组织提取RNA步骤
sds法提取组织rna步骤
sds法提取组织rna步骤SDS法是一种用于提取组织中RNA的常用方法,它可以有效地去除蛋白质和其他杂质,并保持RNA的完整性。
下面是使用SDS法提取组织RNA的一般步骤:1.组织采样:首先,从您感兴趣的组织中采集样品。
可以选择常规的研究动物组织,如小鼠或大鼠的脑、肝脏等,也可以选择与您的研究相关的特定组织。
2. 样品处理:将采集的组织样品立即放入含有RNA保护剂(如RNAlater)的离心管中,并迅速冷冻保存在液氮中,以避免RNA的降解。
您还可以直接将组织样品置于离心管中,然后立即冷冻。
3.组织破碎:将冷冻的组织样品快速研磨成细粉末,并在冰上迅速加入SDS试剂,即一种非离子表面活性剂。
SDS有助于去除蛋白质,并释放RNA。
4.RNA溶解:将组织破碎后的样品在高温条件下(通常在60-70°C)孵育一段时间,以使SDS充分溶解,蛋白质释放并RNA保持完整。
5.脱脂:加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合物,并轻轻混合,以去除脂质、蛋白质和其他杂质。
混合物将产生两个相,上层为水相(含RNA),下层为有机相(含脂质和蛋白质)。
用玻璃针或移液管将上层水相转移至新离心管中。
6.沉淀RNA:向新的离心管中加入等体积的异丙醇,再次混合。
异丙醇可将RNA沉淀出来。
离心管以最高速度离心(通常在4°C下)10-15分钟。
7.去除异丙醇:将离心管倾斜,轻轻倾倒异丙醇。
使用70%乙醇重悬RNA沉淀,通过洗涤去除残留的异丙醇。
8. 干燥RNA:通过将离心管在室温下挥发乙醇的方法进行干燥。
干燥后的RNA易溶于RNase‐free水中。
9. RNA质量评估:使用紫外吸收光谱(如NanoDrop)或凝胶电泳等方法来评估提取的RNA的浓度和完整性。
确保提取的RNA是高质量和完整的,以便后续分析。
使用SDS法提取组织RNA时,需要注意以下几点:-在样品处理和样品破碎过程中,要尽量避免RNA的降解。
保持样品的低温和快速操作对于RNA的完整性至关重要。
组织细胞总RNA提取步骤及方法
组织细胞总RNA提取步骤及方法细胞总RNA提取是一种常用的实验技术,用于分离和提取细胞内的总RNA。
以下是一种常用的细胞总RNA提取方法的步骤:1.收集细胞样品:根据实验需要,收集适量的细胞样品。
可以选择培养细胞、悬浮细胞或组织细胞等。
2. 细胞溶解:将细胞样品转移到离心管中,并使用适当的缓冲液(如TRIzol)进行细胞溶解。
缓冲液中的离子和表面活性剂能够破坏细胞膜,使RNA释放到溶液中。
3.加入氯仿:向细胞溶解液中加入等体积的氯仿,并轻轻倒置离心管混匀。
氯仿会与缓冲液中的酚类结合,形成有机相和水相。
4.离心分离:将混合液在高速离心下离心10-15分钟,使其分成有机相(上层)、界面层(中间层)和水相(下层)。
RNA主要分布在界面层和水相之间。
5.收集上清液:使用滴管、移液器等工具小心收集上层的有机相液体,并转移到新的离心管中。
这一步的目的是尽可能减少界面层和下层的干扰物。
6. 沉淀RNA:将等体积的异丙醇(isopropanol)加入上清液中,并轻轻倒置离心管混匀。
异丙醇能够沉淀RNA,将其从溶液中去除。
7.离心分离:将混合液在高速离心下离心10-15分钟,使RNA沉淀在离心管底部形成一个白色沉淀。
8.去除上清液:小心将上清液倒掉,避免损失RNA沉淀。
9.RNA洗涤:使用70%乙醇洗涤RNA沉淀,将沉淀中的杂质去除。
10. 重新溶解:将洗涤后的RNA沉淀用RNase-free水或缓冲液中重新溶解,以便后续实验使用。
注意要避免酶的污染。
以上是一种常见的细胞总RNA提取方法的步骤。
这个方法简单、操作方便,并且能够高效地提取细胞内的总RNA。
根据实验需要,也可以根据具体步骤来进行微调和改进。
rna提取的流程和方法
rna提取的流程和方法RNA提取的流程和方法一、RNA 提取流程1、实验准备在RNA提取前,需要准备一些实验用品,如RNA提取试剂盒、干净的Eppendorf管、试剂管盒等。
2、组织采集从实验材料(如组织)中采集适量样品,将其添加到实验管中,并用恰当的液体(如液氮)固定。
3、细胞分离和消化将固定过的样品放置在消化槽中,并加入相应蛋白酶(常用的蛋白酶有 Protease、 DNase I 等)。
待消化完成后,细胞就可以分离出来,得到小分子和线粒体RNA。
4、细胞悬液处理细胞和消化液将放置在分离机中,以速度较快的离心来分离细胞悬液和上清液,获得纯净的细胞悬液,以及细胞内的RNA。
