%~60%会被吸收，自体脂肪组织结合ASCs移植，能明显减少自体脂肪组织移植的吸收、液化、坏死及纤维化等情况发生，有利于构建具有生物学结构和功能的脂肪组织。
同时，利用脂肪组织可以进行大规模的ASCs提取、制备、储存，为再生医学提供种子细胞。
目前，国内外尚缺乏ASCs提取、分离、制备及储存的标准和质量管理规范，导致各制备机构或研究应用机构之间无法进行统一评估和交流，严重制约了ASCs在皮肤软组织修复重建等相关领域的发展。
为了建立安全、规范、稳定、可追溯的行业共识、指南及标准，从源头保证ASCs的提取、制备、储存的高质性和安全性，中国医药生物技术协会皮肤软组织修复与重建技术分会联合从事细胞制备和存储、皮肤软组织修复重建、分子生物学及整形和美容外科等多学科的专家，参照中国医药生物技术协会《细胞库质量管理规范》及《干细胞制剂制备质量管理自律规范》，组织起草脂肪组织采集及ASCs制备、检测、储存的标准和质量管理专家共识，旨在促进ASCs在皮肤软组织修复重建技术等领域研究成果的转化，进一步促进多学科的交流和发展。
1 脂肪组织采集1.1 脂肪组织采集机构要求脂肪组织的采集工作应在取得《医疗机构执业许可证》的医疗机构中实施。
采集人员应持医师或者护士执业证书，经过相应的专业技术培训。
采集机构应具有完整的标准化操作规程(standard operation procedure，SOP)，并备有采集过程中的应急预案。
脂肪干细胞培养方法 组织块培养法
脂肪干细胞是一种多能干细胞，存在于脂肪组织中，具有较强的自我更新和分化能力，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。
脂肪干细胞的培养方法是进行研究和应用的基础，其中组织块培养法是一种常用的培养方法，其流程和步骤需要严谨操作和控制，以获得高质量的脂肪干细胞。
一、脂肪组织的获得脂肪干细胞的来源是脂肪组织，脂肪组织的获得需要经过以下步骤：1. 临床患者手术采集：通过手术方式从患者身体的特定位置（如腹部、臀部等）采集脂肪组织。
2. 动物实验材料采集：通过特定的实验动物模型，在实验室条件下从动物体内获取脂肪组织。
脂肪组织的来源直接关系到后续脂肪干细胞的培养和应用性能，因此需要严格控制采集过程和条件，确保获得的脂肪组织质量和干细胞丰度。
二、脂肪组织处理和组织块制备1. 脂肪组织的去除杂质：将采集的脂肪组织在无菌条件下进行处理，去除多余的结缔组织、血管和表皮层，以获得纯净的脂肪组织。
2. 组织块的制备：将经过处理的脂肪组织切割成适当大小的块状（约1mm³），以便后续细胞的释放和培养。
三、脂肪干细胞的释放和培养1. 组织块的酶解：将制备好的组织块放入消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，在37℃的恒温培养箱内进行酶解，使脂肪干细胞从组织块中释放出来。
2. 细胞的培养和传代：将释放出的脂肪干细胞进行原代培养和传代培养，培养基的配方和培养条件需要进行严格控制和优化，以保证脂肪干细胞的生长和分化。
通过以上步骤和方法，我们可以获得高质量的脂肪干细胞，为其后续在再生医学、组织工程和临床治疗中的应用打下坚实基础。
在实际应用中，还需要结合特定的研究和临床需求，对脂肪干细胞进行进一步的分化和功能评价，以实现其在不同领域的应用和开发。
脂肪干细胞的培养方法对于再生医学和组织工程具有重要意义，通过持续的研究和优化，必将为人类健康事业带来更多的机遇和挑战。
希望本文对脂肪干细胞组织块培养方法的介绍，能够为相关研究和应用人员提供一定的参考和指导，共同推动脂肪干细胞领域的进步与发展。
人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化
人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【摘要】目的:建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性.初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制.方法:剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15％Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养.行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能.