(完整word版)荧光机理
荧光原理技术介绍
样品处理要求高
对于某些荧光物质，需要进行复杂的样品处理和分离，才能进行检测， 这可能会增加检测的复杂性和时间成本。
05 荧光技术的发展趋势
高灵敏度荧光检测技术
总结词
高灵敏度荧光检测技术是荧光技术的重要发展方向，通过提高检测的灵敏度和特异性， 能够更准确地检测生物分子和细胞活性。
详细描述
荧光生物成像在生命科学研究领域应用广泛，如细胞生物学、神经科学、药理学等，可用于研究细胞 结构、细胞功能、基因表达和蛋白质相互作用等。
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04 荧光技术的优缺点
优点
高灵敏度
选择性
荧光技术具有很高的灵敏度，可以检测到 非常微量的物质，因此在生物医学、环境 监测等领域有广泛应用。
荧光物质可以选择性地与某些物质结合， 从而实现选择性检测，有助于区分不同的 物质。非破坏性Fra bibliotek可视化
荧光检测通常不会对样品造成破坏，可以 用于对样品进行原位检测。
检测。
荧光染料有多种分类方式，如根 据激发波长、发射波长、荧光颜 色等进行分类，以满足不同应用
需求。
荧光蛋白
荧光蛋白是一类具有生物活性的荧光物质，常用于生物标记、示踪和成像等研究领 域。
荧光蛋白具有高亮度、稳定性好、易于基因编码等优点，能够实现活体细胞和组织 的高灵敏度荧光标记。
荧光蛋白有多种类型，如绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）等，可根据 实验需求选择不同波长的荧光蛋白。
总结词
多色荧光成像技术是荧光技术的重要发展方向之一，通过同时检测多种荧光信号，能够实现多参数、多维度的生 物分子和细胞活性分析。
荧光发光原理
荧光发光原理
荧光发光是一种在特定条件下物体发出的可见光。
其原理是通过吸收一定能量的光或电子激发物质的电子，使其处于激发态。
当这些激发态的电子回到基态时，会释放出能量并发出荧光。
这种能量的转变是由于电子能级的跃迁造成的。
具体来说，荧光发光的过程包括激发、发射和退激发三个阶段。
在激发阶段，外部光或电子的能量被吸收，使物质中的一些电子被激发到较高的能级。
在发射阶段，激发态电子回到基态，发射出与吸收的能量相对应的光子。
这些发射的光子具有特定的波长和能量，因此呈现出特定的颜色。
在退激发阶段，光子能量与物质之间的相互作用使电子重新处于基态。
荧光发光的原理与其他光发射现象（如自发辐射、发光二极管）有所不同。
在荧光发光中，物质在被激发后会辐射出较长波长的光，这导致了荧光物质常常呈现出明亮而活泼的颜色。
这也是为什么荧光物质在黑暗中仍然可见的原因。
荧光发光应用广泛，例如在荧光灯、荧光屏幕和荧光染料中都有应用。
通过控制激发物质和发射物质的化学成分及物理结构，可以调节荧光发光的颜色和强度。
这使得荧光技术成为了现代科学、医学和生物学研究中的重要工具。
荧光的发光原理
荧光的发光原理荧光是一种非常特殊的现象，它可以让物体在黑暗中发出柔和的光芒。
这种现象的产生与荧光分子的特殊性质有关，下面我们来详细了解一下荧光的发光原理。
一、荧光分子的特性荧光分子是一类具有特殊能力的分子，它们可以吸收能量并将其转化为电子的激发态。
当荧光分子处于激发态时，它们会变得非常不稳定，因为这些电子会很快失去激发态并返回基态。
在这个过程中，荧光分子会释放出能量并发出光。
荧光分子的这种特殊性质是由它们的电子结构决定的。
荧光分子通常由一个芳香环和一个或多个侧链组成。
这些侧链可以是任何类型的，例如氨基、羧基、硝基等。
芳香环中的电子可以被侧链吸引，形成共轭体系。
这种共轭体系可以允许电子在分子内自由移动，并吸收和释放能量。
二、荧光的激发和发射荧光的发光过程可以分为两个步骤：激发和发射。
激发是指荧光分子吸收外部能量并进入激发态的过程。
这个过程可以通过光、电子或其他形式的能量来实现。
当荧光分子被激发时，它们会进入一个高能态，这个高能态非常不稳定，并且只能短暂存在。
发射是指荧光分子从激发态返回基态并释放出能量的过程。
在这个过程中，荧光分子会放出一个光子，并且返回到一个低能态。
这个光子的能量通常比激发荧光分子所吸收的能量要低，因此荧光是一种低能光。
三、荧光的颜色和强度荧光的颜色和强度取决于荧光分子的结构和环境。
不同的荧光分子吸收和发射的光的波长不同，因此它们会产生不同的颜色。
强度则取决于荧光分子的浓度和光源的强度。
荧光的颜色可以通过改变荧光分子的结构来调节。
例如，可以通过改变侧链的类型和数量来调节荧光分子的颜色。
荧光分子的环境也可以影响荧光的颜色和强度。
例如，荧光分子在不同的溶剂中会有不同的发光行为。
四、应用荧光的发光原理被广泛应用于生物学、化学、材料科学等领域。
在生物学中，荧光被用于标记生物分子，例如蛋白质、DNA和细胞。
这些标记可以用于研究生物分子的结构和功能，以及疾病的诊断和治疗。
在化学中，荧光被用于检测化学反应的进程和结果。
荧光产生的原理
荧光产生的原理
