酶的分离纯化层析技术优秀课件
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酶的分离纯化资料PPT课件
常用的缓冲液：20-50mmol/L的磷酸缓冲液； 0.1mol/L Tris-HCl，必要时可加入 EDTA、巯基乙醇或蛋白稳定剂等
胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体
孙利20芹20年209月1238日制作
9
◆细胞抽提液的制备
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞 破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过 程。
通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从 而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等， 对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性
选择原则：
①必须与水混溶 ②不与pr反应 ③较好的沉淀效应 ④溶剂蒸汽无毒，
15
盐析法
向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响:盐溶现 象和盐析现象
盐析方程:
lg0= β
Ks:盐析效率，是蛋 白质和盐种类的 特征常数。在一 定pH和温度条 件下，利用不同 蛋白质的Ks不同
β分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变
§1.6酶的分离纯化
2013春
提纲
蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离 蛋白质的大规模分离纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
2
一、蛋白质纯化的一般考虑
※从量上考虑
为测序或克隆的目的，只需几微克； 为工业或医药的用途，则可达几千克
※从纯化的标准
为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上； 用于其它一般用途，要求低
高度纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
成品加工
5
二、蛋白质的粗分离
材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白
胞外酶：过滤、离心等方法出去菌体
孙利20芹20年209月1238日制作
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◆细胞抽提液的制备
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞 破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过 程。
通过降低溶液的介电常数，增强偶极离子间的静电吸引，从 而使分子聚集沉淀。此外，有机溶剂本身如酒精、甲醇、丙酮等， 对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使 蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性
选择原则：
①必须与水混溶 ②不与pr反应 ③较好的沉淀效应 ④溶剂蒸汽无毒，
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盐析法
向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响:盐溶现 象和盐析现象
盐析方程:
lg0= β
Ks:盐析效率，是蛋 白质和盐种类的 特征常数。在一 定pH和温度条 件下，利用不同 蛋白质的Ks不同
β分段盐析：S0随pH和温度的变化而变化,在一定的I值下通过改变
§1.6酶的分离纯化
2013春
提纲
蛋白质纯化的一般考虑 蛋白质的粗分离 蛋白质的大规模分离纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
2
一、蛋白质纯化的一般考虑
※从量上考虑
为测序或克隆的目的，只需几微克； 为工业或医药的用途，则可达几千克
※从纯化的标准
为临床治疗所需，纯度应达到98%或99%以上； 用于其它一般用途，要求低
高度纯化
孙利20芹20年209月1238日制作
成品加工
5
二、蛋白质的粗分离
材料的选择和细胞抽提液的制备 蛋白质的浓缩和脱盐 沉淀法分级蛋白
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸有机聚合物沉淀
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
酶的提取与分离纯化(1)ppt课件
Size-exclusion chromatography
★
② 凝胶的种类和性质
▼交联葡聚糖凝胶（dextran gel)
商品名:Sephadex 型号 Sephadex G－10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大， 交联度越小，孔径越大，分离范围越广。
葡聚糖凝胶层析介质的有关参数
微滤 超滤
反渗透
<20A
0.7-13MPa
★
微滤(Microfiltration，MF) 一种静态过滤， 随过滤时间延长，膜 面上截流沉积不溶物， 引起水流阻力增大， 透水速率下降，直至 微孔全被堵塞；
●
原料液
渗透液 无流动操作
●
超滤
(ultrafiltration，UF )
★
一种动态过程，由泵提供推动力，在膜 表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法 向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜 面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。
③ 层析柱的制备与层析操作
●
★
柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测仪、 部分收集器、梯度洗脱器。
层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
低温层析柜
记录仪
2
吸附层析（adsorption chromatography）
★
①原理:利用固定相的固体吸附剂表面
对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶 解作用（解吸作用）的差异进行分离。
★
③色谱仪组成
1）进样系统 2）输液系统 3）分离系统 4）检测系统 5）数据处理系统
作业:1膜分离的原理﹑有哪些类型 2层析法的原理﹑有哪些类型
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑营：课件设计，文档制作，网络软件设计、 图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满 意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、 计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面， 打造全网一站式需求
食品酶学本酶的分离纯化分离方法ppt课件