通过RT-PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2 (peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和骨桥蛋白mRNA表达情况.结果:通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞.MTT法显示细胞增殖能力强.流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA-DR 低表达.细胞免疫荧光结果与之相符.hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能.在成骨分化过程中同时伴有成脂发生.RT-PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ-2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ-2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论:建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法.获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征.hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用.%Objective:To establish the isolation and culture method of human adipose-derived mesenchymal stem cells (hADSCs) derived from human adipose in vitro,so as to explore their morphology,identify cell surface markers,observe biological properties,and discuss the possible causes and mechanism ofthe phenomenon of hADSCs' osteogenic differentiation accompanying with synthesis of triglycerides.Methods:Human adipose tissue were obtained from abdominal operation.The hADSCs were isolated from human adipose tissue by 0.15％ collagenase digesting.The cells were applied to do the experiments:MTT method,flowcytometry,immunofluorescence.Its differentiation potential was proved by osteogenic and adipogenic differentiation.The osteogenic and adipogenic related genes:PPARγ-2,osteopontin expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR technique.Results:After isolation and culture,we obtained a large amount of hADSCs,which grew like swirls.MTT revealed high capability for and proliferation.The flow cytometry showed CD29 +,CD31-,CD34-,CD45-,CD73 +,CD105 +,CD166 +,HLA-DR-,which fit the results of immuno fluorescence.Moreover,these cells could be functionally induced into adipocytes and osteoblasts in the presence of appropriate conditioned media.During osteogenic differentiation,we found it accompanying with the