5、病毒筛选针对实验中可能存在的病毒,在RNA提取后期,可以采用专门的病毒筛选技术来检测病毒的存在与否,用以保证实验结果的可靠性。
6、RNA 提取利用加热或冷冻方法来预处理细胞悬液,再加入性质非常活跃的提取试剂,分离出RNA,最后经酶抑制剂处理,即可实现RNA的提取。
7、RNA 质量检测采用实时定量荧光PCR(qPCR)或定量实时荧光 PCR(qRT-PCR)技术,对提取出来的RNA进行质量检测,以确定RNA的质量是否满足后续研究的要求。
8、实验结束实验完成后,将所有的实验用品清洗干净,并完成实验报告记录和记录实验结果,结束实验。
二、RNA 提取方法1、常规方法(1)分离法利用细胞成分的不同溶解度,将细胞内的RNA和DNA分离出来,如甲醇分离法、混合洗涤法、膜过滤法等,然后将DNA除去,即可得到纯化的RNA样品。
(2)磁珠法采用特定的磁珠技术,通过磁场的作用,将RNA结合在磁珠上,然后加入洗涤液,脱除磁珠上的杂质和有害物质,最终得到纯化的RNA样品。
2、新型方法(1)多尺度细胞抗分离法利用细胞的多尺度的抗性,通过不同直径的磁珠把细胞内的RNA 分离出来,可以节约实验时间,并有效提高细胞内RNA的收量、纯度和活性。
(2)膜过滤法采用膜过滤的方法,可以快速准确的将细胞内的RNA纯化,提高RNA的收率,并保护RNA免受外界环境的破坏,为实验提供良好的保护条件。
trizol组织提取rna步骤
trizol组织提取rna步骤Trizol组织提取RNA步骤引言:RNA是一种重要的生物大分子,它在生物体内起着基因表达和调控的重要作用。
为了研究RNA的结构和功能,科学家们经过不断的探索和研究,发展出了一系列有效的RNA提取方法。
其中,Trizol 组织提取RNA方法是目前应用较广泛的一种方法,本文将详细介绍Trizol组织提取RNA的步骤。
步骤一:样品准备需要准备好待提取RNA的组织样品。
样品可以是动植物组织,也可以是细胞。
样品应该新鲜、完整,并且需要在提取RNA前保存在液氮中,以保持RNA的完整性。
步骤二:组织破碎将样品从液氮中取出,放入细胞破碎液中。
细胞破碎液可以是Trizol试剂,也可以是其他适用的细胞破碎液。
然后,使用离心机将样品离心,以破碎组织细胞,并释放RNA。
步骤三:加入氯仿将破碎的组织样品转移到离心管中,加入适量的氯仿。
氯仿可以与Trizol试剂中的异丙醇和酚形成两相体系,用于分离RNA。
步骤四:离心分离将离心管盖紧,并放入离心机中进行高速离心。
离心的目的是将样品中的RNA分离到上清液中,底物中会残留DNA和蛋白质。
步骤五:收集上清液将离心管从离心机中取出,小心地将上清液转移到一个新的离心管中。
上清液中含有RNA,可以继续进行后续的提取。
步骤六:沉淀RNA向上清液中加入等体积的异丙醇,使其浓度达到70%。
然后,轻轻地摇晃离心管,使RNA与异丙醇充分混合。
接下来,将混合液放置在-20°C的冰箱中,使RNA沉淀。
步骤七:离心沉淀将离心管放入高速离心机中,进行高速离心。
离心的目的是使RNA 沉淀到离心管底部。
步骤八:去除上清液小心地将上清液倒出,注意不要损坏沉淀的RNA。
可以使用70%乙醇进行洗涤,以去除残留的盐和污染物。
步骤九:干燥RNA将离心管中的RNA沉淀放置在室温下,使其自然干燥。
注意不要过度干燥,以免影响RNA的质量。
步骤十:溶解RNA在干燥的RNA沉淀中加入适量的去离子水或RNase-free水,轻轻摇晃或振荡离心管,使RNA溶解。
RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南
Trizol法RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南(破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA)1 试剂:三氯甲烷(氯仿),异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水、Trizol reagent2 材料与仪器:EP管匀浆器移液枪漩涡振荡器低温高速冷冻离心机冰袋电泳仪琼脂糖凝胶超净工作台3 操作步骤:3.1 准备工作A 玻璃匀浆器、75℅乙醇预冷,离心机预冷至4℃打开超净工作台紫外灯15分钟以上B 用酒精擦拭台面EP管标记3.2. 匀浆处理1 取一定量的纯化过的孢子悬浮液,12000rpm ,离心5min,弃上清a 或者用匀浆仪进行匀浆处理,悬浮液不经离心,直接加0.5ml Trizol reagent于冰上充分匀浆悬浮液样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.,然后再加入0.5ml Trizol 冲洗匀浆器,转移至1.5ml EP管中b 直接在悬浮液中加入Trizol裂解细胞,加1ml Trizol.用取样器吹打几次.(离心取细胞,每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。