Kd
Ve Vo Vi
Ve：某组分的洗脱体积，该组分从加进层析柱到流出液中该组 分出现高峰时所用洗脱液体积（mL）
Vo：外（水）体积，层析柱内凝胶之间空隙的体积（mL） Vi：内（水）体积，层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积(mL)
30 August 2021
19
（1）Kd值的意义
Kd=0时 即Ve=Vo，该组分足够大，不能进入微孔，最先流出。 Kd=1时 即Ve=Vo+Vi，该组分可进入全部的微孔，最后流出。 0<Kd<1 Kd小的先流出， Kd大的后流出。
分离方法分述
一、离心分离法 二、过滤与膜分离 三、沉淀分离法 四、层析分离法 五、电泳分离法 六、酶的结晶 七、浓缩与干燥
30 August 2021
1
四、层析分离法
原理：利用混合物中各组分理化性质的差别，使各组分不同程
度地分布在固定相和流动相中，当流动相经过固定相时，各组 分随流动相移动速度不同，从而达到分离各组分的目的。 吸附层析：利用吸附剂对不同物质的吸附力不同，而使混合物
②可将离子交换剂加到酶液中，待交换后，将离子交换剂过滤分离出来，再用洗脱剂将酶洗脱出来。
中性蛋白目酶可前在pH在6. 酶的分离纯化方面广泛应用的离子交换剂。常用的有 2洗、脱离液子的交D流换速E剂：的A流构速E成快：-分基纤辨质率、维低功。能素基团、（电A荷E基-团纤）、维反离素子。、CMC（羧甲基纤维素）等。
3、吸附层析方法 枯草杆菌α-淀粉酶在弱酸性条件下，
①吸附剂可装在吸附柱可上吸进附行在吸氧化附铝柱上层，析再；用pH8～9的
②把吸附剂加到酶液中N，a3吸PO附3溶后液过洗滤脱出；中来性，蛋再白加酶可洗脱剂， 使酶解吸而洗脱出来。在 附p，H再6在.5p～H89.～5条11件.5下的，2用%硅氯藻化土钠吸
酶的提取与分离纯化ppt课件
整理版课件
22
4.干燥法
气流干燥 真空干燥 喷雾干燥 冷冻干燥
使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、 丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被 抽提出来。
气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30℃的气流中吹干； 真空干燥多用于细菌。
整理版课件
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三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向
整理版课件
19
5.其他方法
1. X-press法
将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利用500MPa 以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破 碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起 的。
此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及 活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。
整理版课件
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3. 反复冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多 次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键 结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变 化，引起细胞膨胀而破裂。
适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融 过程中可能引起某些蛋白质变性。
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化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质 如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍 滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进 一步提取。
缺点： 通用性差；
时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。
整理版课件
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（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结 构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持， 一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落， 使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补， 从而导致内层膜通透性的增强。
酶的分离纯化层析技术PPT讲稿
酶的分离纯化层析技术课件
第四章 层析技术
引言 层析法的基本原理 层析法的分类
引言
层析法的发现与进化历史
思想
层析法的基本原理
根据引言内容,是否可以总结 概括出层析法的基本原理？
层析法的分类
第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC）
常温
化工分析，环境 生物分子，蛋白核 利用混合物中各组分物物理理、、化化学学性性质质 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分 配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流 动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同 的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类
（1）按流动相状态分类：
探索与发现 5
气相色谱的产生(GC)
1952年，马丁同詹姆斯(James)，把 LLC技术原理应用在分离气体上。
各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一 类情性载气的气流通过吸收性固体的表 面。混合的气体通过后,在另一端出现时 就分开了。
探索与发现 6
高效液相色谱(HPLC)的应用
20世纪60年代以来,气 相色谱作为分析方法已 经不能满足对生物成分 分析测试的要求。
吸附柱层析
一、常用术语
2.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体 积。
第一节 吸附层析技术
吸附柱层析
√ 吸附薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
薄层层析(TLC)
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载 体上的基质为固定相，以液体为流动相的一 种层析方法。
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相， 以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的 一种层析方法。