荧光产生的原理是一种物理现象，它是指某些物质在受到紫外线、X射线或电子束等激发后，发出可见光的现象。
荧光产生的原理主要涉及到激发态和基态之间的能量转换，下面将详细介绍荧光产生的原理。
首先，荧光产生的原理与激发态和基态的能级结构有关。
当物质受到外界激发能量后，其内部电子会跃迁到一个较高的能级，形成激发态。
在激发态停留一段时间后，电子会自发跃迁回到基态，释放出能量的同时产生荧光。
这种能级结构决定了物质能够产生荧光的特性。
其次，荧光产生的原理还与荧光物质的种类有关。
不同的荧光物质受到激发后，其激发态和基态的能级结构不同，因此产生的荧光颜色也不同。
例如，荧光染料受到紫外线激发后会发出荧光，而荧光矿物在受到紫外线激发后也会产生荧光，但它们发出的荧光颜色却有所不同，这是由于它们的能级结构不同所致。
另外，荧光产生的原理还与激发光源的波长有关。
不同波长的激发光源会导致不同的荧光效应。
一般来说，荧光物质对于特定波
长的激发光更为敏感，产生的荧光效果也更加明显。
最后，荧光产生的原理还与荧光物质的浓度和环境因素有关。
在一定浓度范围内，荧光物质的荧光强度随着浓度的增加而增加，但当浓度过高时，荧光强度反而会减弱。
此外，温度、溶剂等环境因素也会影响荧光的产生和表现。
总的来说，荧光产生的原理是一种基于能级结构和外界激发的物理现象。
通过对荧光物质的能级结构、激发光源的波长、浓度和环境因素的研究，我们可以更好地理解和利用荧光现象，为科研和生产提供更多的可能性。
荧光产生原理
荧光产生原理
荧光产生原理是指物质在受到激发后，能够发出荧光的过程。
荧光产生原理是由于物质受到外部能量激发后，电子跃迁到激发态，再从激发态返回基态时释放出能量的过程。
下面我们将详细介绍荧
光产生原理的相关知识。
首先，荧光产生的基本过程是激发态的电子从高能级跃迁到低
能级的基态，释放出能量。
这个过程中，激发态的电子会停留一段
时间，称为寿命。
在这个寿命期间，电子会释放出光子，产生荧光。
这种发光的特性是荧光产生原理的核心。
其次，荧光产生的原理与分子结构密切相关。
不同的分子结构
会影响激发态和基态之间的跃迁能级差，从而影响荧光产生的波长
和强度。
一般来说，含有芳香环的化合物更容易产生荧光，因为芳
香环的共轭结构能够降低能级差，促进电子跃迁。
此外，荧光产生还受到溶剂的影响。
溶剂的极性和粘度会影响
分子的振动和旋转，从而影响激发态和基态之间的跃迁速率。
一般
来说，极性溶剂会增加分子的振动和旋转，降低激发态的寿命，加
快荧光发射过程。
最后，荧光产生原理还受到温度的影响。
温度的升高会增加分子的振动和旋转速率，从而影响激发态和基态之间的跃迁速率。
一般来说，温度的升高会减少激发态的寿命，加快荧光发射过程。
总的来说，荧光产生原理是一个复杂的过程，受到多种因素的影响。
通过深入研究荧光产生原理，我们可以更好地理解荧光现象的本质，为荧光材料的设计和应用提供理论基础。
希望本文对荧光产生原理有所帮助，谢谢阅读。
荧光产生机理
荧光产生机理
哎，说起来荧光这玩意儿，简直就是自然界的一大奇观。
你想想看，晚上时分，那些小虫子、宝石啊，甚至有些植物的叶子，都会发出那种绿油油、闪闪烁烁的光。
这光啊，就像是夜空中的星星，神秘又迷人。
其实啊，这荧光的产生，就跟我们人类看电影放烟花似的，关键在于化学反应。
就像是给你放烟花，得有引线、炸药和烟花筒，荧光的产生也有它的“三件宝”——光子、能量和分子。
先说这光子，它是荧光产生的“引线”，负责把能量传递给分子。
分子呢，就像是放烟花时的炸药，储存着能量。
当光子来了，它就跟分子说：“嘿，给你点能量！”于是分子就变得兴奋起来，开始振动、旋转。
这个过程中，分子吸收了光子的能量，变得异常活跃。
但是，分子可不是那么好哄的，它得找个地方发泄一下这股能量。
于是，它就开始释放光子，这个过程就叫作“荧光发射”。
这光子就像是一串串小火花，从分子中迸发出来，形成我们看到的荧光。
不过，这个过程可不像放烟花那么简单。
有时候，分子可能释放的光子太少了，你看不见；有时候，分子释放的光子太多，那就成了白光，不再是荧光了。
这就像放烟花，放的太急了，火药都没烧完，那烟花就灭了。
说到底，荧光这东西，就是分子在能量的推动下，释放光子的过程。
关键是要控制好这个“度”，才能看到那迷人的荧光。
哎呀，你这么一听，是不是觉得荧光的产生还挺有意思的？下次晚上散步的时
候，不妨多留意一下那些发出荧光的小虫子、宝石和植物，它们的“表演”可都是自然界最真实的“光影秀”哦！。
荧光产生的基本原理
荧光产生的基本原理
荧光是一种物质在受到激发后发出的可见光现象。
其基本原理是物质在受到能量激发后，其内部电子跃迁到高能级，再从高能级跃迁回低能级时，会释放出能量，产生荧光现象。
荧光现象的产生需要两个条件：一是有荧光物质，二是有激发能量。
荧光物质可以是天然的，也可以是人工合成的。
激发能量可以是电磁波，也可以是化学反应等。
荧光物质的分子结构对其荧光性质有很大影响。
一般来说，荧光物质的分子结构应该具有共轭体系，即分子中存在多个相邻的双键或三键。
这种结构可以使分子中的电子形成共振，从而增强分子的吸收和发射光谱。
