湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术
不同物种的DNA提取方法
不同物种的DNA提取方法摘要DNA作为遗传微粒，为生物体的遗传信息复制和传递做出了巨大的贡献，而1953年J.Watson和F.Crick提出的双螺旋结构模型不仅解释了有关DNA 的性质，而且也清楚地解释了DNA的各种生物功能，进而使DNA的研究进入到了分子水平。
然而DNA是如何具体在生物体内发挥其作用的，到现在还是一个热门课题，为了研究其作用，就需要从各种物种中提取DNA，由于不同物种结构的复杂性不同，导致提取DNA的方法也是各不相同，为此，我整理了一些物种的DNA提取方法。
关键词：物种、DNA提取1、月季DNA的提取方法：之所以提取高质量的月季DNA有难度，是因为其体内富含多糖及多酚类的物质，在一般的DNA提取方法中，很难被分离，这就严重干扰了提取月季DNA的纯度以及完整性。
为了解决这个问题，北京市园林科学研究所采取五种提取方法，在其最后的实验结果表明：Draper法提取月季DNA的纯度最高，完整性最好。
2、大麦小孢子DNA的提取方法：要想分离提取小孢子的DNA，就需要降解小孢子壁，而小孢子壁由外壁和内壁组成，内壁主要由纤维素和果胶组成，这类物质能够被相应的酶所水解，而外壁的主要成分是类胡萝卜素和类胡萝卜酯的氧化多聚化的衍生物，化学物质非常稳定，到目前为止，还没有相应的酶可以水解。
因此外壁便成为提取高质量的大麦小孢子DNA的一个“拦路虎”。
对此，莱阳农学院展开了研究，他们通过“收集大麦的花药”、“分离小孢子”、“分离小孢子”。
最后“DNA的提取”等一系列的步骤，在最后的统计结果中，发现CTAB法和微量快速提取法取得不错的效果，而且DNA的得率和质量几乎一样。
这也证明了上述两种方法是有效而可行的，当然在这个研究过程，首次采用超声波法进行破壁，收到出乎意料的效果，也为CTAB法和微量快速提取法提供了必要的条件。
所谓的CTAB，其中文名是十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
土壤DNA提取Part II 化学篇
土壤DNA提取Part II 化学篇接着前一篇文章关于如何提高土壤DNA提取得率的话题。
我们已经十分彻底的谈了样品研磨裂解、选择研磨珠类型的重要性、研磨设备以及裂解缓冲液。
从中你也可以发现，裂解步骤是提高得率的最值得钻研的地方。
研磨裂解后最终DNA抽提前，需要清洗去杂。
这一步主要由抑制因子去除技术（IRT）完成。
跟着操作说明书流程走，抑制因子去除完成后，文章的再下一段就是使用化学溶液配合硅胶离心柱抽提DNA了。
去除抑制因子：把土壤样品研磨破碎后就可以进行PCR抑制因子去除工作。
所谓的腐植酸其实就是使得样品呈现棕色的物质。
如果样品中有植物残骸甚至生物薄膜（Biofilm），杂质中还会含多糖类物质。
MO BIO以及Powersoil kits之所以在同行、同类试剂盒中出类拔萃就是因为其抑制因子去除。
MO BIO实验室开发出了一个专利技术，叫抑制因子去除技术（IRT）。
它能从细胞裂解物中沉淀去除腐植酸、多糖、多酚等。
IRT技术分两步，先去除蛋白质和其它残骸，然后去除不溶性大分子絮状沉淀物。
IRT处理后，样品看起来就清亮很多了。
PowerSoil 和PowerWater经过实验计算使用了充足的IRS量来对付最最难搞的问题土壤。
若最终依然存在有抑制因子（PCR扩增检测），重复一次IRS步骤。
IRT的第一步需要低温来加强絮状物形成。
而第二步，我们建议不要延长孵育时间超过5min。
试验证明过长孵育时间会降低DNA得率。
中点？如果要临时中止实验，时间点最好是在IRS结束后，加入绑定液之前。
把溶解产物存放在-20℃留到第二天再做硅胶离心柱绑定。
绑定到硅胶薄膜上：此时，DNA已经可以过硅胶薄膜用于抽提了。
一般上一步得到的细胞裂解产物应该是清亮的（如果土壤有机物含量很多，有可能微微发黄）。
为了把DNA吸附到硅胶薄膜上，需要离液盐的帮助。
绑定液（C4溶液）与溶解产物的比例是得率的又一关键点。