加Trizol前不要洗涤细胞,以免降解mRNA。
一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理)2 1ml Trizol Reagent,震荡混匀3. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。
4. 可选步骤:4 ℃12 000rpm离心10min,取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂,应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
5. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,在漩涡振荡器上震荡15s,室温放置3min。
如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替。
6. 4 ℃12 000rpm,离心10-15min,样品会分成三层:红色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂的60%)转移到新管中。
提取rna的步骤
提取rna的步骤
提取RNA是分子生物学研究中的重要步骤之一,它通常用于研究基因表达、基因调控和遗传变异等过程。
以下是提取RNA的基本步骤: 1.样品采集和处理:根据实验要求选择合适的样品,如细胞、组织、血清、尿液等。
采集后,立即加入RNA保护剂,并在低温条件下保存。
2.细胞破碎:使用机械方法或化学方法将细胞破碎,如用高速离心机、超声波器或液氮冷冻等方法。
3.RNA提取:通过离心、溶解、洗涤等步骤,将RNA分离出来。
通常使用酚/氯仿(Trizol)法、硅胶柱法或磁珠法等方法提取RNA。
4.纯化RNA:将提取的RNA经过凝胶净化或硅胶柱纯化,去除DNA、蛋白质等杂质,得到高质量的RNA样本。
5.RNA定量:使用紫外吸收光谱或荧光分析仪等方法测定RNA的浓度和纯度。
6.保存RNA:将RNA保存在-80°C的低温条件下,或加入RNase 抑制剂等物质,避免RNA的降解和污染。
以上是提取RNA的基本步骤,不同实验需要根据具体要求进行适当调整。
- 1 -。
rna提取实验步骤
RNA提取实验步骤如下:
●匀浆处理:
●组织:将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆
仪进行匀浆处理。
●单层培养细胞:直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即
3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。
●细胞悬液:离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107
细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。
每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
2-8℃10000×g离心15分钟。
收集上清液。
使用酒精洗涤RNA,以去除离心管内残留的试剂和盐。
最后利用2-甲基硫氰酸盐(MECT)溶液进行脱水,使RNA干燥而不影响RNA的完整性。
此外,如果是从动物组织中提取RNA,还需要使用DNase I处理RNA,以去除残留的DNA。
如果是从细菌中提取RNA,需要先进行细菌的裂解和细胞壁的破碎。
同时需要注意,整个提取过程需要严格控制RNA酶的污染。
rna提取各步骤原理
rna提取各步骤原理RNA提取是分子生物学研究中的一项重要技术,用于从细胞或组织中提取RNA分子。