synthesis of triglycerides.RT-PCR results proved that during the differention process,osteogenic and adipogenic related genes began to be expressed gradually,which had statistically significant(P ＜0.01).Conclusion:Highly efficient isolation and cultivation methods for hADSCs have been developed.They are a kind of mesenchymal cells with great application prospect,which characterized with adherent growth,high proliferation,stem cell phenotype and multipotent differentiation.During vitro osteogenic differentiation,the triglyceride formation has a certain role in promoting osteogenesis.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(023)003【总页数】6页(P185-190)【关键词】人脂肪间充质干细胞;鉴定;成骨分化;成脂分化【作者】闵敏;张雪静;马红;许辉;李遇梅【作者单位】江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;镇江市第二人民医院皮肤科,江苏镇江212002;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院皮肤科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R329.2对于间充质干细胞的研究，最初的对象是骨髓间充质干细胞，并且已经形成了成熟的分离培养方法［1］。
大鼠脂肪干细胞体外定向诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的研究
１ ． ２ 实 验方 法
文献标识码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０—１ ４ ９ ２ （ ２ ０ ０ ７ ） ０ ５— ０ ５ ０ １ 一ｏ ４
过去 ， 人们 把 脂 肪仅 仅 看 作 是 氧 化供 能 和储 存
能量 的组 织 。２ ０ ０ １年 以 来 ， Ｚ ｕ ｋ ｅ ｔ ａ ｌ … 先 后 从 脂 肪
组织 中分离得 到一种 具有多分化潜能 的成体干细
胞， 即脂 肪 干细 胞 （ ａ ｄ ｉ ｐ ｏ ｓ ｅ — ｄ ｅ ｒ ｉ ｖ ｅ ｄ ｓ ｔ ｒ ｏ ｍ ｌ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， Ａ Ｄ —
Ｓ Ｃ ｓ ） ， 是 目前 成 体 干 细 胞 研 究 热 点 。 通 过 对 大 鼠 Ａ Ｄ Ｓ Ｃ ｓ的分 离 、 培养和体外诱导 ， 了解 其 基 本 的 生 物 学特 性及 定 向分化 潜 能 ， 探 讨 其 作 为 组 织 工 程 种
融合 ， ０ ． ２ ５ ％胰 蛋 白酶消化 ， 传代。第 ３代细胞用
于诱 导分化 及免 疫 细胞化 学 鉴定 。
宇， 男， 博士 ， 教授 ， 副主任医师 ， 硕士生导师 ， 责任 作
者， Ｅ — ｍ ａ ｉ ｌ ：ｚ ｈ ａ ｏ ｙ ｕ ｚ ｊ ＠ｙ ａ ｈ ｏ ｏ ． ｃ ｏ ｍ． ｃ ｎ ； 何金生 ， 男， 博士 ， 教授 ， 硕士生导师 ， 责任作者
１ ． ２ ． １ Ａ Ｄ Ｓ Ｃ ｓ 的分 离和培养 水合氯醛 麻醉 Ｓ Ｄ 大鼠， 无 菌条件 下 取 出腹 股 沟 处 脂 肪 。尽 量 剔 除血
管， Ｐ Ｂ Ｓ缓 冲液 冲洗 ， 剪碎 ， ３ ７ ｏ Ｃ， ０ ． ０ ７ ５ ％ Ｉ型胶 原 酶振 荡 消 化 ３ ０ ｍｉ ｎ ， 加人等体 积含 １ ０ ％Ｆ Ｂ Ｓ的 Ｄ ＭＥ Ｍ 培养 液 中和胶 原酶 ， １ ５ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ离 心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 弃 去上 清和 脂肪 组织 。０ ． １ ６ ｍ ｏ ｌ ｆ Ｌ Ｎ Ｈ Ｃ １ 裂 解红 细 胞， 离心 弃 上清 。２ ０ ０ 目筛 网过 滤 后离心 ， 用含 １ ０ ％ Ｆ Ｂ Ｓ的 Ｄ ＭＥ Ｍ培 养液 重 悬 细胞 ， 接种 至 培 养 瓶 。１ ２ ｈ后 换液 ， 用Ｐ Ｂ Ｓ缓 冲液 冲洗 ， 去 除未 贴壁 细 胞 。随
