维生素的测定.ppt

➢ 液相色谱推荐条件：
分析柱：C18反相柱 5µm，4.6mmX25Cm； 流动相：甲醇：水=98：2，混匀，临用前 脱气； 紫外检测器波长：300nm; 进样量：20 µL； 流速：1.70mL/min。
➢ 标准曲线的制备
（1）.维生素A和维生素E标准溶液的标定：取上
述配制的维生素A、E的标准溶液按一定的倍数进行 稀释，在下表要求的条件下测定其吸光度，根据其 吸光系数计算其准确浓度。
思考：
1、皂化时加入Vc的作用是什么？
（2）提取：
将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水 分2-3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用 100mL无水乙醚分2次洗皂化瓶及残渣，乙醚 液并入分液漏斗中。轻轻振摇2min，静置分 层，弃去水层。然后每次用约50mL水将乙醚 液洗至中性，需洗4~5次
意义：
（1）可评价食品的营养价值；
（2）开发利用富含维生素的食品；
（3）可以研究食品在不同的加工、储存条件 下的稳定性，进而指导人们制定合理的工艺 条件，减少维生素的损失；
（4）起到监督维生素强化食品的剂量，以防 摄入过多的维生素而引起中毒。
3、维生素的测定方法
➢ 微生物法：基于某种微生物生长需要特定的维 生素，方法特异性强、灵敏度高、不需要特殊 仪器，样品不需经特殊处理，但只能测定水溶 性维生素。
相的一种色谱法。高效液相色谱仪由高压泵、进样 装置、色谱柱、检测器、记录和数据处理装置等部 分组成。高压泵以恒定的流量，从贮液容器吸取作 为流动相的溶剂输送到色谱柱，试样由进样装置导 入，随流动相在色谱柱内进行分离。分离后的组分 进入检测器检测，并用记录仪绘出色谱图，或与其 他数据处理装置相连，由数据处理系统进行数据处 理
测定步骤：提取→净化→氧化→测定
加入淀粉酶的作用:使结合态VB1变为游离态VB1.
5.7.6、维生素B2的测定——荧光法
原理：试样在稀盐酸中水解、酶解，调整 PH值， 过滤除去蛋白质等物质；试样溶液经高锰酸钾氧 化，除去干扰物，再经硅镁吸附剂的柱层析，提 纯的核黄素在波长525nm下发生黄绿色荧光，在 稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。再 加入低亚硫酸钠，将VB2还原成无荧光的物质，然 后再测定试液中残余荧光杂质的荧光，两者相差 即为食品中核黄素所产生的荧光强度。
（5）维生素的含量可用国际单位（IU）表示：
1国际单位（IU）=0.3 ug维生素A =1mg维生素E =0.025 ug维生素D
5.7.3 维生素A的测定（三氯化锑比色法）
原理：
VA+三氯化锑→蓝色物质，于620nm测吸光度，与 标准比较定量。
试剂：
无水Na2SO4、乙酸酐：吸水 乙醚：抽提 乙醇、KOH：皂化反应 三氯甲烷：溶剂 三氯化锑-三氯甲烷：反应试剂 酚酞：用于鉴别洗涤液中有无碱
然后按单体中所规定的方法调制试样液，调制试样液 时，预先加入与调制标准溶液等量的内标物质，然后 按制作标准曲线时的同样条件下得出色谱图，求出被 测成分的峰面积或峰高和内标物质的峰面积或峰高之 比，再按标准曲线来求出被测成分的含量。
内标物的选取原则：能与被测成分完全分离，但其保 留时间又尽可能接近被测成分的稳定的物质。
步骤：
（1）预处理：皂化、提取、洗涤、浓缩 （2）制备标准曲线：用VA标准液绘制，用CHCl3调零。注
意在移入光路前，迅速加入三氯化锑，6秒内测定 (3)样品测定：用样品溶液代替标准液溶液。
说明
(1)萃取时,不要用力过猛,避免发生乳化。
（2）氯仿中必须无水，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干 扰比色测定。
本方法采用内标法定量。把高、低两个浓度的维生素 A、γ-生育酚、a-生育酚、 δ-生育酚及内标苯并芘液混 合，（其内标苯并芘的浓度值相同）将二种浓度的混 合标准进行色谱分析，结果见色谱图。以维生素峰面 积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素的浓度 (ug/mL）为横坐标绘制标准曲线。
➢ 样品分析：
取标准被测成分，按依次增加或减少的已知阶段量， 各自分别加入各单体所规定的定量内标准物质中，调 制成标准溶液。分别取此标准液的一定量注入色谱柱， 根据色谱图取标准被测成分的峰面积或峰高和内标物 质的峰面积或峰高的比例为纵坐标，取标准被测成分 量和内标物质量之比或标准被测成分量为横坐标，制 成标准曲线。
（3）内标溶液：称取苯并芘（纯度98％），用脱醛乙醇 配制成10ug/mL 的内标溶液。
➢ 仪器和设备
（1）高效液相色谱仪带紫外分光检测器。 （2）旋转蒸发器。 （3）高速离心机（带小塑料离心管） （4）高纯氮气。 （5）紫外分光光度计。
➢ 样品处理
（1）皂化：
称取适量样品（含维生素A约3μg，维生素E各异构体 约40 μg ）于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品 分散。加入 5mL100g／L抗坏血酸溶液和 2.0mL苯并芘 内标液，混匀，加 10mL氢氧化钾溶液（50％浓度）， 混匀，于沸水回流30min，使皂化完全，皂化后立即放 入冰水中冷却。
⑶ 不溶于水，溶于有机溶剂，对碱稳定；
➢ VE的性质：又称生育酚，目前已经确认的有
8种异构体，最常见的有α、β、γ、δ-生育酚。 溶于脂溶性溶剂，对热稳定，酸性环境中比碱 性环境中稳定，无氧条件下，对热、光及碱性 环境中也相对稳定。VE广泛分布在各种粮食的 胚和植物油中。