RNA提取的过程包括细胞破碎、RNA溶解、RNA纯化和RNA沉淀等步骤。
下面将分别介绍这些步骤的原理。
1. 细胞破碎细胞破碎是RNA提取的第一步,其目的是将细胞的细胞膜和细胞壁破坏,释放细胞内的RNA分子。
常见的细胞破碎方法有机械破碎、化学破碎和冻融破碎等。
机械破碎利用高速离心或超声波等力量将细胞破碎,化学破碎则通过加入细胞破碎缓冲液,使细胞发生溶解和破裂,冻融破碎则是通过反复冻结和融化来破坏细胞。
2. RNA溶解RNA提取的第二步是将细胞破碎后的RNA溶解在溶解液中,使其能够在后续的纯化步骤中更好地被提取出来。
RNA溶解液一般包含酸性物质和蛋白酶,酸性物质可以中和细胞碱性成分,使RNA分子得以溶解,而蛋白酶则可以降解细胞内的蛋白质,减少RNA与蛋白质的结合。
3. RNA纯化RNA提取的第三步是将RNA从其他细胞成分中纯化出来,以获得较纯的RNA样品。
RNA纯化的常见方法有酚/氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
酚/氯仿法通过酚和氯仿的密度差异将RNA分离出来,硅胶柱法是利用硅胶柱的亲合性将RNA吸附在硅胶表面,磁珠法则利用磁珠表面的亲合配体与RNA的亲和性将RNA捕获。
4. RNA沉淀RNA提取的最后一步是将纯化后的RNA进行沉淀,以去除残余的杂质并集中RNA分子。
RNA沉淀常使用乙醇沉淀法,即在加入乙醇的条件下,使RNA分子与乙醇结合形成可见的沉淀物,然后通过离心将沉淀物沉淀下来。
沉淀后的RNA可以通过去除乙醇并溶解在适当的缓冲液中,得到最终的RNA样品。
总结起来,RNA提取的步骤包括细胞破碎、RNA溶解、RNA纯化和RNA沉淀,每一步都有其特定的原理和方法。
通过这些步骤,可以从细胞或组织中提取出纯度较高的RNA样品,为后续的RNA 分析和研究提供基础。
RNA提取技术的发展不仅在分子生物学研究中具有重要意义,也在临床诊断和药物研发等领域发挥着重要作用。
组织rna提取步骤
组织rna提取步骤组织RNA提取是一项重要的实验技术,它可以从细胞或组织中提取出RNA,并用于后续的分子生物学实验。
以下是组织RNA提取的详细步骤:准备工作在开始实验之前,需要准备一些必要的试剂和设备,包括:- RNase-free水- 75%乙醇- RNase AWAY- TRIzol试剂- 液氮或冰浴- 超离心机和离心管样品处理在进行组织RNA提取之前,需要对样品进行处理。
这通常包括以下步骤:1. 用PBS缓冲液洗涤样品,以去除表面上的血液和其他污染物。
2. 将样品切碎并放入离心管中。
对于某些样品(如肝脏),需要使用组织破碎器进行破碎。
3. 在液氮中或冰浴中将样品冷冻。
RNA提取接下来是从组织中提取RNA的步骤:1. 加入TRIzol试剂到离心管中,并彻底混合。
TRIzol试剂可以破坏细胞膜并释放RNA。
2. 将混合物离心,以分离RNA。
3. 将上清液转移至新的离心管中,并加入等体积的75%乙醇。
这将沉淀RNA。
4. 再次离心,以分离RNA沉淀。
5. 去除上清液,并用RNase-free水洗涤RNA沉淀。
6. 使用RNase AWAY去除可能存在的RNase污染。
RNA质量评估为了确保提取的RNA质量良好,需要进行一些质量评估步骤:1. 使用NanoDrop或其他光谱仪检测RNA的浓度和纯度。
2. 进行琼脂糖凝胶电泳,以检测RNA是否完整,并确定是否存在DNA或蛋白质污染。
总结组织RNA提取是一项重要而复杂的实验技术。
正确地执行每个步骤非常关键,以确保提取到高质量的RNA。
通过准备工作、样品处理、RNA提取和RNA质量评估等步骤,可以成功地从组织中提取出高质量的RNA。
提rna步骤
提rna步骤RNA是一种重要的生物分子,它在细胞内起着传递遗传信息、调节基因表达等重要作用。
为了研究RNA的功能和机制,科学家们需要对RNA进行提取和纯化。
本文将介绍RNA提取的步骤和注意事项。
一、材料准备1.细胞样本:可以是组织、细胞培养物等。
2.离心管:用于分离样本中的细胞。
3.离心机:用于离心细胞。
4.细胞裂解液:可以是Trizol、RNAiso等商用试剂,也可以是自制的裂解液。
5.异丙醇:用于沉淀RNA。
6.洗涤液:可以是75%的乙醇、70%的乙醇等。
7.去离子水:用于稀释试剂和溶解RNA。
8.琼脂糖凝胶:用于纯化RNA。
二、提取步骤1.制备样品将细胞样本收集到离心管中,离心机离心10分钟,将上清液倒掉,留下细胞沉淀。
2.细胞裂解加入适量的细胞裂解液,使细胞完全裂解,释放RNA。