绑定液用太多，会导致降解RNA过多回收；要是太少，大分子量的基因组DNA回收率就不高。
土壤DNA提取方法汇总
土壤DNA提取方法汇总土壤中的DNA提取是研究土壤微生物群落结构和功能的重要步骤之一、本文将对目前常用的土壤DNA提取方法进行汇总，并介绍其原理、优缺点以及适用性。
1.CTAB法CTAB（氯化己基三甲基铵）法是最常用的土壤DNA提取方法之一、其原理是利用CTAB与蛋白质和多糖发生作用，使DNA与其他组分分离。
该方法的优点是提取得到的DNA纯度高、适用性广。
缺点是操作步骤多，时间长，适用于提取含有较多植物残渣的土壤。
2.基于磁珠的DNA提取方法基于磁珠的DNA提取方法利用磁珠表面修饰特定的配体来提取DNA。
该方法的优点是操作简单、快速，适用于大样本数量的高通量提取。
缺点是DNA提取量可能较少，且磁珠的价格较高。
3.基于柱式纯化的DNA提取方法基于柱式纯化的DNA提取方法利用离心共沉淀、结合柱过滤和洗脱等操作步骤将DNA分离、纯化。
该方法的优点是操作简单、纯度高、适用性广。
缺点是提取过程中可能有一定的DNA损失，适用于土壤中DNA含量较高的样品。
4.基于酚/氯仿的DNA提取方法基于酚/氯仿的DNA提取方法通过酚提取蛋白质，然后用氯仿提取DNA。
该方法的优点是操作简单、时间短。
缺点是提取得到的DNA纯度较低、约30%-50%，适用于低含量的DNA提取。
5.基于快速筛选管的DNA提取方法基于快速筛选管的DNA提取方法是一种快速、高通量的DNA提取方法。
该方法将土壤样品与诸如琼脂、蛋白酶和密度调节溶液等混合，然后离心过滤来净化DNA。
该方法适用于大样本数量，但提取得到的DNA纯度可能较低。
6.基于盐法的DNA提取方法基于盐法的DNA提取方法利用高盐溶液和酒精共同作用来提取DNA。
该方法的优点是操作简单，适用性广。
缺点是提取得到的DNA纯度较低、约60%-70%。
适用于含有较少结构复杂的土壤样品。
7.基于微环境酶法的DNA提取方法基于微环境酶法的DNA提取方法通过添加酶裂解细胞壁和膜来提取DNA。
该方法的优点是提取得到的DNA纯度高、适用性广，适用于含有许多植物遗传物质的土壤。
实验室土壤DNA提取方法
实验室土壤DNA提取方法引言：土壤DNA提取是土壤微生物研究的重要步骤之一、随着分子生物学和生物技术的飞速发展，土壤DNA提取方法也在不断更新和改进。
本文将介绍几种常用的实验室土壤DNA提取方法，并对其优缺点进行分析。
1.简化版CTAB方法CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)方法是最早用于植物基因组DNA提取的方法之一，后来也被应用于土壤DNA提取。
该方法的主要原理是CTAB与蛋白质结合，沉淀DNA。
该方法适用于各种土壤类型，但操作繁琐，时间长。
在简化版CTAB方法中，可以只使用CTAB和柠檬酸溶液进行土壤细胞破碎和沉淀DNA。
优点：适用于多种土壤类型，提取效果较好。
缺点：操作繁琐，时间长。
2.快速离子交换层析法快速离子交换层析法是一种快速、高效的土壤DNA提取方法。
该方法利用离子交换层析介质的特异性吸附性质，选择性地提取DNA。
该方法不需要昂贵的实验室设备，操作简便，快速。
优点：操作简便快速，不需要昂贵的实验室设备。
缺点：提取效果受土壤样品质量的影响较大。
3.商用土壤DNA提取试剂盒商用土壤DNA提取试剂盒是目前最常用的土壤DNA提取方法之一、这些试剂盒根据不同原理设计，一般包括土壤细胞破碎缓冲液、蛋白酶、DNA结合试剂等。
使用时只需要按照说明书的步骤操作即可，具有方便、快速的特点。
同时，商用试剂盒通常能保证较高的提取效率和较低的污染率。
优点：操作简便快速，提供高效率的DNA提取。
缺点：试剂盒价格较高。
4.冷冻磨砂法冷冻磨砂法是一种相对简单、快速的土壤DNA提取方法。
该方法利用液氮的低温和研钵的摩擦破碎土壤细胞，释放DNA。
提取过程中需要尽快将土壤样品置于液氮中进行冷冻，以避免DNA降解。
优点：操作简便快速。
缺点：需要较多的液氮。