《人脂肪干细胞(ADSCs)的分离培养及多向分化潜能研究》范文
《人脂肪干细胞（ADSCs）的分离培养及多向分化潜能研究》篇一一、引言人脂肪干细胞（ADSCs）作为一种重要的细胞资源，近年来在医学和生物学领域中引起了广泛关注。
这种细胞类型不仅在临床医学上被广泛应用于治疗各种疾病，同时在科学研究领域，它的多向分化潜能及生物机制也是备受瞩目的研究方向。
本文就人脂肪干细胞的分离培养方法和多向分化潜能的研究进行了系统性的探讨。
二、人脂肪干细胞的分离培养1. 分离方法人脂肪干细胞的分离主要依赖于酶解法。
首先，从供体脂肪组织中获取足够的细胞，通过使用含有特定酶的溶液（如胶原酶）来分解脂肪组织，使ADSCs得以释放。
随后，通过离心和筛选过程，获取纯度较高的ADSCs。
2. 培养方法ADSCs的体外培养通常使用含有生长因子和营养物质的特殊培养基。
这些培养基提供了细胞生长所需的营养和环境条件。
在培养过程中，应定期更换培养基，以确保细胞持续得到所需的营养供给。
同时，也需要关注细胞的生长状况和活力。
三、多向分化潜能研究1. 分化为成骨细胞ADSCs具有分化为成骨细胞的能力，这一过程可以通过添加适当的诱导剂和调节生长因子来实现。
在分化过程中，可以通过观察细胞的形态变化和特定基因的表达情况来评估其分化的程度和效果。
2. 分化为成脂细胞ADSCs还可以分化为成脂细胞，这一过程可以通过调整培养基中的营养成分和生长因子来实现。
成脂细胞的分化可以通过观察细胞的脂滴形成和特定基因的表达情况来评估。
3. 分化为神经细胞除了成骨细胞和成脂细胞外，ADSCs还具有向神经细胞分化的潜能。
这一过程可以通过特定的诱导剂和培养条件来实现。
对分化后的神经细胞进行功能测试和基因表达分析，可以评估其分化的效果和潜能。
四、结论通过对人脂肪干细胞的分离培养和多向分化潜能的研究，我们可以更好地了解这种细胞的特性和功能。
ADSCs的分离培养方法已经相对成熟，使得我们可以获取大量的细胞进行后续研究。
同时，ADSCs的多向分化潜能也为临床治疗提供了新的可能性和思路。
人脂肪干细胞的分离培养及鉴定
。
．
图 ３ 脂 肪 干 细胞 的表 型 特 征
被 称 为 Ａ Ｓ ｓ的 细 胞 ， 具 有 一 般 干 细 ＤＣ 它 胞 的 特性 ， 骨 髓 干 细 胞 相 比 ， 具 有 明 与 它 显优 势 ， 来 源 、 材 、 增 能 力 方 面 ， 在 取 扩 都
是骨 髓 干 细 胞 所 无 法 比拟 的 ， 可作 为 种 子
到第 １ ４天 时 可 见 细 胞 铺 满 瓶 底 ８ ％ 左 ０
右 。 而传 代 细 胞 生 长 速 度 明 显 快 于 原 代
陶凯 等 通 过 不 同 血 清 浓 度 作 用 下 生 长 曲线 绘 制 发 现 ， 血 清 浓 度 为 １％ 在 ５ 和 ２ ％ 时 ， 最 短 时 间 内 细 胞 可 进 入 平 ０ 在 台期 ， 到 细 胞 增 殖 高 峰 期 ， 合 考 虑 性 达 综 价 因 素 ， 际 应 用 中 可 将 １％ 作 为 血 清 实 ５ 的最 适 宜 浓 度 。通 过 两代 生 长 曲线 发 现 ， 第 ２代 细 胞 较 原 代 细 胞 更 快 进 入 增 殖 高
摘
要 目的 ： 索从 健 康 成人 脂肪 组 织 探 中分 离 、 养 并 鉴 定 脂 肪 千 细胞 。 方 法 ： 培
用健 康 成 人 的 脂肪 组 织 ， 除 可 见 纤 维结 剔
１ ， 次 当贴 壁细 胞接 近融 合时再 次传 代。
光学 显 微 镜 下 观察 细胞 生 长 及 形 态 。 流 式 细 胞 仪检 测 相 关 抗 原 ： 流式 细 胞 仪对 第 ３代 脂 肪 干 细 胞 表 面 相 对 特 异 性
２ 王红祥 ， 李宾公 ， 邵诗颖 ， 人脂肪组 织分 等． 离培养基 质 干细胞 的方 法及 其 表型 鉴定 ［ ］ 中国临床康复，０ ６，０ ４ ） １ Ｊ． ２０ １ （ １ ：６—１ ． ８
6、脂肪干细胞知识