3.分离RNA加入等体积的异丙醇,混匀,离心10分钟,收集上清液,其中含有RNA。
4.沉淀RNA将上清液加入等体积的异丙醇,混匀,离心10分钟,收集沉淀,其中富含RNA。
5.洗涤RNA用75%的乙醇洗涤RNA沉淀,去除杂质。
6.溶解RNA用去离子水溶解RNA沉淀,制备1mg/ml的RNA溶液。
7.纯化RNA将RNA溶液加入琼脂糖凝胶管中,离心10分钟,收集上清液,其中含有纯化的RNA。
三、注意事项1.样品的处理要快速,避免RNA被降解。
2.细胞裂解液的选择要根据实验需要进行优化。
3.异丙醇的体积要与上清液相等,否则RNA沉淀不完全。
4.洗涤RNA时要用足够的乙醇,否则杂质无法完全去除。
5.制备RNA溶液时要使用去离子水,避免RNA被污染。
6.琼脂糖凝胶的选择要根据RNA大小和纯度要求进行优化。
7.操作过程中要注意无菌操作,避免RNA被污染。
总之,RNA提取是RNA研究的基础工作,正确的提取步骤和注意事项能够保证RNA的纯度和完整性,为后续实验提供可靠的基础。
rna提取 步骤
rna提取步骤RNA提取是分子生物学实验中常用的一项技术,它可以从细胞或组织中提取RNA分子,为后续的RNA分析和研究提供基础。
RNA 提取的步骤包括样品收集、细胞破碎、RNA溶解、纯化和质量检测等。
下面将详细介绍RNA提取的步骤。
1. 样品收集在进行RNA提取之前,首先需要收集合适的样品。
样品可以是细胞培养物、动物组织或植物组织等。
在收集样品时,要注意避免RNA的降解。
可以将样品存储在RNA保护液中,或者迅速冷冻保存。
2. 细胞破碎将样品中的细胞破碎是RNA提取的关键步骤之一。
常用的方法有机械破碎、化学破碎和酶解等。
机械破碎可以通过离心或超声波处理来实现,化学破碎则是通过加入蛋白酶K等蛋白酶来破坏细胞膜,而酶解则是利用特定的酶来降解细胞壁和细胞膜。
3. RNA溶解破碎后的细胞中存在着大量的RNA酶,这些酶会降解RNA分子。
因此,在提取RNA之前,需要添加RNase抑制剂来阻止RNA的降解。
同时,还需要加入蛋白酶来破坏蛋白质,使RNA与蛋白质分离。
4. 纯化为了从混合物中分离出RNA分子,需要进行纯化步骤。
常用的纯化方法有酚/氯仿法、硅胶柱法和磁珠法等。
酚/氯仿法主要是通过酚和氯仿的密度差异来分离RNA和其他杂质。
硅胶柱法则是利用硅胶膜上的亲水性来吸附RNA分子。
磁珠法则是通过磁珠上的特定配体与RNA的结合来实现分离。
5. 质量检测提取到的RNA需要进行质量检测,以确保其完整性和纯度。
常用的检测方法有琼脂糖凝胶电泳、比色法和荧光测定等。
琼脂糖凝胶电泳可以根据RNA的大小和形态进行分析。
比色法和荧光测定则可以用来测定RNA的浓度和纯度。
RNA提取是一项复杂的实验技术,需要经过样品收集、细胞破碎、RNA溶解、纯化和质量检测等步骤。
每一步都需要仔细操作,以确保提取到高质量的RNA样品。
RNA提取的成功与否直接影响到后续的RNA分析和研究结果,因此在实验中应尽可能遵循标准操作规程,以获得准确可靠的实验结果。
Trizol法提取总RNA(细胞和组织)
Trizol法提取总RNA
1、①提取组织RNA时,研钵高温高压灭菌,每50-100mg组织液氮研磨后,将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中,充分混匀(粉末总体积不能超过Trizol体积的10%)用1ml Trizol 试剂裂解;
②提取细胞RNA时,每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解,反复吹打或剧烈振荡;
2、将上述裂解液,室温15-30℃静置5min;
3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿,在手中用力振荡15s,室温放置2-3min后,12000r离心15min(2-8℃);
4、取上层水相置于新EP管中,按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,室温放置10min,12000r离心10min(2-8℃),弃上清;
5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇(4℃),涡旋混合,进行洗涤,7500r离心5min(2-8℃),弃上清;
6、将RNA沉淀在室温下自然干燥(5-10min);