荧光物质的荧光强度和激发光的波长有关。
一般来说，荧光物质的吸收光谱和发射光谱是不同的，即荧光物质在吸收光谱上有吸收峰，而在发射光谱上有发射峰。
荧光物质的荧光强度随着激发光波长的变化而变化，通常在激发光波长和荧光发射光波长相差较大时，荧光强度最大。
荧光现象在生物学、化学、物理等领域都有广泛应用。
例如，在生物学中，荧光染料可以用于细胞和分子的标记和追踪；在化学分析中，荧光分析技术可以用于检测和分析各种化合物；在物理学中，
荧光现象可以用于研究物质的电子结构和光学性质等。
荧光现象是一种重要的物理现象，其产生的基本原理是物质在受到能量激发后，其内部电子跃迁到高能级，再从高能级跃迁回低能级时，会释放出能量，产生荧光现象。
荧光现象在生物学、化学、物理等领域都有广泛应用。
(完整word版)免疫荧光介绍
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。新发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。
荧光产生原理
荧光产生原理荧光产生原理是一种物理现象，它是指某些物质在受到激发后会发出可见光的现象。
荧光产生原理被广泛应用于荧光灯、荧光屏幕、荧光染料等领域，是一种重要的光学现象。
接下来，我们将深入探讨荧光产生的原理及其相关知识。
首先，我们来了解一下荧光产生的基本原理。
荧光产生的基本原理是激发态能级和基态能级之间的跃迁。
当物质受到能量激发后，电子会跃迁到高能级的激发态，随后再跃迁回到低能级的基态，释放出能量的过程中产生可见光。
这种跃迁的能量差决定了荧光产生的波长和颜色。
其次，我们需要了解荧光产生的条件。
荧光产生需要两个基本条件，一是激发源，二是荧光物质。
激发源可以是紫外光、X射线、电子束等能量较高的光源，而荧光物质则是能够进行电子跃迁并产生荧光的物质。
只有在这两个条件齐备的情况下，荧光产生才能发生。
接着，我们来讨论一下荧光产生的应用。
荧光产生原理被广泛应用于荧光灯和荧光屏幕中。
在荧光灯中，电流通过荧光粉时会激发其产生荧光，从而发出白炽光。
而在荧光屏幕中，荧光物质受到电子束激发后会产生荧光，从而显示出图像和文字。
此外，荧光产生原理还被应用于生物荧光成像、荧光染料等领域，为科学研究和生产生活带来了诸多便利。
最后，我们需要了解一下荧光产生的发展趋势。
随着科学技术的不断进步，人们对荧光产生原理的认识也在不断深化。
新型的荧光材料和荧光技术不断涌现，为荧光产生原理的应用拓展了新的领域。
未来，随着人们对荧光产生原理的深入研究，相信荧光技术将会有更广泛的应用和更美好的发展前景。
综上所述，荧光产生原理是一种重要的物理现象，它的基本原理、条件、应用和发展趋势对我们有着重要的意义。
通过深入了解荧光产生原理，我们可以更好地应用和发展荧光技术，为人类的生产生活带来更多的便利和美好。
希望本文对您有所帮助，谢谢阅读！。
荧光产生的机理
荧光产生的机理:（荧光产生对象:可以是原子也可以是分子）光进入某种物质后一部分能量被吸收，光能转移给分子，一部分结构的分子只吸收一定波长的辐射，分子吸收电磁波，从最低激发态重新发射紫外线或可见光。
荧光是指光致发光，荧光物质吸收外界高能光辐射（如紫外、X射线、日光短波段）后，导致内部电子能级跃迁，重新释放出低能长波光，既为荧光。
由于吸收光子与释放光子能量有差异，某些情况下，外界高能光辐射停止后,释放低能长波光过程仍会持续一段时间。
荧光技术用于研究生物医学样品的主要参数：荧光强度（发射荧光的强弱）、量子产率（发射光子数或吸收光子数）、荧光偏振度、荧光寿命（衰减为原来激发时最大光强都的1/e所需要的时间）荧光偏振的意义是什么？1//二1丄，P二0,自然光，荧光分子运动很快，取向随机。
（稀溶液中的荧光分子）I//或I丄为0 , P二±1,平面偏振光，荧光分子运动很慢或取向有序的悄况。
I//HI丄H 0 ,0<P<l,生物大分子的荧光属于这种情况。
荧光技术的应用：采用荧光标记的链终止剂所得到的DNA测序图,DNA探测:澳化乙唳是一种荧光染料，当它在溶液中自山改变构型时，只能发出很弱的荧光；当它嵌入核酸双链的碱基对之间与DYA分子结合后，便可以发出很强的荧光。
荧光探针、物质检测、物质分析（DNA、蛋白质）、检测分子间的结合程度、大分子内基团间或分子间距离的测定、膜生物物理研究物质的定性:不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。
与吸收光谱法相比,荧光法具有更高的选择性。
荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周用的环境，即对周用环境十分敬感。
利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。