脂肪干细胞知识什么是脂肪干细胞（ADSC）？脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells, ADSCs）是一种存在于脂肪组织中的间充质干细胞，在皮下白色脂肪组织中约占细胞总量的10%-20%，具有一般干细胞的特点，即自我更新和多向分化潜能；这种细胞群易于分离，与骨髓间充质干细胞（BMSCs）一样在特定条件下可分化为骨、软骨、心肌等；可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术获得，在体外培养可稳定扩增，不易衰老，免疫荧光及流式细胞仪检测显示这种多能干细胞大多数来源于中胚层。
ADSCs作为间充质干细胞，其可以向内、中、外胚层细胞分化，在不同的诱导条件下ADSCs的分化方向不同，同时来源于中胚层的成骨细胞和脂肪细胞之间可能存在着某种联系。
通过研究ADSCs成脂成骨分化的影响因素，可能会找到治疗肥胖的新靶点以及骨组织工程学的新思路。
已有研究证实，从脂肪组织中分离的一小部分组织特异性干细胞有能力分化成各种细胞谱系，这种细胞基质来源的祖细胞已被定义为''脂肪来源干细胞''（ASCs），预计会成为一种极有价值的用途广泛的细胞疗法。
脂肪组织不仅包含脂肪干细胞，还含有多能干细胞，可以分化为脂肪，骨，软骨，以及其他类型的组织。
之前我们发现，使用传统抽脂机，脂肪组织中的干细胞在抽脂和移植过程中大量流失，ASCs 的不足可能导致了脂肪组织生存率下降，移植后期组织萎缩。
因此，在自体脂肪干细胞辅助移植法中，我们提取富含ASCs的新鲜SVF补充入移植脂肪组织。
为最大限度地发挥ASCs的生理活性并避免意外，我们认为，重要的是确保所补充的ASCs与脂肪组织或结缔组织紧密黏合。
有了这种新型疗法，ASCs可发挥四个主要作用，部分已被临床前研究证实。
首先，ASCs可以分化成脂肪细胞和促进脂肪组织再生。
其次，ASCs能够分化成血管内皮细胞，也可能进入血管壁细胞，促进血管生成和提高移植物存活率。
第三，ASCs众所周知可释放对抗缺氧和其他不利条件的血管内皮生长因子，而这些因子可影响周围宿主组织。
脂肪组织来源的干细胞体外培养随机恶性转化
Ｎｅ ｕ ｒ ｏ ｓ ｕ ｒ ｇ ｅ ｒ ｙ ， Ｃｈ ａ ｏ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｃｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｌ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ， Ｃｈ ａ ｏ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ ２ １ ０ ２ １ ， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
Ｐ Ｃ ＮＡ、Ｋｉ ６ ７和 ＶＥ Ｇ Ｆ — Ｃ ， 不表达 ｐ ｌ ６ ； 染色体分析证 明为非整倍体 ， 有广泛 的易位 ； 透射 电镜 下可见细胞
表面微绒毛结构 ； 细胞 在软琼脂 中没有克隆形成能力 ； 裸 鼠皮下移植能够形成肿瘤组 织 ， 肿瘤组织的主体
成 分 为 肉瘤 。 结论 肉瘤。 脂 肪 组 织 来 源 的 干细 胞 在 体 外 长 期 培 养能 够 发 生 恶 性 转 化 ， 裸 鼠皮 下 移 植 能 够 形 成
刘 桂 英 杨 立 业 ’ ” 李 文 玉 郑 佳坤 陈辉 陈 强
【 摘
要】 目的
研 究脂肪来源干 细胞在体外能 否恶性转 化。 方法
从小 鼠脂肪组织培养 出脂肪
组 织来源干细胞 （ Ａ ＤＳ Ｃ ｓ ） ， 观察 细胞 是否发生恶性 转化 ， 应用免疫细胞化学方法检测转化 细胞 的相关标
Ｌ Ｉ Ｕ Ｇｕ ｉ ｙ ｉ ｎ ｇ ， Ｙ ＡＮＧ Ｌ ｉ ｙ ｅ ， ”
Ｌ Ｉ Ｗｅ ｎ ｙ ｕ ， Ｚ Ｈ Ｅ ＮＧ Ｊ ｉ ａ ｋ ｕ ｎ ， Ｃ Ｈ Ｅ Ｎ Ｈｕ ｉ ， Ｃ Ｈ Ｅ Ｎ Ｑｉ ａ ｎ ｇ （ １ ． Ｄｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｓ ｔ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｏ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｌ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ， Ｃ ｈ ａ ｏ ｚ ｈ ｏ ｕ ５ ２ １ ０ ２ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ
人脂肪干细胞的培养及鉴定