7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀;
8、取出1μl,稀释10倍,测定RNA浓度并记录;
9、进行反转录或分装保存于-80℃。
Trizol法提取组织总RNA步骤
1.研磨制样:先向研钵中加入少量液氮,等液氮挥发使研钵预冷。
再向研钵内倒入适量液氮。
从-70度冰箱取出组织,用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中。
迅速研磨组织块,成粉末时加入1ml的trizol,继续研磨,可看到粉末成浆,由浓变稀,直至组织样全部溶解,用移液枪吸到无酶EP管。
2. Trizol法提取RNA
1) 室温静置3-10min,使蛋白质变性;
2) 加入1/4~1/5体积的氯仿,颠倒震荡1min,室温静置3-5min,静置分层,然后4℃离心,12000rpm,5min。
(核蛋白复合体彻底裂解)
3) 吸取上清至无酶的EP管中,加入等体积的酚:氯仿,颠倒震荡1min,室温静置3-5min,静置分层,然后4℃离心,12000rpm,5min,取上清。
若是细胞RNA提取可只加等体积氯仿抽提一次,但对于组织一般都要重复该步骤,至没有蛋白层为止,一般抽提两次。
(离心后会分为三次:上层:水相,中间层:DNA,下层:蛋白。
为了降低水相和有机相分界处DNA污染,不要吸取水相的最下层)4) 加入等体积的预冷的异丙醇,颠倒混匀,冰上静置30min,然后4℃离心12000rpm,30min,弃上清。
(此步骤主要是充分沉淀RNA,然后收集。
故步骤中的冰置30min,也可以是在-20°放置半小时以上,甚至过夜)
5) 加入100ul 70%乙醇,将沉淀吹起来,注意不要吹散,然后4℃12000rpm,5min。
6) 弃上清,空气中挥发乙醇,至壁上无液滴。
7) 加入适量DEPC水,(一般为20ul)溶解。
8) 分光光度计检测RNA浓度和OD值,将Total RNA稀释至1ug/ul,备用。
sds法提取组织rna步骤
sds法提取组织rna步骤sds法(Sodium Dodecyl Sulfate法)是一种常用的方法,用于提取和纯化组织RNA。
该方法是通过使用SDS(十二烷基硫酸钠)来裂解细胞膜和核酸蛋白质复合物,然后经过一系列步骤,最终得到纯化的组织RNA。
以下是使用SDS法提取组织RNA的步骤:1. 组织样品的收集和处理:- 收集组织样品,并尽快将其置于离心管中。
- 快速将组织冷冻在液氮中,以防止核酸酶的活性。
2. 组织样品的裂解:- 加入合适的SDS缓冲液(通常包含Tris-HCl缓冲液,SDS和EDTA),用于裂解细胞膜和蛋白质。
- 使用坚硬的管型研钵或研针,彻底研磨组织样品,以确保融合细胞膜和核酸蛋白质复合物的彻底裂解。
- 确保操作过程中的样品和工具都是无核酸酶的。
3. 蛋白质消化:- 加入蛋白酶K(proteinase K),以消化蛋白质并去除DNA。
- 将样品在适当的温度(通常在55-65摄氏度)下孵育,以保持蛋白酶活性。
4. 酚-氯仿提取:- 加入酚-氯仿等体积比的混合液,并充分混合。
- 离心样品,以分离有机相和水相。
- 转移水相(含RNA)至新的管中。
5. RNA沉淀和洗涤:- 加入等体积的异丙醇,在室温下静置数分钟,使RNA沉淀。
- 离心样品,使RNA沉淀,并去除上清液。
- 使用70%乙醇洗涤RNA沉淀,以去除残留的盐和其他杂质。
- 空干RNA沉淀,或使用空压干燥器去除乙醇。
6. RNA溶解和保存:- 加入适当的RNase-free溶解液(如DEPC水或RNase-free缓冲液)溶解RNA。
- 使用琼脂糖凝胶电泳或分光光度计检测RNA浓度和质量。
- 根据实验要求,将RNA保存在低温(通常-80摄氏度)中,以防止降解。
这些步骤提供了一种常见的用于提取和纯化组织RNA的方法。
然而,每个实验室可能会对具体步骤和试剂的使用略有不同,以适应其研究需求。
另外,请注意,SDS法是一种裂解细胞膜和核酸蛋白质复合物的方法,对RNA的完整性可能有一定影响。
trizol法提取rna步骤
trizol法提取rna步骤TRIzol法提取RNA步骤RNA是一种重要的生物大分子,具有多种功能。
在研究生物学、医学等领域中,需要从细胞或组织中提取RNA。
TRIzol法是一种常用的RNA提取方法,其原理是利用TRIzol试剂将细胞或组织中的RNA溶解,并与其他生物大分子分离。
本文将详细介绍TRIzol法提取RNA 的步骤。