第四章 层析技术
引言 层析法的基本原理 层析法的分类
引言
层析法的发现与进化历史
思想
层析法的基本原理
根据引言内容,是否可以总结 概括出层析法的基本原理？
层析法的分类
第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC）
常温
化工分析，环境 生物分子，蛋白核 利用混合物中各组分物物理理、、化化学学性性质质 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分 配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流 动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同 的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类
（1）按流动相状态分类：
探索与发现 5
气相色谱的产生(GC)
1952年，马丁同詹姆斯(James)，把 LLC技术原理应用在分离气体上。
各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一 类情性载气的气流通过吸收性固体的表 面。混合的气体通过后,在另一端出现时 就分开了。
探索与发现 6
高效液相色谱(HPLC)的应用
20世纪60年代以来,气 相色谱作为分析方法已 经不能满足对生物成分 分析测试的要求。
吸附柱层析
一、常用术语
2.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体 积。
第一节 吸附层析技术
吸附柱层析
√ 吸附薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
薄层层析(TLC)
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载 体上的基质为固定相，以液体为流动相的一 种层析方法。
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相， 以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的 一种层析方法。
酶的分离与纯化PPT课件
2）非机械法：酶法、化学法、物理法 • 化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通
透性；TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTA：对G-菌 外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐 酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性 差，效率低，毒性
(NH4)2SO4饱和度表
• 温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液 中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质 的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强 度溶液中，25℃时的溶解度比0℃时明显减小。这主要是 因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升 高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除 非这种酶对温度比较敏感。
蛋白质的盐析
盐析应用最广泛的是硫酸铵
• 优点 1）溶解度大 25℃时硫酸铵的溶解度可达4.1mol/L(541g/L)以上。大 约每升水可溶解767g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶 都可以被盐析沉淀出来。 2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如 0℃时，硫酸 铵的溶解度仍可达到3.9mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解676g。对 于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格 低廉，容易获得。 • 缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。
（五）沉淀分离
1、盐析法 盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓 度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1）盐析法的机制 （2）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和NaH2PO4 （3）(NH4)2SO4饱和度表示法 （4）影响盐析的因素 1）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响
酶分离纯化的评价 ppt课件
ppt课件
27
酶分子的修饰方法 重要
化学法又可分为：金属离子置换法、大分子修饰 法、肽链有限水解法、蛋白侧链基团的小分子修 饰法等。
生物法是通过基因工程的手段改变蛋白质，即基 于核酸水平对蛋白质进行改造，利用基因操作技 术对DNA或mRNA进行改造和修饰以期获得化学 结构更为合理的蛋白质。
物理修饰法的特点是不改变酶疗药物。要 求较高的纯度和一定的活力单位数。用作分析工 具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外， 还要求单位质量的酶制剂中酶活力达到一定的单 位数。用作基因工程的工具酶要求不含非专一性 的核酸酶，或完全不含核酸酶，
ppt课件
12
酶的保存方法
(1) 温度。
•(3) 酶蛋白浓度。
比活力
纯化
(单位)
(%)
(mg) (酶单位/mg 蛋白质) 倍数
33652
100
4982
6.8
1.0
32200
96
3300
9.8
1.4
25560
76
1474
17.3
2.5
17253
51
308
56.0
8.2
4614
14
5.9
782.0
115.0
2300
7
1.7
1352.9
199.0
1410
4
0.33
4272.7
ppt课件
4
酶的总活力为样品的全部酶活力。 总活力 = 酶活力 × 总体积 (mL) 或 = 酶活力 × 总质量 (g)
ppt课件
5
比活力 (Specific activity) ：比活力是指单位 蛋白质 (毫克蛋白质或毫克蛋白氮) 所含有 的酶活力 (单位/毫克蛋白) 。
酶的分离纯化 (2)优秀课件
酶的分离纯化 (2)优秀课件
1
Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
2
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
8
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
17
3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
1
Contents of chapter 4