人脂肪干细胞的培养及鉴定尚志刚;郭琼;李甜;白生宾;钟近洁;秦纹;冯树梅【摘要】Objective To establish an effective method on isolating and identifying Human adipose stem cells(hADSCs). Methods Collagenase digestion was adopted to isolate stem cells from human adipose tissue.These isolated cells were subcultured and passaged in vitro,the morphology and cell growth curve were characterized subsequently.Moreover,flow cytometry and multi-lineage differentia⁃tion ability were identified. Results The obtained cells with spindle-shape were adherent monolayer cells,and were arranged in whirlpool or radiation.The cell growth curve was a typical“S”shape ,indi⁃cating a 26h of doubling generation time.These cells are positive for CD29,CD105,CD44,negative for CD45 showed by Flow cytometry.The positive results of oil red and alizarin red staining also indicated that the obtained cells were pluripotent. Conclusion HADSCs could be obtained from human abode⁃men adipose tissue through a series of isolation and identified methods.%目的：探讨人脂肪干细胞的分离、培养并鉴定。
脂肪干细胞
脂肪干细胞第一节脂肪干细胞的生物特性2001年，Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分理处一种多向分化干细胞，因其与骨髓间充质干细胞（BMSC）形态相似而称为脂肪间充质干细胞（ASC）。
此后几个研究小组也先后采用相似的分离方法分别从脂肪组织中分离得到ASCE。
近年来许多研究表明，脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经等多种细胞方向分化的多分化潜能，是一种理想的种子细胞。
因脂肪干细胞具有分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不衰老等特点，目前脂肪干细胞已经成为脂肪组织工程中组织细胞的研究热点。
1. 脂肪干细胞的分离、培养脂肪干细胞在脂肪组织中含量很低，要利用脂肪干细胞就必须进行体外分离培养扩增。
常用的方法是将剪碎的脂肪组织消化离心，倾去上层脂肪及上清，获得基质血管层，将其收集到培养瓶中培养，除去未贴壁的红细胞和残渣，剩余的细胞群体称为加工过的脂肪吸取物。
原代培养的细胞中贴壁的细胞较少，细胞生长至融合后传代，传代后的细胞称为脂肪干细胞。
平均每300mL脂肪组织可获得2×10~6×10个这样的细胞。
体外培养条件下，ASC的培养不像BMSC对培养基中胎牛血清的来源和质量有严格要求，DMEM、aMEN、RPMI1640是ASC 的常用培养基。
一般只添加体积分数为10%的胎牛血清，并且血清无生产批号限制。
在传代培养中，平均倍增时间为60h。
并表现低水平衰老，1代时细胞没有出现衰老现象，10代时少于5%细胞出现衰老，15代时衰老细胞比例仍低于15%，这表明脂肪ASC体外扩增能力很强，传代培养易于获得大量有分化能力的细胞。
2.脂肪干细胞的鉴定Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。
但部分学者采用流式细胞仪和间接免疫荧光等方法，分别以因子Ⅷ、平滑肌蛋白、ASC的特异单克隆抗体鉴定ASC中是否存在内皮细胞、平滑肌细胞以及成纤维细胞，结果发现前两种单克隆抗体抗阳性染色的细胞比例较少，绝大多数ASC单克隆抗体阳性染色的细胞，提示ASC主要由成纤维细胞以及来自间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。
