Elisa原理及应用解读

•竞争法
当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结 合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模 式。
七.ELISA的特点：
•灵敏度高：ELISA测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。由于 酶的催化效率很高，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生 可供观察的显色反应，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方 法达到很高的敏感度。 •特异性高：ELISA的特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体 的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点 之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原 抗体反应具有高度的特异性 •准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结 果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于 食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。
酶
底物
显色反应 测定波长
辣根过氧化物酶 邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑 啉磺酸-6)铵盐
碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
黄色 红色
492 460 449 425 642
400 500
一.Elisa的发展
免 疫 标 记 技 术
免疫荧光技术（IFA）
放射免疫测定法（RIA）
酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫酶测定法 （EIA）
酶免疫组化法
二.ELISA的定义
是一类常用的免疫酶技术，将已知的抗原或抗体吸附在固 相载体表面，用酶标记抗原或抗体，使抗原抗体反应在固相 表面进行，检测液体中未知抗体或抗原的方法。
三.ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标 记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫活性，酶 标记的抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载 体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成 的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载 体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。 加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物 的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进 行定性或定量分析。
在ELISA方法中有三个必要的试剂： • 固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”（immunosorbent） • 酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate） • 酶反应的底物（显色剂）
•双抗体夹心法
•间接法 •竞争法
•捕获法
•亲和素-生物素-ELISA法
•双抗体夹心法
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，先将已知抗体连接在固 相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待 测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体原成正比。
•间接法
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗 体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体， 故称为间接法。
五.ELISA的应用
ELISA法在生物医学各领域的应用范围概括为四个 方面： •免疫酶染色各种细胞内成份的定位
•研究抗酶抗体的合成
•显现微量的免疫沉淀反应 •定量检测体液中抗原或抗体成份
六. ELISA类别
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体，根据试剂 的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种 不同类型的检测方法，主要类型有：
八.ELISA实验中使用的仪器
Leabharlann Baidu
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葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
黄色 深蓝色
405 420
360,450 420
β-Ｄ－半乳糖苷 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG) 荧光 酶 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 黄色
四.ELISA的基本方法
基本实验流程：
孵育 洗涤
微孔板
包被抗体
加样品(抗原)
孵育 洗涤
孵育
比色
加酶联二抗(辣 根过氧化物酶)
加底物(邻苯 二胺)显色
加终止液 (硫酸溶液)
四.ELISA的基本方法
包被抗体的酶 标反应板 加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去未结 合的其他物质
加酶标抗体生成 抗体-待测抗原-酶标记抗体 的复合物
彻底洗涤未结 合的酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行抗原的 定性或定量测定
酶联免疫吸附法
（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）
内容
• • • • • • • • 一.Elisa的发展 二.ELISA的定义 三.ELISA的原理 四.ELISA的基本方法 五.ELISA的应用 六.ELISA类别 七.ELISA的特点 八.ELISA实验中使用的仪器