材料准备- TRIzol试剂- 高纯度异丙醇- DEPC水- RNase-free微量离心管和移液器- 1.5 mL离心管- 无菌手套和口罩- 冰桶和冰块步骤一:样品采集首先需要采集样品,可以是细胞或组织。
对于细胞,可以使用离心机将其沉淀;对于组织,则需要切碎并加入适当量的PBS缓冲液。
步骤二:样品裂解将采集到的样品加入适量的TRIzol试剂,并使用移液器充分混合。
然后使用高速离心机将样品离心10分钟,使其裂解。
步骤三:RNA分离将上述裂解物转移至新的离心管中,并加入等体积的异丙醇。
充分混合后,使用高速离心机离心10分钟,使RNA沉淀到底部。
步骤四:RNA洗涤将上述沉淀物转移至新的离心管中,并加入75%的乙醇。
充分混合后,使用高速离心机离心5分钟,去除残留的TRIzol试剂和异丙醇。
步骤五:RNA溶解将上述沉淀物转移至新的离心管中,并加入适量的DEPC水。
充分混合后,在65℃下孵育10分钟,使RNA完全溶解。
步骤六:RNA保存将溶解后的RNA转移至RNase-free微量离心管中,并存放在-80℃冰箱中保存。
注意事项- 在操作过程中要穿戴无菌手套和口罩,以避免污染。
- TRIzol试剂具有强烈腐蚀性,需注意安全操作。
- 所有使用到的器材和试剂都要事先消毒处理。
- 操作过程中需保持低温环境,以避免RNA降解。
- RNA提取后需立即存放在-80℃冰箱中,以避免RNA降解。
组织中总RNA的提取
组织中总RNA的提取实验前:离心机预冷(4℃),干烤过的研钵,杵,(用锡箔纸包着干烤)主要实验在铺着报纸的桌上进行。
操作要求戴口罩,手套要求新的,枪头,EP管全部无酶。
一、1)液氮研磨,组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软(仅可软一次),乘它是软的,把它压平,继续研磨。
若液氮挥发完要迅速补充液氮,一直让样品保持冻着的状态。
磨到差不多的时候,聚组织于一堆,加1000mlTrizol在它们上面。
锡箔纸盖住研钵室温静置10Min左右,至混合液溶解。
注意:最好不要等组织变软,变软后RNA容易降解。
但是软一次,实验证明没事的,压平后很容易磨碎。
其实冻着状态更容易磨碎。
磨的时候,小心组织飞掉。
飞掉的话,我们是捡回来的。
研磨这步很重要,研磨既要充分又不能让RNA降解,磨到粉末状。
按50-100mg 组织/ml Trizol 加入Trizol。
Trizol裂解细胞,促使核蛋白复合体解离,而且有效抑制RNase活性。
2)吸入混合液于无酶的1.5mlEp管中,再加200ul(一般)氯仿,用手剧烈震荡30s,室温放置15Min。
注意:加氯仿使RNA进入离心后的上层液体中3)4℃12000g离心15Min4)取上清于另一个EP管中,再加200ul氯仿,吹打混匀,同样条件再离心一次。
5)吸上清于另一个EP管中注意:不可全吸,防止吸入下面的杂质。
6)加入等体积的异丙醇(一般500ul),室温放置5—10Min。
注意:此步沉淀RNA. 也可以放入-20度,先吃饭。
7)4℃12000g离心10Min 弃上清8)加入1ml 75%乙醇,温和震荡得沉淀9)4℃8000g 离心5Min 尽量弃上清10)室温干燥5---10Min(倒扣于滤纸上,EP管盖子打开)11)10ul的DEPC水溶解,吹打混匀。
12)19ulDEPC水于另一支EP管中,从11)中取1ul于其中吹打混匀测OD值。
11)中的RNA-80度保存。
提取RNA及PCR步骤
一、提取组织RNA1.准备好冰盒、1.5mlEP管(无RNA酶)、剪刀及镊子(需消毒,再用灭菌纯水和DEPC 水洗净)、钻头、灭菌纯水等。
2. 取出冻存管,剪取约0.5cm放于EP管。
3. 即刻加1ml trizol,剪碎至无可见微粒,静置5-10min4. 加0.2ml 氯仿,盖紧EP管,上下倾倒,混匀15s, 15-30℃静置2-3min5. 离心12,000g*15min, 2-8℃6. EP管内分三层,取上层液相置于新EP管7. 加0.5ml异丙醇,上下颠倒混匀,15-30℃静置10min8. 离心12,000g*10mim, 2-8℃9. 弃上清(不用吸净残液),加1ml 75%乙醇清洗沉淀(乙醇用前需4℃预冷)10. 离心10000/7500g*5min, 2-8℃11. 去上清(需吸净残液),干燥RNA(超净台内风干至白色变透明状,约1h以上), 加10—12ul DEPC水解(约1h以上),测浓度,-80℃保存。
PS:1.所用枪头、EP管、DEPC水、纯水、剪刀、镊子均需灭菌。