在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的荧光发色团（如色氨酸、酪氨酸、鸟昔酸等，此类荧光称为内源荧光）以外，可将一些特殊的荧光染料分子共价地结合或吸附在生物大分子的某一部位，通过测定该染料分子的荧光特性变化来研究生物大分子,这种染料分子被称为“荧光探针”，它们发出的荧光一般称为外源荧光。
荧光发光机理
荧光发光机理
1、荧光发光机理：某些物质被一定波长的光照射时, 会在较短时间内发射出波长比入射光长的光, 这种光就称为荧光。
2、荧光，汉语词语。
又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。
当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；很多荧光物质一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。
具有这种性质的出射光就被称之为荧光。
另外有一些物质在入射光撤去后仍能较长时间发光，这种现象称为余辉。
在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。
也指温度(不是色温)低的冷光。
荧光发光机理
荧光发光机理荧光发光是一种常见的光学现象，由于物质受到低能量的光激发，使能量上升到一个较高的能级，即“激发态”，当激发态消失时，物质释放出一个比激发态低一级的能量，也就是荧光发光。
荧光发光的特点是具有波长可调、饱和度可控、亮度高等优点，在照明、电子显示器件、生物检测、军事技术和其他领域得到广泛应用。
荧光发光机理简单来说，荧光是一种物质在受到低能量的光激发后，从激发态回复到基态的过程。
在一般情况下，光子的能量直接被物质的电子吸收，从而将电子从较低能级的“基态”提升到一个较高的能级，即“激发态”。
当激发态的电子在受到热量的影响后，将会以光子的形式释放出比激发期低一级的能量，从而回复到基态，也就是荧光发光的物理机制。
此外，荧光发光还可以通过吸收其他比较低能量的光子继续回复到基态，形成发射光子。
因此，荧光发光也可以通过控制其他光子的能量，调节荧光发光的能量和颜色等特性。
应用荧光发光机理在实际应用中有着广泛的用途，例如：照明：由于荧光发光特性的温和、可调波长、饱和度可控以及可靠的性能，它已经成为家庭和工厂的替代照明，并且能够提供更高效率和更低成本的使用。
电子显示器件：荧光发光机理在电子显示器件中被广泛应用，例如电视屏幕、电脑显示器和投影显示器等；生物检测：荧光发光机理可以用来检测某种特定的物质，例如克隆和活体细胞的标记，主要用于科学研究；军事技术：荧光发光可以广泛应用于军事技术，例如可见光相机、可见光运动探测和照明弹等，可以提供可靠的识别和探测性能。
结论综上所述，荧光发光机理是一种常见的光学现象，可以调节荧光发光的能量和颜色等特性，并在照明、电子显示器件、生物检测、军事技术和其他领域中得到广泛应用。
荧光产生的基本原理
荧光产生的基本原理荧光是指物质受到激发后，吸收一定波长的能量后，释放出较长波长的能量，从而产生的可见光现象。
荧光具有广泛的应用，例如荧光染料、荧光显微镜等。
下面将详细介绍荧光产生的原理和应用。
一、荧光产生的激发原理荧光产生必须受到激发，激发可以是电子、离子、分子或原子的能级跃迁等。
荧光的能级跃迁可以分为两种类型：单次跃迁和级联跃迁。
单次跃迁是指荧光物质在吸收能量后，经过一次能级跃迁，从一个能级跃迁到另一个能级，并放出荧光。
级联跃迁是指荧光物质在吸收能量后，经过多次能级跃迁，从一个能级跃迁到另一个能级，最终放出荧光。
二、荧光产生的机理荧光产生的机理是由荧光物质受到激发后，所吸收的能量导致荧光物质内部的电子激发到高能量状态。
在这种情况下，电子会在短时间内释放出一部分的能量，这部分能量会导致荧光物质从高能状态回到低能状态，并释放出荧光能量。
荧光物质的内部电子间的相互作用，是影响其荧光性质的主要因素。
三、荧光产生的应用荧光具有广泛的应用，如下所述：1. 荧光染料：荧光染料常用于生物学研究中。
荧光染料可以定位和标记蛋白质、核酸等生物分子，从而实现荧光成像，并有助于研究生物分子的结构和功能。
2. 荧光显微镜：荧光显微镜利用荧光染料发出的荧光信号，可以追踪单细胞和单分子的运动，并可以研究它们之间的相互作用。
荧光显微镜广泛应用于生物医学研究、神经生物学等领域。
3. 荧光光学：荧光光学可以用于环境监测、生命科学、材料科学等领域。
例如，荧光光学可以测量环境污染物的浓度、荧光探针可以用于光电转化等。
总之，荧光在现代科学技术中扮演着至关重要的角色，我们需要对其产生的原理和应用有深入的了解。
荧光产生的机理
荧光产生的机理：（荧光产生对象：可以是原子也可以是分子）光进入某种物质后一部分能量被吸收，光能转移给分子，一部分结构的分子只吸收一定波长的辐射，分子吸收电磁波，从最低激发态重新发射紫外线或可见光。
荧光是指光致发光，荧光物质吸收外界高能光辐射（如紫外、X射线、日光短波段）后，导致内部电子能级跃迁，重新释放出低能长波光，既为荧光。
由于吸收光子与释放光子能量有差异，某些情况下，外界高能光辐射停止后，释放低能长波光过程仍会持续一段时间。