➢ 测定原理：（1）液Leabharlann 色谱的原理：液相色谱是采用液体为流动
测定核黄素的方法还有：微生物法和HPLC法。
讨论：P202 思考题：1、3、4
5.7.7 维生素C（抗坏血酸）的测定
➢ 维生素C的生理功能及性质
维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作 用，所以又称作抗坏血酸。维生素C具有较强 的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱 氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水 解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。 在食品中，这三种形式均有存在，但主要是 前两者，故许多国家的食品成分表均以抗坏 血酸和脱氢抗坏血酸的总量表示。
➢
标准溶液的配制
（1）维生素 A标准液：视黄醇（纯度85％）或视黄醇乙 酸酯（纯度90％）经皂化处理后使用。用脱醛乙醇溶 解维生素A标准品，使其浓度大约为lmg/mL。临用前 用紫外分光光度法标定其准确浓度。
（2）维生素E标准液：a-生育酚（纯度95％），γ-生育酚 （纯纯95％）， δ-生育酚（纯度95％）。用脱醛乙醇 分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为 lmg/mL,临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生 素E的准确浓度。
➢ 化学法：比色法、滴定法
➢ 仪器法：色谱法、荧光法、酶法、免疫法等。 特别是HPLC可用于大多数维生素的测定，并 且在某些条件下可同时分析几种维生素，但分 析费用较高。
➢ 应根据不同的食品基质和条件选择不同的分析 方法
重点讲解的方法： 高效液相色谱法（HPLC法）同时
测定脂溶性维生素A和维生素E 比色法测定维生素A HPLC法测定胡萝卜素 荧光法测定 B1、B2 滴定法和比色法测定维生素C
5.7 维生素的测定
概述 脂溶性维生素A、E的测定 水溶性维生素 B、C的测定
5.7.1 概述
（1）维生素的分类及生理功能 （2）测定的目的和意义 （3）维生素的测定方法
1、维生素的分类及生理功能
➢ 功能： 维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类 小分子有机化合物。它的结构复杂，种类多， 目前已经确认的有30多种，其中有20种被认为 与维持人体健康和促进生长发育是至关重要的。 维生素的主要功能是通过作为辅酶的成分调节 代谢过程，人体对它的需要量极少，但作用非 常大。它一般在体内不能合成或合成量不能满 足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺 乏任何一种维生素都会导致相关新陈代谢的紊 乱，出现各种特有的症状。
分类： 按维生素溶解性能可将它们分成两大类：
❖ 一类是能溶在脂肪或脂溶性溶剂中的， 叫脂溶性维生素（如A、D、E、K等）；
❖ 另一类是能溶解在水中的，叫水溶性维 生素（如B1、B2、B6、C、 B12等）。
2、测定的目的和意义
多数维生素的性质是不稳定的，对光、氧、 热、PH等非常敏感，食物在加工、储存、运输、 销售等一系列环节都可能造成维生素的损失。 为了弥补这种损失，维生素常常作为强化剂在 食品工业的某些产品中使用。
取样品处理液20 µL，用标准溶液同样的条件进行色谱 分析，绘制色谱图。
定性：根据保留时间定性
定量：根据色谱图求出某种维生素的峰面积与内标物 峰面积的比值，以此比值在标准曲线上查得待测维生 素的含量。
计算：
V 100
m 1000
式中： X—某种维生素的含量，mg／100g； p—由标准曲线上查到的某种维生素含量， µg/mL； V—样品浓缩后定容体积，mL； m—样品质量，g。
5.7.2 维生素A、E的测定（HPLC法）
➢ VA的性质：
维生素A是β-紫罗酮环与一元醇所组成的一类 化合物及其衍生物的总称。通常所说的维生素 A是指视黄醇或视黄醇醋酸酯。
⑴ 因有许多不饱和链，故见光易分解；
⑵ 在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。 如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时 间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解， 故测出的比出厂的含量要少；
注意：浓缩提取液时，防止蒸干，避免胡 萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直 射等破坏。
5.7.5、维生素B1的测定——荧光法
原理：硫胺素（VB1）在碱性铁化钾溶液中被氧 化为嘧噻色素，在紫外线照射下，嘧噻色素发出 荧光。在给定条件下，以及没有其他荧光物质干 扰时，荧光强度与嘧噻色素成正比，即与溶液中 硫胺素量成正比。 试样在硫酸作用下,加热提取VB1.冷却后用淀粉酶在 pH=4.5时处理使VB1分离如果样品中含杂质过多， 应经离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然 后以所得溶液做测定。
色谱图：某一波长下各个不同时刻的吸光度值描点作 图。