Go 第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 Go 第二节 细胞破碎 Go 第三节 酶的提取 Go 第四节 酶的分离方法 Go 第五节 酶的浓缩、干燥与结晶 Go 第六节 纯化方案的设计与评价
2
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ +
酵母
++++
革兰氏阳性球菌 + - + +
菌丝
- ++ - ++
孢子
----
8
有机溶剂可以使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的 透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。为了防止酶 的变形失活，操作过程应在低温的条件下进行。
表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使 细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。表面活性剂有 离子型和非离子型之分，离子型表面活性剂对细胞破碎效果 较好，但是会破坏酶的空间结构，从而影响酶的催化活性。 所以在酶的提取方面，一般采用非离子型的表面活性剂。
2、Ph
在等电点的条件下，酶分子的溶解度最小。不同的酶分子有 其各自不同的等电点。为了提高酶的溶解度，提取时应该避 开酶的等电点，以提高酶的溶解度。但是溶解的PH不宜过 高或过低，以免引起酶的变形失活。
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3、提取液体积
增加提取液的用量，可以提高酶的提取率。一般总 用量为原料体积的3-5倍。 在酶的提取过程中，含酶原料的颗粒体积越小则扩 散面积越大，有利于提高扩散速度；适当的搅拌 可以使提取液中酶分子迅速离开原料颗粒表面， 从而增大两相界面的浓度差，有利于提高扩散速 度；适当延长提取时间，可以使更多的酶溶解出 来。
《酶的分离纯化》PPT课件
2
0
精品医学
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择 适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀 酸、稀碱、稀盐溶液等） ，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中， 碱性物质易溶于酸性溶剂中
2
1
精品医学
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短 扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的 扩散速度，从而增大提取效果。
捣碎法 研磨法 匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法
有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween
自溶法 外加酶制剂法
精品医学
机械法（注意预冷）：
捣碎法： 10000rpm
研磨法： 匀浆法：研杆和管壁
间只有几百微米
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
1
6
精品医学
物理法：
反复冻融法：时间长，需加蛋 白酶抑制剂（PMSF、EDTA 等）
超声波处理法：处理时间尽量 短，避免局部过热使得酶失活
渗透压法： 冷热交替法：
1 7
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
高压细胞破碎机
精品医学
动物
细菌
植物
∣研磨 ∣超声波
∣纤维素酶
∣匀浆 ∣溶菌酶
∣
↓捣碎机 ↓化学溶剂 (甲苯) ↓
1
4
精品医学
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
酶的分离纯化 ppt课件
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人：
硫酸铵盐析
免疫亲和层析
阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了解;
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
适用于耐热的酶，注意常要加适当的酶保护剂。 （2）加凝聚剂或絮凝剂
（3）调pH值 二、固液分离 方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
三、细胞破碎
捣碎法：捣碎机
机械破碎法
研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等 匀浆法：匀浆器
物理破碎法
温度差破碎法：冻融交替法 压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化
各国研究的热点。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析
2、按膜孔径或截留物质的大小：
水
超滤（UF）
（10-200nm）
纳滤（MF） 反渗透滤（RO）
（2-10nm）
（＜2nm）
武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 过滤介质 应用举例
微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm 纳滤
《酶的分离和纯化》PPT课件
缓冲液 （e）硫铵溶液密度较高（1.24），故需较大离心力
此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩
医学PPT
6
透析与浓缩
1）透析袋处理：
透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取
2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透 析液；监测电导值
a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽
的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 c）配体的选择：有亲和力但不易过大 d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法； 包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） e） 吸附剂的衍生物：支持物+空间臂 f） 层析条件的选择：蛋白质+配体 → 蛋白质-配体复合物 起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）， 故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件
医学PPT
10
纸层
医学PPT
11
薄层
医学PPT
12
3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ： 交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离
a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析
c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶
d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAECellulose 、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂 CMCellulose、CM- Sephadex
a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌
↓
加热90-100℃（水浴加热）
此步可除去75%以上的杂蛋白，且可使蛋白浓缩
医学PPT
6
透析与浓缩
1）透析袋处理：
透析袋 0.5M EDTA煮半小时 蒸馏水煮半小时 反复八次 带橡皮手套用镊子拿取
2）透析除盐：200倍于被透析物；4小时换一次透 析液；监测电导值
a）关键：配体；配体与支持物的连接方法；吸附、洗脱条件 b）支持物的选择：非特异性吸附作用低；液体流动性好；较宽
的pH、离子强度；丰富的化学基团；有效的多孔性 常用琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和受控多孔玻璃球 c）配体的选择：有亲和力但不易过大 d）配体与支持物的连接：载体结合法；物理吸附法；交联法； 包埋法（先活化支持物上的功能基团再将配体连上去） e） 吸附剂的衍生物：支持物+空间臂 f） 层析条件的选择：蛋白质+配体 → 蛋白质-配体复合物 起初配体浓度恒定，随蛋白浓度增加平衡右移（逐渐保留特性）， 故亲和力较低也能成功的亲和。 g）洗脱：更高亲和力的物质置换；剧烈改变环境条件
医学PPT
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纸层
医学PPT
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薄层
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3）离子交换层析（ion exchange chromatography） ： 交换剂上带电荷，可根据样品的电荷予以分离
a）阳离子交换层析 b）阴离子交换层析
c）离子交换剂的类型：离子交换树脂、离子交换纤 维素、离子交换凝胶
d）实验室常用的离子交换剂：阴离子交换剂DEAECellulose 、DEAE-Sephadex；阳离子交换剂 CMCellulose、CM- Sephadex
a）凝胶预处理：凝胶→浸入洗脱液→轻轻搅拌
↓
加热90-100℃（水浴加热）
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提出色谱塔板理论;预测气相色谱;提出用细小颗 粒作填料,而两端可以加压(HPLC).
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现，诺贝尔化学奖
塔板理论
将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏 塔的塔板间移动，在每一个塔板内不同组分分 子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动 相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下 一个塔板，并不断形成新的平衡
Why not Tswett?
相同时期发生在中国大地的事件
1894年：中日甲午战争,侵占台湾。 1897年：德国侵占胶州湾。 1900年：八国联军侵略中国。 1914年：占领青岛,夺取胶州湾。 1931年：九一八事变,占领东北,建立满州国。 1937年：卢沟桥事变。
探索与发现 4 羊毛中的氨基酸分离引言探索与发现 1
1850年德国科学家朗格首先发现了色 谱分离的现象，当他把一种有颜色的 物质滴到一张滤纸上，观察到它们扩 散成一圈圈的圆环。
探索与发现 2
1906年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett）:
将碳酸钙细粉装入玻璃瓶， 石油醚抽提叶子的色素溶液倾入， 接着倒入石油醚洗涤， 柱上部出现了绿色的叶绿素，
吸附柱层析
一、常用术语
2.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体 积。
第一节 吸附层析技术
吸附柱层析
√ 吸附薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
薄层层析(TLC)
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载 体上的基质为固定相，以液体为流动相的一 种层析方法。
常温
化工分析，环境 生物分子，蛋白核 酸，医药
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物物理理、、化化学学性性质质 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分 配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流 动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同 的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类
（1）按流动相状态分类：
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数（或溶解度）不同。
离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。
（3）按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。
液相色谱 液-固层析 液-液层析
气相色谱 气-固层析 气-液层析
两种固定相：(固定相不一定是固体) *固体吸附剂作为固定相 *吸附在固体上的液体（硅胶吸附的水作固定相， 以氯仿作流动相，分离羊毛中的氨基酸 ）
（2）按层析原理分类：
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。
薄层层析可根据固定相的种类分为吸附 薄层层析（吸附剂为固定相）、分配薄层层 析（固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为 固定相）和离子交换薄层层析（离子交换剂 为固定相）等。
薄层层析
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，类 似纸层析。
层析技术
√ 第一节 吸附层析技术
第二节 分配层析技术 √ 第三节 凝胶过滤层析技术
第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 √ 第六节 高压液相层析（HPLC）
第一节 吸附层析技术
√ 吸附柱层析 √ 薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
吸附柱层析
酶的分离纯化层析技术优秀课 件
第四章 层析技术
引言 层析法的基本原理 层析法的分类
引言
层析法的发现与进化历史
思想
层析法的基本原理
根据引言内容,是否可以总结 概括出层析法的基本原理？
层析法的分类
第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC）
中间是黄色的叶黄素， 而在下面则是胡萝卜素橙黄色
色带叫作“色谱”， 方法叫色谱法（Chromatography), 层析法 。
概念:
固定相, 流动相,色谱柱
Which is which?