结论：不同的土壤DNA提取方法各有优缺点，选择适合自己实验室的方法需考虑到实验目的、样品类型和实验室条件等因素。
因此，实验人员应了解不同提取方法的原理和应用，并结合实际需要选择合适的方法进行土壤DNA提取。
土壤DNA和植物DNA提取方法
土壤DNA和植物DNA提取方法现在主要的提取方法有：氯仿异戊醇抽提法、离心柱试剂盒法和磁珠法。
其中磁珠法作为一种新型核酸提取法，相较于传统方法来说优势明显：（1）生物磁珠具有小尺寸效应和表面效应，能够高效提取DNA；（2）磁珠表面能够进行化学修饰，从而与DNA进行特异性吸附；（3）磁珠法用时少，操作简单，且对环境无污染。
一、提取难点要想在土壤和植物中提取DNA，样本的液化是关键的一步，像土壤和植物都是固体样本，很难直接在试剂盒的作用下用于核酸提取。
提取过程中固体样本会跟杂质一样，严重阻碍磁珠吸附核酸，并且损耗大量的磁珠位点，很难取得良好的提取效果。
所以，在土壤和植物DNA提取时，要对样本进行预处理。
土壤的预处理首先需要浸泡，必要时可以进行水浴，因为从土壤中提取DNA并非提取土壤本身，而是提取土壤中存在的微生物DNA。
然后在样本中加入氧化锆-二氧化硅微珠和缓冲液，接着对其进行离心，取上清液即可用于进一步提取。
在植物中提取DNA时，需要剪取适量样本，对其进行研磨。
研磨时如果需要保护RNA，可以采用液氮研磨的方式。
如果不需要提取RNA，也可以加入裂解液或者生理盐水帮助研磨成匀浆状态，如果所得匀浆较为浑浊，可对其进行适当离心处理，取上清液即可用于进一步提取。
二、磁珠法提取试剂盒深圳市朗司医疗科技有限公司，开发出了新型高效的土壤和植物基因组DNA提取试剂盒，能够最大限度的去除土壤和植物提取DNA过程中所产生的杂质，保留目标所需DNA。
【图：使用朗司土壤试剂盒提取4种土壤样本的电泳结果】【图：使用朗司植物试剂盒提取叶片（50mg）总DNA的电泳结果，S1-S16为重复实验】三、磁珠法核酸提取仪（16通量）结合磁珠法核酸纯化技术，配合公司自主研发的16通量LemnisCare MGX-1600全自动核酸提取仪，可以完成目标核酸的自动提取，更加安全可靠，大大节省科研人员操作的同时，得到高纯度的土壤和植物DNA。
探秘土壤微生物：DNA提取与分析
土壤修复案例分析
• 污染源识别：通过 DNA 提取揭示微生物群落结构，关联土壤污染物类型。 • 微生物修复技术：利用特定菌种代谢活动，促进污染物降解，案例展示修复效果。 • 气候变化影响：分析温度、降水变化如何影响微生物修复效率，探讨适应策略。
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挑战与未来展望
实验难题
• 复杂背景干扰：微生物 DNA 提取时，背景物质影响提取效率和纯度。 • 样品处理优化：改进处理步骤，减少杂质，提高 DNA 质量。
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现代 DNA 提取技术
• 试剂盒提取：利用预优化的化学试剂，高效、快速提取 DNA。 • 自动化设备：自动化系统提高提取效率，确保实验结果的一致性与可重复性。
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DNA 纯化与质量评估
纯化步骤
• 柱色谱法：高效分离 DNA，利用不同分子大小和亲和性的差异。 • 磁珠技术：快速捕获，通过磁性纳米粒子吸附 DNA，便于洗脱纯化。
探秘土壤微生物：DNA 提取与分析
Overview
1. 土壤微生物的生态角色 2. DNA 提取原理与方法ห้องสมุดไป่ตู้3. DNA 纯化与质量评估 4. 分析技术与应用 5. 挑战与未来展望 6. 互动环节
土壤微生物的生态角色
土壤微生物多样性
• 生态系统关键：微生物在营养循环中的关键作用。 • 土壤健康维护：微生物促进土壤肥力，维护生态平衡。 • DNA 分析揭示：通过 DNA 提取分析，揭示微生物群落结构与功能多样性。
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Thank you!