荧光技术用于研究生物医学样品的主要参数:荧光强度（发射荧光的强弱）、量子产率（发射光子数或吸收光子数）、荧光偏振度、荧光寿命（衰减为原来激发时最大光强都的1/e所需要的时间）荧光偏振的意义是什么？I//=I⊥，P=0，自然光，荧光分子运动很快，取向随机。
（稀溶液中的荧光分子）I//或I⊥为0 ，P=±1，平面偏振光，荧光分子运动很慢或取向有序的情况。
I//≠I⊥≠ 0 ，0<P<1，生物大分子的荧光属于这种情况。
荧光技术的应用：采用荧光标记的链终止剂所得到的DNA测序图，DNA探测：溴化乙啶是一种荧光染料，当它在溶液中自由改变构型时，只能发出很弱的荧光；当它嵌入核酸双链的碱基对之间与DNA 分子结合后，便可以发出很强的荧光。
荧光探针、物质检测、物质分析（DNA、蛋白质）、检测分子间的结合程度、大分子内基团间或分子间距离的测定、膜生物物理研究物质的定性：不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。
与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。
荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。
利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。
在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的荧光发色团（如色氨酸、酪氨酸、鸟苷酸等，此类荧光称为内源荧光）以外，可将一些特殊的荧光染料分子共价地结合或吸附在生物大分子的某一部位，通过测定该染料分子的荧光特性变化来研究生物大分子，这种染料分子被称为“荧光探针”，它们发出的荧光一般称为外源荧光。
(完整word版)荧光机理
1光致电子转移(PET)递给荧光基团的键合基团(RecePtor)，负责光吸收并产生荧光发射信号的荧光基团(Fluorophorc)—其荧光发射强度反映键合基团的结合状态，以及连接键合集团和荧光基团的连接基团(Spacer)。
键合基团和荧光基团通常为电子给体或者电子受体。
光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。
例如，当荧光分子传感器的键合基团是电子给体，荧光基团是电子受体时，具体PET作过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁巨}到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。
因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光(见图)由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。
PET荧光分子传感器的作用机制可由前线轨道理论“来进一步说明(见图 1.5)。
2分子内电荷转移(ICT)ICT荧光化学传感器由推电子基团、吸电子基团通过p电子体系连接而成，在基态时表现为极化结构，一端为缺电子部分，另一端为富电子部分;而在光激发下，偶极矩增大，强化了这种极化特征，容易发生ICT过程(如图)。
ICT荧光化学传感器的工作原理有两种(见图l.7a):当底物是缺电子基团(阳离子)时，一种是底物与吸电子基团结合，将增大分子内电荷转移程度，导致荧光光谱红移;一种是底物与推电子基团结合，则使原来向共扼体系转移的孤对电子用于与阳离子形成配位键，导致ICT 推一拉电子的特征下降，导致荧光光谱蓝移。
当底物是富电子基团(阴离子)时，情况相反。
荧光原理
荧光检测仪器
1. 荧光分光光度计
用于大容积样本（ul,ml)的测量
2. 荧光显微镜（激光共聚焦荧光显微镜）
用于具有三维立体形状的样本（如细胞、组织切片等）的测量 荧光显微镜
激光共聚焦荧光显微镜
荧光技术原理及应用
陶 亮
中山医学院药理学教研室
光的Байду номын сангаас本知识
一、光的本质：光是一种可见的电磁波，是能量的辐射形式 光的波长越长，光子的能量越小 光波 γ射线 X线 远紫外 紫外 可见光 红外 远红外 微波 无线电波 波长 10-5～10-3nM 10-4～0.1nM 10 ～20nM 200～400nM 400～760nM 0.76～50μM 50～1000μM 0.1～100cM 1～100M