图有误
现代色谱柱
探索与发现 3
1905-1930. Who cares! Why？
论文发表在不 知名的期刊上
1931年德国库恩(Kuhn)重复了茨维特实验, 用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜 素，此后用这种方法分离了60多种这类色素， 1938年他从维生素 B 中分离出 B 6. 1938年的诺贝尔化学奖。
探索与发现 5
气相色谱的产生(GC)
1952年，马丁同詹姆斯(James)，把 LLC技术原理应用在分离气体上。
各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一 类情性载气的气流通过吸收性固体的表 面。混合的气体通过后,在另一端出现时 就分开了。
探索与发现 6
高效液相色谱(HPLC)的应用
20世纪60年代以来,气 相色谱作为分析方法已 经不能满足对生物成分 分析测试的要求。
1941年生物化学家Martin（马丁）和Synge （辛格）把色谱法应用于氨基酸的分离。
将淀粉作为色柱里的填料:淀粉色谱法 滤纸作为载体: 纸色谱法 覆盖了吸附剂表面的并与流动相不发生混溶的 固定液来代替以前的固体吸附剂:Liquidliquid(partition)Chromatography,LLC).
高效液相色谱采用了压 力泵及填有很细的颗粒 高效色谱柱。High Performance Liquid Chromatography.
液相色谱与气相色谱法比较
对象 固定相 流动相 环境 应用
气相
液相
气体,沸点低
液相,沸点高
固体,固体涂层液 固体,固液
惰性气体,起运载 作用
高温
液体，与组分可产 生亲和力
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相， 以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的 一种层析方法。
常用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、 氧化铝、人造沸石和活性炭等。
这种层析方法已成为科研、医学、化 工及发酵等部门常规使用的一种分离手段。
吸附柱层析
一、常用术语 1.层析：以基质为固 定相（柱状或薄层 状），以液体或气体 为流动相，有效成分 和杂质在这两个相中 连续多次地进行分配、 吸附、交换作用，最 终结果是使混合物得 到分离。
1952年：马丁，辛格对分配层析的研究和发现，诺贝尔化学奖
塔板理论
将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏 塔的塔板间移动，在每一个塔板内不同组分分 子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动 相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下 一个塔板，并不断形成新的平衡
Why not Tswett?