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土壤微生物生态角色：DNA 揭示群落结构与环境响应
• DNA 提取：通过 DNA 分析揭示土壤微生物群落组成和动态变化。 • 结构分析：利用 DNA 数据构建群落结构图，展示不同微生物间的关联性。 • 环境响应：探究 DNA 变化如何反映土壤对气候变化、污染等环境因素的响应。
人工湿地中微生物去除污染物的研究进展
人工湿地中微生物去除污染物的研究进展目录引言 (1)1 人工湿地微生物去除污染物研究现状 (1)1.1 人工湿地时空变化对微生物去除污染物的影响 (1)1.2人工湿地系统中微生物的种群结构对污染物去除的影响 (3)1.3 人工湿地中的酶与污染物去除效果研究 (4)1.4人工湿地系统中微生物对特殊有机污染物的降解的影响 (6)1.5 人工湿地基质微生物的代谢特征和功能 (7)2 结语 (9)引言人工湿地技术是20世纪70年代末发展起来的一种新型的污水生态处理新技术, 其特点是投资少、效率高、抗冲击、处理效果稳定、运行费用低、维护方便和景观生态相容性好。
目前已被用于处理各种类型的废水, 如居民生活污水、养殖废水、酸性矿排水、暴雨径流、面源污染控制以及河流、湖泊湿地恢复和重建, 同时在城市市政工程建设中发挥作用。
一般认为, 人工湿地是通过植物-土壤-微生物的综合作用实现对污染物去除的, 其中微生物是对污染物进行吸收和降解的主要生物群体和承担者, 微生物在湿地基质中与其他动物和植物共生体的相互关系往往起着核心作用。
在人工湿地系统净化污水过程中, 基质中的微生物起到十分重要的作用, 一方面它们既是生态系统中的重要组成部分, 另一方面又是有机污染物去除的积极分解者, 它们的组成以及功能的发挥将直接影响人工湿地的净化效果。
近年来对湿地微生物的研究逐渐深入, 包括微生物种群时空分布, 微生物酶活性, 遗传多样性等。
本文总结归纳了国内外有关人工湿地系统中微生物去除污染物的研究进展。
1 人工湿地微生物去除污染物研究现状围绕人工湿地基质微生物去除污染物已经展开了多方面的研究, 主要包括微生物数量、种群分布、酶活性以及有机物的生物降解等几方面。
1.1 人工湿地时空变化对微生物去除污染物的影响黄德锋等分析了复合垂直流人工湿地污染物的沿程降解情况。
结果表明, 湿地系统中污染物质量浓度沿程逐渐降低。
当污水由下行池流入上行池时, 大部分污染物已被去除, TN、TP、COD和NH+4-N在下行池的去除率分别为63.7%、66.7%、72.2%和67.9%, 污染物主要在下行池通过基质微生物和植物的协同作用被去除。
土壤微生物总DNA的提取和纯化
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微 生 物 学 报
43 卷
(25mmolΠL) 4μL ,引物 1 (25pmolΠμL) 2μL ,引物 2 (25pmolΠμL) 2μL ,Mg2 + (25mmolΠL) 4μL ,模板 (土壤 DNA) 10μL , Taq DNA 聚合酶 215U ,dd H2O 2215μL ,总体积 50μL 。反应参数 :95 ℃变 性 10min ;95 ℃2min ,42 ℃30s ,72 ℃4min ,35 个循环 ;72 ℃延伸 20min 。 116 土壤中目标菌株 DNA 的提取灵敏度 11611 土壤接种目标菌株 :菌株 M6 (带有 mpd 基因) 是甲基对硫磷降解菌 ,其甲基对硫磷 水解酶基因已被克隆[9] 。菌株 M6 活化后 ,隔夜培养 ,离心收集菌体 ,无菌水洗涤 3 次 ,以 10 - 2210 - 8 系列稀释 ,各稀释度分别取 1mL 加入到 5g 土壤 Y1 中 ,摇床振摇 30min ,然后提 取 DNA 进行纯化 。提取前用含有甲基对硫磷的肉汤平板计数添加到土壤中的 M6 菌 。 11612 目的基因 ( mpd) 的 PCR 扩增 : 引物 1 为 :5′2GAATTCATATGCCCCTGAAGAAC23′,引 物 2 为 : 5′2GAATTCTCGAGCTTGGGGTTGACGACCG23′。扩增反应体系 :10 ×缓冲液 215μL , dNTP(25mmolΠL) 2μL ,引物 1 (25pmolΠμL) 015μL ,引物 2 (25pmolΠμL) 015μL ,Mg2 + (25mmolΠL) 115μL ,模板 (土壤 DNA) 3μL , Taq DNA 聚合酶 215U ,dd H2O 1415μL 总体积 25μL 。反应参 数 :95 ℃变性 2min ;95 ℃1min ,45 ℃1min ,72 ℃2min ,35 个循环 ;72 ℃延伸 7min 。
不同环境中土壤微生物总DNA的提取与纯化
ｓｉｍｉ ｏｒａ ｉ ｓ ｖｒ ３ １ｋ ｓ ｔｏ ． ｈ Ｎ ｍｏｎ ｎ ｕｉ ｆ ｉｅｅ ｔｏｌ ｃｏｒａ ｉ ｅｅ ｏｌ ｃ ｏｇｎｓ ｗａ ｏ ｅ ２ ． ｂｂ ｔ ｈｄ Ｔ ｅＤ Ａ ａ ｕ ｔ ｄｐｒ ｙｏ ｆ ｒｎ ｉｍ ｒｏｇｎｓ ｗ ｒ ｒ ｓ ｍ ｙ ｈ ｍｅ ｉ ａ ｔ ｄｆ ｓ ｉ ｍｓ
ｃｏｒａ ｉ ｇ ａ ｆｒ ｔ ａ ｇ ｅｔ Ｔｈ ｒｄ ｘｒｃｅ ＮＡ ｏ ｉｍ ｃ ｏｇｎｓ ｓｐ ｒｉ ｈｎ ｌ ｒｏ ｎｓ ｉ ｏ ｉ ｌｏｅ ｓ ｈ ｈ ｈ ． ｅｃｕ ｅｅｔ ｔ Ｄ ｆ ｏｌ ｒ ｒａｉ ｗａ ｕ ｆ ｂ ｐ ｅｏ ｇ ｓ ｍ ｎｒ ｎ ｓ ｗ ｔ ｉ ｓ ｉ ｅ ａｄ ｓ ｏ ｉ ｓ ｍ ｉｅ ｙ ｄ —
