植物多酚氧化酶活性测定方法的改进
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马铃薯块茎的ＰＰＯ活性，得到图２的结果。从图 ２可以看出，在波长４１０ ｉｌｍ下测定ＰＰ０活性比
ｏ Ｕ ｆ
在５２５ ｎｍ下测定ＰＰＯ活性提高了５倍。
Ｄ
Ｌ ｏ
Ｉ口
综上所述，这一测定方法提高了ＰＰＯ活性测
定的准确性、重复性和可比性。因此，这一方法是 有效可行的。
口 《
‘一
参考文献：
［１］朱广廉，钟诲文，张爱琴．植物生理学实验［Ｍ］．北 京：北京大学出版社，１９９０．３７—４０． ［２］李合生．现代植物生理学［Ｍ］．ｊＥ京：高等教育出版
ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ
ａｃｃｕｒａ－
ｃｙ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｉｖｅ—ｆｏｌｄ ｗｉｔｈ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ．
第２５卷第１期 ２００５年１月
云南师范大学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖ０１．２５ Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２００５
植物多酚氧化酶活性测定方法的改进＋
李忠光， 龚 明
（云南师范大学生命科学学院，云南昆明６５００９２）
摘要：
文章介绍了多酚氧化酶反应产物邻醌的吸收光谱和酶测定反应的动力学分析，确定了邻醌的
ＵＮＩＣ－－２０００分光光度计于波长４００～５５０ ｎｍ
下每隔２ｎｍ扫描光密度，得到图１（Ａ）的吸收光 谱图。从图１（Ａ）可以看出，邻醌的最大吸收光谱
位于蓝紫光区域，４１０ ｎｍ处有最大吸收峰，与文 献报道［１］的５２５ ｎｍ差异较大。因此，后面的酶 活性测定于４１０ ｎｍ下进行，反应时间为３ ｍｉｎ。
取０＂－３ ｒａｉｎ时间段，即３ ｒａｉｎ反应时间来计算酶
法［６］，本文通过对比色法的改进，极大地提高了 ＰＰＯ测定的准确性、重现性和可比性，使灵敏度提 高了５倍。
１．
活性，并且用光密度变化０．０１个单位所需要的酶 液量作为一个活力单位（Ｕ）。
材料的准备和处wk.baidu.com方法
２．
结果与分析
１．１植物材料的培养和选购 挑选饱满的玉米（Ｚｅａ Ｍａｙｓ）品种大黄的种ＰＰＯ与邻苯二酚反应的反应产物邻醌用
ＷＯＲＤＳ：Ｐｌａｔｅａｕ Ｌａｋｅ；ＰＮＳＢ；Ｐｌａｓｍｉｄ
ＤＮＡ
（上接第４５页） Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ＣＫ）ＮＧ Ｍｉｎｇ
，
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｌｉｒｅ ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２）
子，以０．１％ＨｇＣＩｚ消毒１０ ｒａｉｎ后，漂洗干净，于
２６．５＂Ｃ下吸涨１２ ｈ，播于垫有６层湿润滤纸的带 盖白磁盘（２４ ｃｒｕｘ
１６
物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化 酶［２’３］，它包括单酚氧化酶［酪氨酸酶（ｔｙｒｏｓｉ— ｎａｓｅ），ＥＣ．１．１０．３．２］、双氧化酶［儿茶酚氧化酶
・收稿日期：２００４－－０４－－０６ 基金项目：国家自然科学基金（３９８６０００），云南省自然科学基金（９８Ｃ００２Ｚ）
作者简介：李忠光（１９７１一），男（彝族），云南省永德县人，实验师，主要研究方向为植物逆境生物学．
通讯作者：龚明
万方数据
第１期
李忠光，等：植物多酚氧化酶活性测定方法的改进
・４５・
ＡＢＳＴＲＡＣＩ’：
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ＰＮＳＢ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｙａｎｇｚｏｎｇｈａｉ Ｌａｋｅ（ｄｅｅｐｗａｔｅｒ，ｏｌｉｇｏｔｒ— ｏｐｈｉｃａｔｉｏｎ）ａｎｄ Ｄｉａｎｃｈｉ Ｌａｋｅ（ｓｈａｌｌｏｗ ｗａｔｅｒ，ｅｕｔｒｏｐｈｉｃａｔｉｏｎ）．Ａ１１ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ—ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＮＳＢ ｓｔｒａｉｎｓ ｃａｍｅ ｆｒｏｍ ｗａｔｅｒ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １ ３ｍ ｉｎ ｄｅｐｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ—ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＮＳＢ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏ．ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ Ｙａｎｇｚｏｎｇｈａｉ Ｌａｋｅ；Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ－－ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｈｅａｖｙ ｐｏｉｌｕｔｅｄ ｌｅｖｅｌ ｓｉｔｅ ｉＳ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｍｏｄｅｒａｔｅ ａｎｄ １ｉｇｈｔ ｐｏｌｌｕｔｅｄ １ｅｖｅｌ ｓｉｔｅ ｉｎ Ｄｉａｎｃｈｉ Ｌａｋｅ．Ｔｈｅ
最高吸收光谱和酶测定的适宜参数。这一测定方法与原方法ｍ相比，提高了多酚氧化酶测定的准确性、 重复性和可比性，使灵敏度提高了５倍。 关键词：改进；多酚氧化酶；动力学曲线 中图分类号：０９４６．５ 文献标识码：
Ａ
文章编号：
１００７—９７９３（２００５）０１—００４４一０２
多份氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）是植
０‘。
［７］张志良，瞿伟菁．植物生理学实验指导（第三版） ［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００３．１２０一１２１． ［８］戴亚，施春华，唐宏，等．烟草多酚氧化酶分离提纯 及性质研究［Ｊ］．中国烟草学报，２００１，７（４）：７－－１２． ［９］ 黄建韶，张洪，田红现．苹果中多酚氧化酶的性质 ［Ｊ］．食品与机械，２００１，８３：２１—２２． ［１０３ 白宝璋，汤学军．植物生理学测试技术［Ｍ］．北京：
中国科学技术出版社，１９９３，６６—６８．
所以，ＰＰＯ测定中最好在反应１０ ｒａｉｎ内计算酶
（下转第４９页）
万方数据
第１期
郭秒，等：高原湖泊紫色非硫细菌质粒研究
。４９・
Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｕｒｐｌｅ Ｎｏｎｓｕｌｆｅｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＰＮＳＢ） ｉｎ Ｐｌａｔｅａｕ Ｌａｋｅ
［４］贺立红，宾金华．高等植物中的多酚氧化酶［Ｊ］．植物
生理学通讯，２００１，３７（４）：３４０－－３４５．
ＰＰＯ与底物反应后，在不同时间段检测两个 波长４１０ ｎｍ和５２５ ｎｍ下的光密度变化，得到图 １（Ｂ）。从图中可以看出，ＰＰＯ酶促反应在０～３
［５］许传俊，李玲．植物多酚氧化酶研究进展［Ｊ］．２００２，６
９
’西
｝
已 器
零
薏
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图２玉米幼苗和马铃薯块茎中ＰＰＯ活性
Ｆｉｇ．２
ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒ
枷４∞蛳４８０
为了进一步检验我们这一方法的有效性，我
４∞５∞５∞！ＳＬＩＯ ５∞
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
们测定了苗龄为１２．５天的玉米幼苗根系和Ｈ一６
ＫＥＹ
ＷＯＲＤＳ：
ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ；ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｃｕｒｖｅ
万方数据
（１）：４５—５５．
ｒａｉｎ内呈现很好的线性关系，所以取０～３ ｍｉｎ时 间段，即３ ｒａｉｎ反应时间来计算酶活性。但是，当 酶促反应达到ｉ０ ｒａｉｎ时，光密度开始下降，即邻 醌被还原。因为在反应体系中存在抗坏血酸等抗 氧化剂时，邻醌被抗坏血酸还原为邻苯二酚［１ 活性，其中以反应３ ｒａｉｎ为最佳时间。
ＧＵＯ Ｍｉａ０１…，ＣＨＥＮ ｄｉｎ—ｑｕａｎｌ，ＭＯ Ｙｕｅ—ｌ ｉｎｌ，ＨＵＡＮＧ Ｚｕｎ—ｘｉｌ