2.75%无水乙醇用前需4℃预冷。
3.若最后提取出的RNA量多,可加30ulDEPC水溶解;若难以溶解,可置于55℃水浴加热。
4.破碎:取组织勿过多,否则难以破碎,亦难以提取RNA;一个样品破碎过后需清洗,顺序为:酒精棉球擦洗→DEPC水洗→拆分清理→纯水洗→棉球吸去钻头残液。
5. 破碎仪的使用:打开前先保证已调于低档,将钻头浸没于样品中,切忌在空气中空转,从低到高慢调,同时上下轻移样品,注意力度控制,避免液体飞溅误伤;同时注意听破碎时的声音,若有尖锐声音发出,说明有异物卡住钻头,需停止查看。
二、提取细胞RNA1. 细胞加1ml trizol 裂解5min, 15-30℃2. 加0.2ml 氯仿,盖紧EP管,上下倾倒,混匀15s, 15-30℃静置2-3min其余步骤参见提取组织RNA的第5步开始PS:1. 新EP管需用无RNA酶EP管。
sds法提取组织rna步骤
sds法提取组织rna步骤摘要:1.提取组织RNA 的背景和重要性2.SDS 法提取组织RNA 的步骤详解3.SDS 法提取组织RNA 的优点与注意事项4.总结正文:1.提取组织RNA 的背景和重要性在生物科学研究中,RNA 提取是一项重要的实验技术。
RNA 是生物体内遗传信息传递的重要媒介,对于研究基因的表达和调控具有重要意义。
从组织中提取RNA,可以进行转录组分析、基因表达差异分析等研究。
而SDS 法提取组织RNA 是一种常用的方法,因其操作简便、提取效率高而受到广泛欢迎。
2.SDS 法提取组织RNA 的步骤详解SDS 法提取组织RNA 的具体步骤如下:(1) 准备试剂:准备RNA 提取试剂盒,其中包含SDS、NaCl、RNA 酶抑制剂等。
(2) 组织处理:将新鲜组织剪碎,加入适量RNA 提取试剂,混合均匀。
(3) 离心:将混合液转移到离心管中,进行离心,离心力可以根据实际需要调整。
(4) 混合:将离心后的上清液与等体积的氯化钠溶液混合。
(5) 离心:再次将混合液转移到离心管中,进行离心,离心力可以根据实际需要调整。
(6) 收集RNA:将离心后的上清液收集起来,即为提取的RNA。
3.SDS 法提取组织RNA 的优点与注意事项SDS 法提取组织RNA 的优点有:操作简单,提取效率高,对组织样本的要求较低。
然而,在操作过程中,需要注意以下几点:(1) 选择高质量的RNA 提取试剂盒,以保证提取效果。
(2) 在操作过程中,应避免RNA 降解,如避免长时间暴露在高温环境中。
(3) 在离心过程中,应根据实际需要选择适当的离心力,避免RNA 损失。
4.总结SDS 法提取组织RNA 是一种操作简便、提取效率高的方法,适用于各种类型的组织样本。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
组织提取RNA步骤
1.将组织在液氮中磨碎,每50~100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
2.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质。
可于2~8℃10000×
g离心10min,取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。
处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
3.每1ml TRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15s,室温放置5min。
4.2~8℃10000×g离心15min。
样品分为三层。
RNA主要在水相中,水相体积约为所
用TRIzol试剂的60℅。
5.把水相转移到新的EP管中加入等体积的异丙醇,室温放置10min。
6.2~8℃10000×g离心10min,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶
状白色沉淀。
弃上清进行下一步操作。
7.用75℅冰预冷的乙醇洗涤RNA沉淀。
每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。
2~8℃不超过7500×g离心5min,弃上清。
8.超净台中风干大约5~10min。
不要过于干燥,否则会导致RNA的溶解性大大降低。
加入25~200μl无RNase的水使RNA溶解。
Collected By Rainbow.X。