１Ｓ Ｄ ６ ｒＮＡ基 因 的 引物 可 以扩 增 到 相 应 的片 段 。 关 键 词 ：Ｄ ； 壤 微 生 物 ； ＮＡ提 取 ； Ｃ 扩 增 Ｓ Ｓ土 Ｄ ＰＲ
中图分类号 ：１４ ３ ￥ ５ ．４
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ：０ ２—８ ６ （０ ８ ０ —０ １ —０ １０ １ １２ ０ ） １ ０ ２ ５
ｄ ｆｅ ｅ ｔ ｈ ｘ ｒ ｃｅ ｉ ｒ ｎ ，ｔ ｅ ｔａ ｔ ＤＮＡ ｍｏ ｎ ｓ ５ ５ — ７ ９ ｇ ｐ ｒｇ ａ ｄ ｙ ｓ ｉ， ｄ ｔ ｅ ｅ ｔａ ｔ ｆ ｅ ｄ ａ ｕ ｔｗａ ３． ５ ５ ９． ３ ｔ ｒ ｍ ｒ ｏ ｌａ ｈ ｘ ｒ ｃｅ ＤＮＡ ｍｏ ｎ ｆ ｏ ｌ ｎ — ｚ ｅ ｎ ｄ ａ ｕ ｔ ｉｒｉ ｏ ｓ
２ 中国热带农 业科 学院环境与植 物保护研究所 ， 海南儋 州 ５ １３ ） ． ７ ７ ７
摘要 ： 采用 Ｓ Ｓ高盐缓冲液抽 提法提取 了林地 、 区 、 Ｄ 厂 菜地 ３种不 同环境 中土壤微 生物总 Ｄ Ａ， Ｎ 结果表 明 ， 该方 法可以从 土壤 微生物 中提取 到长度 大于 ２ ．ｋ ３ １ｂ的 Ｄ Ａ； 同环境 中提取 的 ＤＮ Ｎ 不 Ａ产量和纯度 都存在 一定 的差异 ， 每克干土 的 Ｄ Ａ提取量介于 ５ ．５ ７ ．３ ｇ之间 ， 中以处于原始状态 的丛林提取量最高 。粗提 的土壤微 生物 Ｎ ３ ５ ～５ ９９ 其 Ｄ Ａ采 用酚氯仿 和柱 式 腐 殖 酸 去 除 剂 进 行 纯 化 ， 化 后 的 土 壤 微 生 物 Ｄ Ａ 可 以用 于 Ｐ Ｒ扩 增 ， 用 细 菌 Ｎ 纯 Ｎ Ｃ 使
不同环境中土壤微生物总DNA的提取与纯化
收稿日期:2007210201基金项目:中央公益性科研院所基本科研业务专项(2007hzslJ011)作者简介:吴红萍(19822),男,江西萍乡人,硕士研究生,研究方向为资源微生物开发和利用。
3为通讯作者。
不同环境中土壤微生物总DNA 的提取与纯化吴红萍1, 郑服丛23(11海南大学环境与植物保护学院, 海南儋州 571737;21中国热带农业科学院环境与植物保护研究所, 海南儋州 571737) 摘要:采用SDS 高盐缓冲液抽提法提取了林地、厂区、菜地3种不同环境中土壤微生物总DNA ,结果表明,该方法可以从土壤微生物中提取到长度大于2311kb 的DNA ;不同环境中提取的DNA 产量和纯度都存在一定的差异,每克干土的DNA 提取量介于53155～579193μg 之间,其中以处于原始状态的丛林提取量最高。
粗提的土壤微生物DNA 采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂进行纯化,纯化后的土壤微生物DNA 可以用于PCR 扩增,使用细菌16SrDNA 基因的引物可以扩增到相应的片段。
关键词:SDS ;土壤微生物;DNA 提取;PCR 扩增中图分类号:S154134 文献标识码:A 文章编号:1002-8161(2008)01-0012-05Extraction and purif ication of total D NA of soilmicroorganisms in different environmentsWU Hong 2ping 1,ZHEN G Fu 2cong 23(11College of Environment and Plant Protection ,Hainan U niversity ,Danz hou ,Hainan 571737,China ; 21Environment and Plant Protection Institute ,Chinese Academy ofT ropical A gricultural Sciences ,Danz hou ,Hainan 571737,China )Abstract :In this experiment ,the total DNA of soil microorganisms from forest land ,factory area and vegetable plot were extracted by high salt buffer solution of SDS extraction method 1The results showed that the extracted DNA length of soil microorganisms was over 2311kb by this method 1The DNA amount and purity of different soil microorganisms were different ,the extracted DNA amount was 531552579193μg per gram dry soil ,and the extracted DNA amount of soil mi 2croorganisms in original forest was the highest 1The crude extracted DNA of soil microorganisms was purified by phenol 2chloroform and column humic acid ,then purified DNA could be used as templates for PCR amplification ,and corresponding fragments could be amplified by using primers of bacterial 16S rDNA gene 1K ey w ord :SDS ;soil microorganisms ;DNA extraction ;PCR amplification 土壤是微生物的大本营,土壤微生物在生物地球化学循环中扮演着非常重要的角色,对地表生态系统乃至全球都存在重要影响。