（（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２，Ｃｈｉｎａ； （２．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｘｕａｎｗｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００５３，Ｃｈｉｎａ）） Ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｄｅｅｐ ｐｌａｔｅａｕ ｌａｋｅ，
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｏ—ｑｕｉｎｏｎｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｃｕｒｖｅ
ｏｆ ｐｏｌｙ—
ｐｈｅｎ０１ ｏｘｉｄａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
１．２酶液的提取
１．１０．３．１）［４’５］。它可以把酚类物质如单
酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为相应
的醌类物质［６’７］。醌类物质对病原微生物起着抑
制作用或杀伤作用，具有一定的抗病能力。因此， 在感病的植物体中，ＰＰＯ活性都有不同程度的提 高，以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组 织［４’５］。此外，ＰＰＯ对食品和饮料生产也会产生 重大影响，它不仅影响食品和饮料的色泽，也影响 其品质，特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类 饮料的过程中更为突出［８，９３。所以，准确测定 ＰＰＯ活性，具有重要的生理和现实意义。
ｒａｔｅ
ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ－－ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．ｗａｓ ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｌａｓ—
ｍｉｄ ｉＳ ａｂｏｕｔ ｌＯＯＯＯｂｐ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｌａｋｅｓ．Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ－－ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＮＳＢ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｄｉａｎｃｈｉ Ｌａｋｅ ｉＳ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ３ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ Ｙａｎｇｚｏｎｇｈａｉ Ｌａｋｅ． ＫＥＹ
（ｃａｔｅｃｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ），ＥＣ．１．１０．３．２］、漆酶（１ａｃｅａ－ ｓｅ，ＥＣ
ｃｍ）中，于２６．５℃下黑暗中
萌发６０ ｈ。随后，于同样的温度下继续培养１０ 天，每天光照１６ ｈ和不断补充蒸馏水。苗龄为 １２．５天的玉米幼苗根系作为ＰＰＯ测定材料。 另一种材料为马铃薯块茎，品种为Ｈ一６，购 自昆明市种子公司。
Ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ（ｒａｉｎ）
社，２００２．６６．
图１苯醌的吸收光谱及ＰＰ０反应的动力学曲线
Ｆｉｇ．１ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｏ—ｑｕｉｎｏｎｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔ—
ｉｃｓ
Ｃｕｒｖｅ
［３］潘瑞炽．植物生理学（第四版）［Ｍ］．北京：高等教育
出版社，２００１．１１２．
ｏｆ ＰＰＯ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＰＰＯ常用的测定方法有比色法［１３和氧电极
酶液的提取按朱广廉［１］方法。
１．３
ＰＰＯ反应产物吸收光谱分析
马铃薯块茎ＰＰＯ与底物反应后，加入２０％ 三氯乙酸终止反应。反应产物用ＵＮＩＣ一２０００ 分光光度计于波长４００～５５０ ｎｍ下每隔２ｎｍ测
定光密度。
１．４
ＰＰＯ测定反应的动力学分析
马铃薯块茎ＰＰＯ与底物反应后，在不同时间 段检测两个波长４１０ ｎｍ和５２５ ｎｍ下的光密度。
ｏ Ｕ ｆ
在５２５ ｎｍ下测定ＰＰＯ活性提高了５倍。