人来源脂肪干细胞的培养
人来源脂肪干细胞的培养1．脂肪干细胞原代培养1)取约500mg脂肪组织（自外科手术患者的皮下获取），再将脂肪组织一次挤压进入准备好的15ml离心管中，每个离心管中的组织不超过5ml。
2)吸取缓冲液PBS 7ml加入到上述装有组织的离心管中，用吸管吹打10~20次，然后静置1min左右，用吸管将组织下层的液体吸出。
如此反复直到所吸出的液体呈透明状，不带有血细胞为止；3)向有脂肪组织的试管中加入与组织量相同大约5ml左右的消化液（胰酶0.25%，I型胶原酶0.1%，以1：1比例混合配制而成），将试管密封，放入37°C恒温摇床中，190r/min，震荡消化30min。
此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的液体；4)吸出离心管中的下层液体移入含完全培养基（含10%胎牛血清的高糖DMEM）的新离心管中终止消化，然后将离心管封闭，1500rpm离心10min；5)用吸管吸取上清后去掉，加入1ml 培养基，轻轻吹打10~20次制成细胞悬液，将各个离心管中的细胞悬液收集起来，接种待用；6)在剩余脂肪中加入新的胰酶和胶原酶，重复以上步骤继续消化，重复2-3次，将收集到的有核细胞按照一定的密度接种到培养瓶中，放入37°C、5% CO2培养箱培养；7)第一次换液：大约12-24小时后，观察细胞贴壁即可进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。
2. 脂肪干细胞传代培养1)在超净工作台内吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗2-3次，之后加入1-2mL消化液（0.25%胰酶和0.04% EDTA(v/v 1:1)）；2)培养箱内进行消化（3-5min），倒置显微镜下观察贴壁细胞形态变化，当贴壁的脂肪干细胞胞质回缩，细胞间隙不断增大，细胞呈近球形同时有少量圆形细胞脱壁时，加入等体积的培养基终止消化；3)用吸管反复有序轻轻吹打瓶壁上的细胞（动作要轻柔，注意不要产生气泡），使细胞脱离瓶壁后呈单细胞悬液；4)将单细胞悬液移至离心管中，离心，(1000rpm,5min)，弃上清，加入完全培养基，轻吹使之松散，按1:2传代培养；5)显微镜下逐日观察传代培养的细胞，待贴壁细胞达到90% 以上融合时，再进行传代，如此反复。
脂肪细胞培养方法
脂肪细胞培养方法
脂肪细胞培养方法是脂肪生物学研究中常用的一种技术，其目的是在体外培养脂肪细胞，用于研究脂肪细胞的生理功能、疾病发生机制以及药物筛选等方面。
以下是脂肪细胞培养方法的一般步骤：
1. 预处理：将脂肪组织从体内取出，经过清洗、离心等处理，制成脂肪组织细胞悬浮液。
2. 细胞分离：使用酶消化法或机械剪切法将脂肪组织细胞从脂肪组织中分离出来。
3. 细胞培养：将分离出的脂肪细胞接种到培养皿中，加入含有生长因子、抗生素等营养成分的培养基，进行细胞培养。
4. 细胞鉴定：使用显微镜观察细胞形态，使用细胞计数法、流式细胞术等方法对细胞进行鉴定。
5. 细胞功能研究：对培养的脂肪细胞进行功能实验，如脂质代谢、细胞增殖、细胞分化等。
6. 细胞保存：将培养好的脂肪细胞冻存于液氮中，以备后续实验使用。
需要注意的是，脂肪细胞培养过程中可能会出现细胞死亡、细胞污染等问题，因此需要严格控制实验条件和操作步骤，以保证细胞培养的效率和质量。
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脂肪干细胞生物学特性
2001年，Zuk等首次从人抽脂术抽取的脂肪组织中分离出一种多向分化干 细胞，因其与骨髓间充质干细胞(BMSC)形态相似而称为脂肪间充质干细胞 （ASC）。
脂肪干细胞具有向脂肪、骨、软骨、肌肉、内皮、造血、肝、胰岛和神经 等多种细胞方向分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。因脂肪干细胞 具有分化为脂肪的潜能，且其具有易获得性、可迅速扩增、不易衰老等特 点，目前脂肪干细胞已成为脂肪组织工程中种子细胞的研究热点。