土壤DNA提取：常用土壤DNA分离试剂盒解决方案
土壤DNA提取：常用土壤DNA分离试剂盒解决方案土壤中的微生物资源非常丰富，但用传统技术培养的微生物仅占微生物总数的0.01％~10％，且大部分微生物处于不可培养的状态，使相当多的菌种不能被充分地开发和利用。
从土壤中提取的DNA，是微生物、动植物遗体等的总DNA。
由于土壤微生物成分复杂，常规提取总DNA的方法难以去除腐殖酸，而腐殖酸会抑制聚合酶链式反应（PCR）扩增中的TaqDNA聚合酶以及酶切反应的限制性内切酶活性。
另外，土壤质地和成分的差异也会影响土壤微生物DNA的提取效果。
因而，从土壤中提取DNA，腐殖物质等抑制因子的去除就成为了重中之重。
如何从土壤样本中提取纯化DNA？Norgen土壤DNA分离试剂盒为从土壤样本中检测微生物提供了一种方便、快速的方法。
所有类型的土壤样品均可使用该工具包进行处理，包括普通土壤样品和腐殖酸含量高的难处理土壤样品，如堆肥和粪便。
该试剂盒使用提供的OSR（有机物去除）溶液去除所有微量腐殖酸和PCR抑制剂。
然后使用一种简单快速的旋转柱程序进一步纯化DNA。
总基因组DNA可以从土壤中发现的各种微生物中分离和纯化，如细菌、真菌和藻类。
纯化的DNA质量最高，与下游PCR应用完全兼容，因为在分离过程中去除了所有腐殖酸物质和PCR抑制剂。
该土壤DNA分离试剂盒具有以下特点：1.快速简便的土壤样品中微生物检测方法；2.处理所有土壤类型，包括常见的土壤样品和腐植酸含量高的难处理的土壤样品，如堆肥和粪肥；3.使用OSR（Organic Substance Removal）溶液去除有机物质；4.从DNA样本中去除所有腐殖酸；5.使用快速离心柱形式进行快速简便的处理；6.从包括细菌、真菌和藻类在内的各种微生物中分离出高质量的总DNA；7.纯化的DNA质量很高，完全兼容下游PCR应用，因为在分离过程中去除了腐殖酸物质和PCR抑制剂。
从表层土壤和粘土样品中分离出的DNA浓度比较。
Norgen土壤DNA提取试剂盒和Competitor M的试剂盒用于从250 mg表层土壤和粘土样品中分离DNA。
土壤微生物基因组提取操作流程
土壤微生物基因组提取操作流程引言：土壤微生物是土壤中一类具有重要生态功能的微小生物群体，其基因组研究有助于揭示土壤生态系统的结构和功能。
本文将介绍土壤微生物基因组提取的操作流程，以帮助研究者更好地开展相关研究工作。
一、实验前准备1. 准备样品：选择代表性的土壤样品，保证样品的新鲜度和干燥程度，避免样品中的污染物对提取过程的影响。
2. 准备试剂和设备：如细胞破碎液、蛋白酶K、RNase A、乙酸铵、异丙醇、洗涤液等，同时确保离心机、恒温器等设备的正常运行。
二、土壤样品处理1. 杀菌处理：将土壤样品干燥至常温下，然后在高温条件下进行杀菌处理，以消除样品中的细菌和真菌。
2. 粉碎：将杀菌后的土壤样品使用研钵和研钉进行粉碎，以增加样品与提取液的接触面积，便于后续的基因组提取。
3. 随机采样：取粉碎后的土壤样品，随机采样2-3次，以保证样品的代表性。
三、土壤微生物基因组提取1. 破碎细胞：将土壤样品加入细胞破碎液中，在恒温器中进行破碎细胞的处理，使微生物细胞壁破裂释放DNA。
2. 蛋白酶处理：加入蛋白酶K，使蛋白质降解，以去除蛋白质的干扰。
3. DNA沉淀：加入异丙醇，使DNA与异丙醇共沉淀，然后通过离心将DNA沉淀下来。
4. 洗涤：用乙酸铵洗涤DNA沉淀，以去除杂质。
5. DNA溶解：用溶解液将洗涤后的DNA溶解，使其溶于溶液中，便于后续的测序和分析。
四、DNA质量检测1. 琼脂糖凝胶电泳：将提取的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA条带的形态和迁移情况，以判断DNA的质量和纯度。
2. 分光光度计测定：使用分光光度计测定DNA的吸光度，计算DNA的浓度和纯度。
五、保存和存储1. 冻干保存：将提取的DNA样品进行冻干处理，以延长其保存时间。
2. 低温保存：将冻干后的DNA样品存放在低温环境中，如-20℃或更低的温度下，以保持其稳定性和完整性。
六、实验质控1. 实验对照：设置正对照和空白对照样品，以评估提取过程中的污染情况。
土壤微生物总DNA提取方法的优化
土壤微生物总DNA提取方法的优化一、本文概述土壤微生物作为地球生态系统中不可或缺的组成部分，其在物质循环、能量流动以及土壤肥力的维持等方面发挥着重要作用。
然而，要深入了解这些微生物的生态学、生理学特性及其与环境的相互作用，首先需要从土壤中提取出高质量的微生物总DNA。
本文旨在探讨土壤微生物总DNA提取方法的优化，以期提高DNA的提取效率和纯度，为后续的分子生物学研究提供可靠的基础。
本文首先回顾了土壤微生物总DNA提取的常用方法，包括物理法、化学法以及生物法等，并分析了各种方法的优缺点。
在此基础上，本文重点介绍了几种常用的土壤微生物总DNA提取试剂盒及其特点，同时结合实验室的实际情况，探讨了影响DNA提取效果的关键因素，如土壤类型、微生物群落结构、提取试剂的选择和浓度等。
通过对比实验，本文优化了土壤微生物总DNA提取的条件，包括提取剂的种类和浓度、提取时间、温度等，以期提高DNA的提取效率和纯度。