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Ｉ口
综上所述，这一测定方法提高了ＰＰＯ活性测
定的准确性、重复性和可比性。因此，这一方法是 有效可行的。
口 《
‘一
参考文献：
［１］朱广廉，钟诲文，张爱琴．植物生理学实验［Ｍ］．北 京：北京大学出版社，１９９０．３７—４０． ［２］李合生．现代植物生理学［Ｍ］．ｊＥ京：高等教育出版
ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅ
ａｃｃｕｒａ－
ｃｙ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｉｖｅ—ｆｏｌｄ ｗｉｔｈ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ．
第２５卷第１期 ２００５年１月
云南师范大学学报
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖ０１．２５ Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２００５
植物多酚氧化酶活性测定方法的改进＋
李忠光， 龚 明
（云南师范大学生命科学学院，云南昆明６５００９２）
摘要：
文章介绍了多酚氧化酶反应产物邻醌的吸收光谱和酶测定反应的动力学分析，确定了邻醌的
ＵＮＩＣ－－２０００分光光度计于波长４００～５５０ ｎｍ
下每隔２ｎｍ扫描光密度，得到图１（Ａ）的吸收光 谱图。从图１（Ａ）可以看出，邻醌的最大吸收光谱
位于蓝紫光区域，４１０ ｎｍ处有最大吸收峰，与文 献报道［１］的５２５ ｎｍ差异较大。因此，后面的酶 活性测定于４１０ ｎｍ下进行，反应时间为３ ｍｉｎ。
取０＂－３ ｒａｉｎ时间段，即３ ｒａｉｎ反应时间来计算酶
法［６］，本文通过对比色法的改进，极大地提高了 ＰＰＯ测定的准确性、重现性和可比性，使灵敏度提 高了５倍。
１．
活性，并且用光密度变化０．０１个单位所需要的酶 液量作为一个活力单位（Ｕ）。
材料的准备和处wk.baidu.com方法
２．
结果与分析
１．１植物材料的培养和选购 挑选饱满的玉米（Ｚｅａ Ｍａｙｓ）品种大黄的种ＰＰＯ与邻苯二酚反应的反应产物邻醌用
ＷＯＲＤＳ：Ｐｌａｔｅａｕ Ｌａｋｅ；ＰＮＳＢ；Ｐｌａｓｍｉｄ
ＤＮＡ
（上接第４５页） Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ
ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ＣＫ）ＮＧ Ｍｉｎｇ
，
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｌｉｒｅ ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２）
子，以０．１％ＨｇＣＩｚ消毒１０ ｒａｉｎ后，漂洗干净，于
２６．５＂Ｃ下吸涨１２ ｈ，播于垫有６层湿润滤纸的带 盖白磁盘（２４ ｃｒｕｘ
１６
物体内普遍存在的一种非线粒体内的末端氧化 酶［２’３］，它包括单酚氧化酶［酪氨酸酶（ｔｙｒｏｓｉ— ｎａｓｅ），ＥＣ．１．１０．３．２］、双氧化酶［儿茶酚氧化酶
・收稿日期：２００４－－０４－－０６ 基金项目：国家自然科学基金（３９８６０００），云南省自然科学基金（９８Ｃ００２Ｚ）
作者简介：李忠光（１９７１一），男（彝族），云南省永德县人，实验师，主要研究方向为植物逆境生物学．
通讯作者：龚明
万方数据
第１期
李忠光，等：植物多酚氧化酶活性测定方法的改进
・４５・
ＡＢＳＴＲＡＣＩ’：
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ＰＮＳＢ ｐｌａｓｍｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｙａｎｇｚｏｎｇｈａｉ Ｌａｋｅ（ｄｅｅｐｗａｔｅｒ，ｏｌｉｇｏｔｒ— ｏｐｈｉｃａｔｉｏｎ）ａｎｄ Ｄｉａｎｃｈｉ Ｌａｋｅ（ｓｈａｌｌｏｗ ｗａｔｅｒ，ｅｕｔｒｏｐｈｉｃａｔｉｏｎ）．Ａ１１ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ—ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＮＳＢ ｓｔｒａｉｎｓ ｃａｍｅ ｆｒｏｍ ｗａｔｅｒ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ １ ３ｍ ｉｎ ｄｅｐｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ—ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＮＳＢ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｏ．ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ Ｙａｎｇｚｏｎｇｈａｉ Ｌａｋｅ；Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ－－ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｈｅａｖｙ ｐｏｉｌｕｔｅｄ ｌｅｖｅｌ ｓｉｔｅ ｉＳ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｍｏｄｅｒａｔｅ ａｎｄ １ｉｇｈｔ ｐｏｌｌｕｔｅｄ １ｅｖｅｌ ｓｉｔｅ ｉｎ Ｄｉａｎｃｈｉ Ｌａｋｅ．Ｔｈｅ
最高吸收光谱和酶测定的适宜参数。这一测定方法与原方法ｍ相比，提高了多酚氧化酶测定的准确性、 重复性和可比性，使灵敏度提高了５倍。 关键词：改进；多酚氧化酶；动力学曲线 中图分类号：０９４６．５ 文献标识码：
Ａ
文章编号：
１００７—９７９３（２００５）０１—００４４一０２
多份氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）是植
０‘。
［７］张志良，瞿伟菁．植物生理学实验指导（第三版） ［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００３．１２０一１２１． ［８］戴亚，施春华，唐宏，等．烟草多酚氧化酶分离提纯 及性质研究［Ｊ］．中国烟草学报，２００１，７（４）：７－－１２． ［９］ 黄建韶，张洪，田红现．苹果中多酚氧化酶的性质 ［Ｊ］．食品与机械，２００１，８３：２１—２２． ［１０３ 白宝璋，汤学军．植物生理学测试技术［Ｍ］．北京：
中国科学技术出版社，１９９３，６６—６８．
所以，ＰＰＯ测定中最好在反应１０ ｒａｉｎ内计算酶
（下转第４９页）
万方数据
第１期
郭秒，等：高原湖泊紫色非硫细菌质粒研究
。４９・
Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｕｒｐｌｅ Ｎｏｎｓｕｌｆｅｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＰＮＳＢ） ｉｎ Ｐｌａｔｅａｕ Ｌａｋｅ
［４］贺立红，宾金华．高等植物中的多酚氧化酶［Ｊ］．植物
生理学通讯，２００１，３７（４）：３４０－－３４５．
ＰＰＯ与底物反应后，在不同时间段检测两个 波长４１０ ｎｍ和５２５ ｎｍ下的光密度变化，得到图 １（Ｂ）。从图中可以看出，ＰＰＯ酶促反应在０～３
［５］许传俊，李玲．植物多酚氧化酶研究进展［Ｊ］．２００２，６
９
’西
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已 器
零
薏
ｏ
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图２玉米幼苗和马铃薯块茎中ＰＰＯ活性
Ｆｉｇ．２
ＰＰＯ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍａｉｚｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ａｎｄ ｐｏｔａｔｏ ｔｕｂｅｒ
枷４∞蛳４８０
为了进一步检验我们这一方法的有效性，我
４∞５∞５∞！ＳＬＩＯ ５∞
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ
们测定了苗龄为１２．５天的玉米幼苗根系和Ｈ一６
ＫＥＹ
ＷＯＲＤＳ：
ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ；ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｃｕｒｖｅ
万方数据
（１）：４５—５５．
ｒａｉｎ内呈现很好的线性关系，所以取０～３ ｍｉｎ时 间段，即３ ｒａｉｎ反应时间来计算酶活性。但是，当 酶促反应达到ｉ０ ｒａｉｎ时，光密度开始下降，即邻 醌被还原。因为在反应体系中存在抗坏血酸等抗 氧化剂时，邻醌被抗坏血酸还原为邻苯二酚［１ 活性，其中以反应３ ｒａｉｎ为最佳时间。
ＧＵＯ Ｍｉａ０１…，ＣＨＥＮ ｄｉｎ—ｑｕａｎｌ，ＭＯ Ｙｕｅ—ｌ ｉｎｌ，ＨＵＡＮＧ Ｚｕｎ—ｘｉｌ