a)粘附分子：ADAS细胞始终表达tetraspan蛋白(CD9)、整合素β1(CD29)和 α4(CD49 d)；细胞间粘附分子1(ICAM 1，CD54)、endoglin(cd102)、血管细胞 粘附分子(VCAM，CD106)及活化的淋巴细胞粘附分子(ALCAM，CD166)。但不表 达神经细胞粘附分子(NCAM，CD56)、细胞间粘附分子3(ICAM-3，CD50)、整合 素αb(CD11b)和β2(CD18)及内皮选择蛋白(E selectin，CD62)； b)分子受体：可表达透明质酸盐(CD44)和转铁蛋白(CD71)的受体； c)细胞外基质蛋白和糖蛋白：ADAS细胞能生成Ⅰ和型胶原、骨桥蛋白、ostenectin 、Thy-1(CD90)和MUC-18(CD146)； d)肌蛋白：能表达平滑肌细胞内的肌动蛋白和波形蛋白；e)造血细胞标记：不表达 造血细胞标志物CD14、CD31或CD45； f)补体调节蛋白：确定能表达衰变加速因子(CD55)和补体蛋白； g)组织相容性抗原：表达类组织相容性蛋白HLA-ABC，而不表达类蛋白HLA-DR。
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干细胞（Stem cell，SC）： − 干细胞（Stem cell，SC）是有自我复制、高度增殖和多向化潜能的细胞群 体，这些细胞以通过细胞分裂维持自身细胞的大小，同时又可以进一步分 成为各种不同的组织细胞，从构成机体各种复杂的组织器官。
干细胞技术: − 又称为再生医疗技术，是指通过对干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、 甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、 组织或器官，并最终通过细胞、组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。
干细胞是整个人体生长发育的基础“材料”。
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在缺少分化刺激因子的条件下，ASC表面标志蛋白有HLA-ABC、CD9、CD10、 CD13、CD29、CD34、CD44、CD49、CD54、CD55、CD59、CD105、CD146、 CD166；
经过14d的诱导培养后, ASC虽然发生了形态变化，表现出成脂细胞、成软骨细 胞、成骨细胞等分化的特征，但表面蛋白的表达却大致与未分化前一致，这些 表面蛋白与BMSC的表面蛋白很相似。
ASC和BMSC均表达CD13、CD29、CD44、CD105，均不表达CD31、CD34、 CD45、HLA-DR。虽然从分子标识上看ASC和BMSC具有相同的表面粘附分子 和受体分子，但两者仍有区别。ASC表达CD49d，而不表达CD106，BMSC则 相反，造成这种区别的机制可能与细胞所处的微环境及具体功能有关。
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脂肪来源血管基质成分
(Stromal Vascular Fraction,SVF)
富含大量的CD34+细胞, 从脂肪组织直接获得
脂肪来源干细胞
(Adipose Derived Stem Cell, ADSC)
富含一定量的CD34+细 胞,SVF培养P0-P2
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不同的试验结果结果有不同，但这种技术和流式细胞仪敏感性的不同而造成。总的 来说，PAL细胞的免疫表型与已经报道的骨髓间充质干细胞是相似的。
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间充质干细胞没有特异的表面标志已得到公认。免疫组化染色和流式细胞仪检 测等免疫表型的结果对确认脂肪干细胞有辅助作用，但鉴定脂肪干细胞的最好 方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功。
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Zuk等认为，ASC可能由多种异源性细胞构成，其中包括内皮细胞、成纤 维细胞、平滑肌细胞以及前体脂肪细胞等。现有ASC主要由成纤维细胞以 及来自间叶组织的细胞构成，仅伴有少量内皮细胞与平滑肌细胞。上述细 胞在ASC中的含量甚低，不可能定向培养分化为其他组织细胞，但进一步 确认和识别真正的ASC的表面蛋白及其基因仍是必要的。
脂肪来源间充质干细胞 (Adipose Derived Msenchymal Stem Cell, AD-MSC(ASC))
不富含CD34+细 胞,SVF培养P2之后
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