本文还探讨了提取过程中可能出现的问题及其解决方案，如DNA的降解、污染等。
本文总结了优化后的土壤微生物总DNA提取方法，并对其在实际应用中的前景进行了展望。
通过不断优化和完善土壤微生物总DNA提取方法，有望为土壤微生物生态学、分子生态学等领域的研究提供更为准确、高效的技术支持。
二、材料与方法本研究选用了多种土壤类型，包括森林土、农田土、草地土等，以全面探究不同土壤环境下微生物总DNA提取的效果。
同时，选择了多种常用的土壤微生物DNA提取试剂盒，以及不同品牌和型号的土壤研磨机、离心机等实验设备，以评估其对DNA提取效果的影响。
将采集的土壤样品进行预处理，包括去除石块、植物残体等杂质，然后进行研磨和过筛，以获得更均匀的土壤样品。
接着，按照不同提取试剂盒的说明，分别进行土壤微生物总DNA的提取。
在提取过程中，我们对多个关键步骤进行了优化，包括提取缓冲液的选择、提取温度和时间、研磨方式等。
通过对比不同条件下的DNA提取效果，筛选出最佳的提取条件。
土壤微生物细菌dna提取实验报告
土壤微生物细菌dna提取实验报告大学土壤微生物分离实验报告从土壤中分离纯化培养微生物并作初步观察鉴定【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离与纯化，根据细菌在选择培养基的存活情况，确定该菌种的固氮解磷解钾属性。
【关键词】细菌芽孢杆菌培养基、选择培养基的配制高压蒸汽灭菌前言：在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。
群落是不同种类微物的混和体。
为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。
这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。
分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。
实验目的：1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理与方法。
2、学习、掌握微生物的鉴定方法。
3、对提取的土样进行微生物选择培养、分离、纯化，根据菌落的存活状况来判断未知菌的属性。
实验原理：菌种来源:选择无机磷农药含量较高的土壤,有机磷农药化工厂旁边的土壤和排污口区的污水.培养基的选取：五组选择培养基，分别以辛硫磷、甲胺磷、敌敌畏、草甘膦及五种有机磷农药混合为微生物生长的唯一氮源磷源。
分离纯化微生物：稀释倒平板法、涂布平板法、稀释摇管法、平板划线分离法。
此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：（一）选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。
（二）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。
微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，也可以用肉眼观察其菌落形态。
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微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130−1137 Microbiology China © 2010 by Institute of Microbiology, CAStongbao@基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@ 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24研究报告湿地土壤微生物DNA 提取及其脱腐技术李靖宇1 赵吉2* 边玉2 武琳慧2 于景丽2(1. 内蒙古大学生命科学学院 内蒙古 呼和浩特 010021) (2. 内蒙古大学环境与资源学院 内蒙古 呼和浩特 010021)摘 要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。
本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。
在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。
与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。
关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法DNA Extraction and Removing Humic Substance fromWetland SoilLI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2(1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China )(2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China )Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies.Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。