相同时期发生在中国大地的事件
1894年：中日甲午战争,侵占台湾。 1897年：德国侵占胶州湾。 1900年：八国联军侵略中国。 1914年：占领青岛,夺取胶州湾。 1931年：九一八事变,占领东北,建立满州国。 1937年：卢沟桥事变。
探索与发现 4 羊毛中的氨基酸分离引言探索与发现 1
1850年德国科学家朗格首先发现了色 谱分离的现象，当他把一种有颜色的 物质滴到一张滤纸上，观察到它们扩 散成一圈圈的圆环。
探索与发现 2
1906年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett）:
将碳酸钙细粉装入玻璃瓶， 石油醚抽提叶子的色素溶液倾入， 接着倒入石油醚洗涤， 柱上部出现了绿色的叶绿素，
吸附柱层析
一、常用术语
2.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体 积。
第一节 吸附层析技术
吸附柱层析
√ 吸附薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
薄层层析(TLC)
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载 体上的基质为固定相，以液体为流动相的一 种层析方法。
常温
化工分析，环境 生物分子，蛋白核 酸，医药
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物物理理、、化化学学性性质质 （如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分 配系数等）的差异使各组分在两相（固定相和流 动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同 的速度移动而达到分离的目的。
层析法的分类
（1）按流动相状态分类：
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数（或溶解度）不同。
离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。
（3）按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。
液相色谱 液-固层析 液-液层析
气相色谱 气-固层析 气-液层析
两种固定相：(固定相不一定是固体) *固体吸附剂作为固定相 *吸附在固体上的液体（硅胶吸附的水作固定相， 以氯仿作流动相，分离羊毛中的氨基酸 ）
（2）按层析原理分类：
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。
薄层层析可根据固定相的种类分为吸附 薄层层析（吸附剂为固定相）、分配薄层层 析（固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为 固定相）和离子交换薄层层析（离子交换剂 为固定相）等。
薄层层析
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，类 似纸层析。
层析技术
√ 第一节 吸附层析技术
第二节 分配层析技术 √ 第三节 凝胶过滤层析技术
第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 √ 第六节 高压液相层析（HPLC）
第一节 吸附层析技术
√ 吸附柱层析 √ 薄层层析
聚酰胺薄膜层析 疏水层析
吸附柱层析
酶的分离纯化层析技术优秀课 件
第四章 层析技术
引言 层析法的基本原理 层析法的分类
引言
层析法的发现与进化历史
思想
层析法的基本原理
根据引言内容,是否可以总结 概括出层析法的基本原理？
层析法的分类
第一节 吸附层析技术 第二节 分配层析技术 第三节 凝胶过滤层析技术 第四节 离子交换层析法 第五节 亲和层析法 第六节 高压液相层析（HPLC）
中间是黄色的叶黄素， 而在下面则是胡萝卜素橙黄色
色带叫作“色谱”， 方法叫色谱法（Chromatography), 层析法 。
概念:
固定相, 流动相,色谱柱
Which is which?
图有误
现代色谱柱
探索与发现 3
1905-1930. Who cares! Why？
论文发表在不 知名的期刊上
1931年德国库恩(Kuhn)重复了茨维特实验, 用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜 素，此后用这种方法分离了60多种这类色素， 1938年他从维生素 B 中分离出 B 6. 1938年的诺贝尔化学奖。
探索与发现 5
气相色谱的产生(GC)
1952年，马丁同詹姆斯(James)，把 LLC技术原理应用在分离气体上。
各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一 类情性载气的气流通过吸收性固体的表 面。混合的气体通过后,在另一端出现时 就分开了。
探索与发现 6
高效液相色谱(HPLC)的应用
20世纪60年代以来,气 相色谱作为分析方法已 经不能满足对生物成分 分析测试的要求。
1941年生物化学家Martin（马丁）和Synge （辛格）把色谱法应用于氨基酸的分离。
将淀粉作为色柱里的填料:淀粉色谱法 滤纸作为载体: 纸色谱法 覆盖了吸附剂表面的并与流动相不发生混溶的 固定液来代替以前的固体吸附剂:Liquidliquid(partition)Chromatography,LLC).
高效液相色谱采用了压 力泵及填有很细的颗粒 高效色谱柱。High Performance Liquid Chromatography.
液相色谱与气相色谱法比较
对象 固定相 流动相 环境 应用
气相
液相
气体,沸点低
液相,沸点高
固体,固体涂层液 固体,固液
惰性气体,起运载 作用
高温
液体，与组分可产 生亲和力
吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相， 以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的 一种层析方法。
常用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、 氧化铝、人造沸石和活性炭等。
这种层析方法已成为科研、医学、化 工及发酵等部门常规使用的一种分离手段。
吸附柱层析
一、常用术语 1.层析：以基质为固 定相（柱状或薄层 状），以液体或气体 为流动相，有效成分 和杂质在这两个相中 连续多次地进行分配、 吸附、交换作用，最 终结果是使混合物得 到分离。