荧光素的性质1激发光波长和发射光波长荧光素荧光素激发光波长近紫外区域可见光区域发射光波长可见光区域发射光波长激发光波长根据荧光素的激发光波长和发射光波长选择光源和滤光片2激发光谱和发射光谱荧光素的激发光谱和发射光谱反映了该荧光素的光化学性质激发光谱激发光谱荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱吸收光谱荧光素的荧光发射强度随激发光波长变化的光谱发射光谱荧光素的荧光发射强度随发射光波长变化的光谱onspectrumexcitatiemissionsspectrumwavelengthexem激发光谱和发射光谱的用途激发光谱确定荧光素适宜的激发波长的依据发射光谱发射光谱确定荧光素检测波长的依据确定荧光素检测波长的依据最大激发波长ex最大发射波长最大发射波长em激发光谱和发射光谱可用来鉴别荧光物质每一种荧光物质都有其特定的激发光谱和发射光谱3荧光强度荧光强度荧光素发射荧光的光量子数决定荧光素检测的灵敏度决定荧光素检测的灵敏度荧光素的荧光效率决定其荧光强度4荧光寿命荧光寿命激发态寿命电子在激发态的平均停留时间荧光寿命长检测特异性和灵敏度高荧光物质受激发时其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失漂白5荧光漂白6自发荧光组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光荧光染料的发展简史1838年brewster首次描述了荧光现象1852年stokes发现并描述荧光物质荧光染料1903年wood设计出可选择透过紫外光的滤光片1911年reicherl发明荧光显微镜1935年haitinger将荧光物质用于固定的细胞和组织活细胞染色新的荧光探针新的检测技术不断出现荧光技术已用于整体器官细胞分子水平生命现象的研究常用的荧光染料探针一
分子荧光材料荧光机理
一.分子荧光的发生过程（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=½+(-½)=0，其多重性M=2S+1=1 (M为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，称“单线态”；图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即ÄS=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1其多重性：M=2S+1=3即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；“三线激发态”比“单线激发态”能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。
（二）分子去活化过程及荧光的发生：（一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：1.振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
图2 分子吸收和发射过程的能级图2.内转换：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。
荧光基本原理
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基态的分子有平面对称性，但在激发态对称 性被破坏，因此在优选计算开始的时候就将 基态几何结构做稍微的扰动，将对称性破坏 这一步又分为两个小步，第一步是首先做基态计算，在PCM输入部 分指定NonEq=write。第二步是实际的特定态的计算，需要用 NonEq=read读取非平衡溶剂化的必要信息。 第三步实际上分成两步： 1、第一小步是基于基态的平衡结构准备基态非平衡溶剂（因为溶质 吸收了光子跃迁到激发态的过程太快，溶剂没有跟上变化，因此溶剂 仍然是基态时的状态，但需要用到非平衡方式考虑溶剂） 2、第二小步是基于上一小步准备的基态非平衡溶剂计算基态平衡结 构的激发态的能量（也就是考虑了基态的非平衡溶剂对激发态能量的 影响）。 这个能量减去在第一大步中使用平衡溶剂得到的基态平衡结构能量， 差值就对应了紫外特征吸收的能量，经过转换可以得到吸收波长。
磷光发射：三重态→基态能级
先无辐射跃迁至三重态，逗留较长时间后再跃迁至基态能级，发射 磷光
荧光发光原理
荧光光谱选择性好，能吸收光的物质不一定能发射荧光，一定波长 下不同物质的荧光光谱不同 荧光光谱没有吸收光谱使用广泛，许多物质不产生荧光，并且荧光 对环境因素非常敏感
产生荧光的基本条件
入射光要能被物质粒子吸收，使粒子能够跃迁到激发态，然后经第 一电子激发态的最低能级，降落到基态振动能级 物质粒子要具有高的荧光效率
发射荧光光子数
吸收光子数
nF kF n A k F ki
i
kF荧光过程速率常数， 由物质粒子本身决定
吸收强度越大，被激发到高能级的粒子数越多，则向下跃 迁产生的荧光越强
吸收光谱 强度 强度
荧光光谱
波长
波长
第一步是基态的结构优化和频率，得到一个 1.chk 第二步是垂直激发的TD-DFT计算，用第一步的 1.chk 文件得到一个新的 2.chk 第三步是垂直激发的特定态溶剂化。 第四步激发态几4.chk 第五步激发态几何结构频率光谱，用第四步的 4.chk 文件得到一个新的 5.chk 第六步
荧光基本原理
