细胞免疫荧光染色

细胞免疫荧光染色

1.盖玻片处理：用前1天用纱布擦净灭菌，放入6孔板。

2.接种细胞：较低密度为适宜，约2000－10000个/孔（根据细胞生长状态决定，常用

5000个/孔），2ml（浓度为2500/ml）

3.24h后细胞贴壁，根据需要同步16－18h，干预处理，细胞融合60－70％时染色最

佳

4.37度PBS洗涤，3ml/孔，贴边加（可将6孔板倾斜，加完样在放正以防冲掉细胞，

0.5min。室温PBS也可，但4度禁止，否则细胞易皱缩。

5.固定：4％多聚甲醛(1ml)，先常温稳定5min，然后4度，10min，（可放在饭盒内）。

6.吸掉多聚甲醛，迅速加PBS 5ml/孔，洗涤5min×3次，镜下观察，细胞形态如前。

7.透化：0.1％－4％triton×－100，1ml/孔，室温透化5min（triton是去污剂，目的是

将脂质成分破坏，如细胞膜、核膜等，故不影响实验结果，可不用洗涤）

8.5％BSA（滤过）室温封闭至少20min（可配制含5％BSA和0.2％triton的混合液，将

两步合成一步）风干

9.用5％BSA将一抗1：50或1：100（常用）稀释至EP管200ul/玻片

10.将纱布垫在饭盒中，去离子水润湿纱布，准备封口膜。

11.吸去BSA，迅速滴加一抗，从玻片1中央滴加，液体会自行扩散至全片。为保持细胞

湿润，将6孔板封好，放入饭盒，37度孵育1－2h（有利于抗体结合），再室温3－4h。（或室温2h后，4度过夜）注意勿晃动6孔板，防止抗体不均或从玻片洒出。

12.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床）

13.用5％BSA将二抗1：50稀释（得到的实际浓度为1：100，因二抗本身已经被甘油

稀释1倍），也可1：200稀释。室温1.5h后可显荧光（放在饭盒里，避光）

14.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床）

15.免疫荧光显微镜观察。泡在2ml的PBS中保存。

16.多聚甲醛: 4度避光保存100ML PBS加4克多聚甲醛，磁力搅拌器加热搅拌，温度控

制在60℃以下，最好用细粉末的多聚甲醛，如仍不溶，滴加NaOH,(1N或0.1N），最后调PH值，7.4左右。

triton：用PBS稀释，常温保存