（（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２，Ｃｈｉｎａ； （２．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ，Ｃａｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｘｕａｎｗｕ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００５３，Ｃｈｉｎａ）） Ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ ｄｅｅｐ ｐｌａｔｅａｕ ｌａｋｅ，
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｏ—ｑｕｉｎｏｎｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｃｕｒｖｅ
ｏｆ ｐｏｌｙ—
ｐｈｅｎ０１ ｏｘｉｄａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｍａｘｉｍｕｍ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
１．２酶液的提取
１．１０．３．１）［４’５］。它可以把酚类物质如单
酚、邻苯二酚、邻苯三酚、对苯二酚等氧化为相应
的醌类物质［６’７］。醌类物质对病原微生物起着抑
制作用或杀伤作用，具有一定的抗病能力。因此， 在感病的植物体中，ＰＰＯ活性都有不同程度的提 高，以抵抗病原体进一步侵染健康的植物组 织［４’５］。此外，ＰＰＯ对食品和饮料生产也会产生 重大影响，它不仅影响食品和饮料的色泽，也影响 其品质，特别是在制作绿茶、红茶、烤烟和水果类 饮料的过程中更为突出［８，９３。所以，准确测定 ＰＰＯ活性，具有重要的生理和现实意义。
ｒａｔｅ
ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ－－ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｐ．ｗａｓ ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｌａｓ—
ｍｉｄ ｉＳ ａｂｏｕｔ ｌＯＯＯＯｂｐ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｌａｋｅｓ．Ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ－－ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＮＳＢ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ Ｄｉａｎｃｈｉ Ｌａｋｅ ｉＳ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ３ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ Ｙａｎｇｚｏｎｇｈａｉ Ｌａｋｅ． ＫＥＹ
（ｃａｔｅｃｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ），ＥＣ．１．１０．３．２］、漆酶（１ａｃｅａ－ ｓｅ，ＥＣ
ｃｍ）中，于２６．５℃下黑暗中
萌发６０ ｈ。随后，于同样的温度下继续培养１０ 天，每天光照１６ ｈ和不断补充蒸馏水。苗龄为 １２．５天的玉米幼苗根系作为ＰＰＯ测定材料。 另一种材料为马铃薯块茎，品种为Ｈ一６，购 自昆明市种子公司。
Ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ（ｒａｉｎ）
社，２００２．６６．
图１苯醌的吸收光谱及ＰＰ０反应的动力学曲线
Ｆｉｇ．１ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｏ—ｑｕｉｎｏｎｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔ—
ｉｃｓ
Ｃｕｒｖｅ
［３］潘瑞炽．植物生理学（第四版）［Ｍ］．北京：高等教育
出版社，２００１．１１２．
ｏｆ ＰＰＯ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ＰＰＯ常用的测定方法有比色法［１３和氧电极
酶液的提取按朱广廉［１］方法。
１．３
ＰＰＯ反应产物吸收光谱分析
马铃薯块茎ＰＰＯ与底物反应后，加入２０％ 三氯乙酸终止反应。反应产物用ＵＮＩＣ一２０００ 分光光度计于波长４００～５５０ ｎｍ下每隔２ｎｍ测
定光密度。
１．４
ＰＰＯ测定反应的动力学分析
马铃薯块茎ＰＰＯ与底物反应后，在不同时间 段检测两个波长４１０ ｎｍ和５２５ ｎｍ下的光密度。