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1光致电子转移(PET)递给荧光基团的键合基团(RecePtor)，负责光吸收并产生荧光发射信号的荧光基团(Fluorophorc)—其荧光发射强度反映键合基团的结合状态，以及连接键合集团和荧光基团的连接基团(Spacer)。
键合基团和荧光基团通常为电子给体或者电子受体。
光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。
例如，当荧光分子传感器的键合基团是电子给体，荧光基团是电子受体时，具体PET作过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁巨}到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。
因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光(见图)由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。
PET荧光分子传感器的作用机制可由前线轨道理论“来进一步说明(见图 1.5)。
2分子内电荷转移(ICT)ICT荧光化学传感器由推电子基团、吸电子基团通过p电子体系连接而成，在基态时表现为极化结构，一端为缺电子部分，另一端为富电子部分;而在光激发下，偶极矩增大，强化了这种极化特征，容易发生ICT过程(如图)。
ICT荧光化学传感器的工作原理有两种(见图l.7a):当底物是缺电子基团(阳离子)时，一种是底物与吸电子基团结合，将增大分子内电荷转移程度，导致荧光光谱红移;一种是底物与推电子基团结合，则使原来向共扼体系转移的孤对电子用于与阳离子形成配位键，导致ICT 推一拉电子的特征下降，导致荧光光谱蓝移。
当底物是富电子基团(阴离子)时，情况相反。
一般情况下，ICT荧光化学传感器对荧光强度的影响不如PET荧光化学传感器显著。
典型例子是同时含有吸电子取代基、推电子取代基的电子体系，如氨基邻苯二甲酞亚胺、二苯基烯、氟代香豆素等。
ICT荧光化学传感器的缺点是对外部环境的变化十分敏感，有较强的溶剂化效应。
在ICT中，有一种情况被称为扭曲的分子内电荷转移(TICT twisted Intramolecular charge transfer)。
在具有推一拉电子共扼体系的荧光分子中，如果推电子基(如二甲氨基)通过可旋转的单键与荧光团相连接，当荧光团被光子激发时，由于强烈的分子内光致电荷转移，导致原来与芳环共平面的电子给体绕单键旋转，而与芳环平面处于正交状态，原来的共辘系统被破坏，部分电荷转移变为完全的电子转移，形成TICT激发态(见图)。
当形成TICT激发态时，原有的ICT荧光则被淬灭。
TICT态常常不发射荧光或者发射弱的长波荧光，少数情况下会出现ICT与TICT双重荧光现象。
3荧光共振能量转移(FRET)FRET荧光传感器分子的组成与其他类型传感器有所不同，除了含有键合基团(Reccptor)彩!连接基团(Spacer)，还含有两个负责光吸收井产生荧光发射信号荧光基团(FluoroPhore)，而这两个荧光基团一个是能量给体(Energy donor，D)，另一个是能量受体(Energy acceptor，A)。
荧光共振能量转移是指在一定波长的光激发下，荧光基团中的能量给体(D)产生荧光发射，并通过偶极一偶极之间的相互作用把能量无辐射地转移给其附近的处于基态的能量受体(A)荧光基团的过程。
FRET 过程的发生与很多因素如光谱重叠的程度、跃迁偶极的相对方向，给体(D)和受体(A)之间的距离等有关。
首先，能量给体(D)的发射光谱与能量受体(A)的吸收光谱有明显的重叠，能量受体必须能够在能量给体的发射波长处吸收能量，但能量受体可以是荧光发射基团，也可以是荧光淬灭基团。
对于前一种情形，激发能量给体时，可以观察到能量受体的荧光发射;而后一种情形，只能观察到能量给体的荧光变化。
其次，能量给体与能量受体相隔的距离必须远大于它们之间的碰撞直径(有时甚至相距远达70-100Å)时，才可能发生能量给体与能量受体的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移。
另外，能量给体(D)与能量受体(A)还必须以适当的方式排列。
利用FRET效率对距离的强的依赖性，FRET广泛应用于蛋白质和核酸的结构及动力学研究、分子结合的测定等领域。
例如，当荧光分子传感器的两个荧光基团都是荧光发射基团时，具体FRET工作过程如下(见图1.8):在光激发下，荧光基团中的能量给体(D)产生荧光发射;传感器分子通过键合基团键合底物来调节能量给体(D)和能量受体(A)之间的距离以及排列方向。
如果底物的加入使这些因素均在适当范围，能量给体(D)可将能量通过非辐射转移给能量受体(A)，表现为能量受体(A)的荧光发射;如果底物的加入使这些因素与FRET因素不能匹配，则会抑制FRET过程，则表现为能量给体(D)的荧光发射(图)。
