cre_loxp基因敲除系统解读
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基因敲除 Knock Out
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物 细胞中发现并实现了同源重组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理
（续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
二、基因敲除的基本流程
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
同一染色体上Fra Baidu bibliotek有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃） 位点特异性重组酶，介导loxp 位点间的序列同源重组 70%重组率，无需辅助因子，多种 结构的DNA底物 Loxp site 34bp反向重复序列 Flp/Frt重组系统
The End
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构 建好的打靶载体导入ES细胞
（3）阳性克隆筛选
随机整合
定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物 细胞中发现并实现了同源重组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理
（续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
二、基因敲除的基本流程
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
同一染色体上Fra Baidu bibliotek有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃） 位点特异性重组酶，介导loxp 位点间的序列同源重组 70%重组率，无需辅助因子，多种 结构的DNA底物 Loxp site 34bp反向重复序列 Flp/Frt重组系统
The End
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
电穿孔或是显微注射方法将构 建好的打靶载体导入ES细胞
（3）阳性克隆筛选
随机整合
定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。