4激基缔/复合物(exeimer/exciplex)基于激基缔/复合物(excimer/exciplex)的荧光化学传感器分子的特点是在一个分子中含有两个荧光基团，如多环芳烃萘、蒽和芘等，并且两个基团处于分子的合适位置。
当两个荧光基团相同时，其中一个荧光基团(单体)被激发后，会和另一个处于基态的荧光基团形成分子内激基缔合物(excimer)。
激基缔合物的荧光发射光谱取代了单体的发射峰，呈现出一个新的强而宽的、长波长的、无精细结构的荧光发射峰。
当两个荧光基团不同时，则称之为激基复合物(exciplex)。
激基缔/复合物形成与否的关键是两个荧光基团之间的距离，只有激发态分子与基态分子之间的距离约为3.5Å时，才能形成激基缔/复合物。
基于激基缔/复合物(excimer/exciplex)的荧光化学传感器就是利用受体结合底物后导致激基缔/复合物构型的形成或破坏，使激基缔/复合物的荧光增强或消失，通过单体、激基缔/复合物的荧光光谱变化表达底物识别的信息。
因此，构型的变化是此类信息产生的原因，图给出了加入底物后可以形成激基缔合物的荧光化学传感器的工作原理。
萘、芘、蒽等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命，容易形成激基缔/复合物，常常被用于此类荧光化学传感器中。
杂原子对荧光的影响比较复杂，有时增强荧光，有时减弱荧光。
主要看杂原子化合物的结构。
简单杂环化合物的荧光量子产率很小，几乎为0，但当他们与苯环相并后的产物荧光大大增强。
含氮杂环化合物的分子中含有N原子。
在非极性介质中它们的荧光很弱，随着介质极性的提高，其荧光强度亦随之提高。
取代基的影响取代基的性质对荧光体的荧光特性和强度均有强烈影响，芳烃和杂环化合物荧光光谱和荧光产率常随取代基而改变，取代基对荧光体的激发和发射光谱以及荧光效率的影响规律和机理，是人们甚为光注的领域，可惜人们对激发态分子的性质了解甚少，影响规律多出自实验总结和猜测。
（a）推电子取代基增加荧光属于这类基团的有。
含有这类基团的荧光体，其激发态是有环外的前几或氨基上的非键电子（n电子）激发转移到环上而产生的。
由于他们的n电子云几乎与芳环上的轨道成品活性，实际上共享了共轭而电子结构，扩大了共轭双键体系。
因此，这类化合物的吸收光谱与发射光谱的波长，都比未取代的芳族化合物的波长长，荧光效率也提高很多，但在应用这类荧光体是要特别小心，因为这类基团都含有未键和的n电子。
他们容易与极性溶剂生成氢键。
当取代基是酸基或碱基是，在酸碱性介质中容易转化为相应的盐或质子化，使荧光强度减弱甚至消失。
（b）吸电子取代基含有吸电子基团的荧光化合物，其荧光强度一般都会减弱，属于这类取代基的有羰基卤素和基等，这类取代基也含有n电子，然而其m电子的电子云并不与芳环上的π电子云共平面，这类化合物的nπ*跃迁是属于禁戒跃迁，摩尔吸收系数很小（约为102），最低单线激发态S1 为n，π*，S1T1 的系间跨越强烈，因为荧光强度都很弱，而磷光强度相应的增强。
氰基是一个很有意思的基团，是不饱和的取代基，它应使取代的化合物的荧光减弱，但实际结果是表现为退电子的效果——荧光强度。
它的取代9，10-二氰基蒽的Φf 不但大于蒽，而且9-氯-10-二氰基蒽的Φf也高达0.95，远大于9-氯代蒽的Φf（0.11）（C）重原子的取代荧光体取代上重原子之后，荧光减弱，二磷光往往相应增强。
所谓重原子取代，一般指的是卤素（Cl,Br和I）取代芳烃取代上重原子后荧光强度一般随卤素原子量增加而减弱，这一效应称为“重原子效应”。
这种效应被解释为：由于重原子的存在，使得荧光体中的电子自选一轨道偶合作用加强、S11的系间跨越显著增大，结果导致荧光强度极爱你若、磷光强度增加。
（d）饱和烷烃的取代此类取代基对荧光体的荧光强度影响不大，可是，由于可动的饱和烃基的引入，增加了荧光体的振动和转动自由度，因而消弱了荧光激发光谱和发射光谱振动结构的分辨率，同时激发峰和发射峰略为红移。
(e)取代基数量及其所处位置的影响取代基在试剂分子上的位置及取代基的数量对试剂的荧光量子产率的影响视具体情况而定，是有一个退电子取代基，处于空间位阻最小火空间位阻的位置可使荧光增强。
对于不同的发光母体，同类取代基所处位置不同所表达的荧光强度变化规律也不相同。
另外对荧光的影响还要看取代基的种类，校体积取代基所贡献的共轭效应小，只是体现出其电荷影响，若一个大的取代基如苯或乙炔基苯其共轭效应大，取代后扩大了试剂共轭体系，使荧光增强的效应大于其吸电子是荧光减弱的效应，结果是取代后荧光强度不是减弱二十大大增强。
（f）芳香环中杂原子的影响杂原子对荧光的影响比较复杂，有时增强荧光，有时减弱荧光，主要看杂原子化合物的结构，简单杂环化合物的荧光量子产率很小，几乎为0，但当它们与苯相并后产物荧光大大增强。
如：含氮杂环有机物是研究的较多的杂环化合物，它们的每个分子都含有一个或多个N原子。
在非极性介质中它们的荧光很弱，随着介质极性的提高，其荧光强度亦随之提高，如8-羟基喹啉在强酸性介质中产生质子化，从而使原来最低单线激发态S1由n，π*型转化为π，π1*型，荧光由弱变强。