直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分析[2]。
为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。
纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树李靖宇等: 湿地土壤微生物DNA 提取及其脱腐技术1131/wswxtbcn脂[7]、离子交换和高效分子量排阻层析[8]、电洗脱[9]、琼脂糖凝胶电泳[10]和醋酸铵沉淀[10]。
但这些纯化处理增加了复杂性, 且费时费力。
Taq DNA 聚合酶基因突变[11]可增加对腐殖酸等PCR 抑制物的抗性, 不需要对基因组DNA 进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析。
本文旨在细胞裂解前去除腐殖酸获得较纯的DNA 提取物, 探索能够满足后续分子生物学分析的微生物总DNA 提取方法。
土壤中腐殖酸含有大量的活性功能基团, 如羧基和羟基[12], 具有很强的与环境中离子反应和结合的能力[13]。
本文通过二价阳离子与腐殖酸的结合反应, 最终获得一种高效去除腐殖酸的可用于微生物分子生态多样性研究的土壤微生物总DNA 提取新方法。
1 材料与方法1.1 土样采集和保藏供试土样采集于内蒙古高原天然湿地, 包括: 锡林郭勒典型草原(恢复草原土壤-1和退化草原土壤-2) 2个参比土样以及锡林河中游(河边底泥-3、河中心沉积物-4、牛厄湖塔头间土壤-5、河堆积岸灯芯草土壤-6) 4个湿地土样, 共6个样品, 分别记为W1、W2、W3、W4、W5、W6, 对应于图2至图7中的1、2、3、4、5、6。
采集深度: 0−10 cm 。
6种土壤样品的部分理化性质见表1。
1.2 DNA 提取新方法(1) 取1 g 过筛的土样(一般0.5−1.5 g)于2 mL 离心管中, 加入1.5 mL 脱腐缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L Na 4PO 7, 100 mmol/L Na 2EDTA, 1.0% PVP, 100 mmol/L NaCl, 0.05% Triton X-100, pH 10.0), 涡旋混匀, 12000 r/min 离心5 min, 弃上清。
(2) 加入1 mL 0.5 mol/L 的氯化钙溶液, 涡旋混匀, 12000 r/min 离心5 min, 弃上清。
(3) 加入1 mL 0.05 mol/L 的草酸钠溶液(pH 7.96), 涡旋混匀, 12000 r/min 离心5 min, 弃上清。
(4) 加入700 µL DNA 提取缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl, 1.5 mol/L NaCl, 1% CTAB, pH 8.0), 涡旋混匀, 加入100 µL 溶菌酶溶液(100 g/L), 颠倒几次, 37°C 、200 r/min 温育30 min, 每隔10 min 取出颠倒混匀一次。
(5) 加入200 µL SDS 溶液(20%), 颠倒混匀, 65°C 温育1 h, 每隔10 min 取出颠倒混匀一次。
(6) 12000 r/min 离心5 min; 取上清950 µL 上清液于1.5 mL 离心管中, 12000 r/min 离心5 min 。
(7) 取上清900 µL 于2 mL 离心管中, 加入等体积的酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。
(8) 取上清800 µL 于2 mL 离心管中, 加入等体积的酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。
1基本理化性质Basal physical and chemical propertiesW1 W 2 W 3 W 4 W 5 W 6 1000 µm 100 100 100 99.10 100 100 500 µm 99.89 99.67 93.73 79.91 100 100 250 µm96.80 90.31 52.18 18.93 91.56 93.43 100 µm 68.62 53.37 17.15 5.75 30.71 24.72 50 µm 47.23 33.12 9.13 2.28115.28 4.7 10 µm 16.62 13.70 0.661 0 3.79 0 5 µm 7.86 6.49 0 0 0.98 0 粒度(µm)和百分比 Size and percentage2 µm1.298 0.93 0 0 0 0 有机碳(g/kg)Organic carbon (g/kg) 70.69 62.60 25.08 23.01 27.53 18.09 全氮(g/kg)Total nitrogen (g/kg) 2.115 2.037 1.089 0.271 1.179 0.976微生物生物量C (µg/g) Microbial biomass carbon (µg/g)987.01731.21246.35191.88622.13442.801132微生物学通报2010, Vol.37, No.8/wswxtbcn(9) 取上清700 µL 于1.5 mL 离心管中, 加入等体积的氯仿 : 异戊醇(24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。
(10) 取上清600 µL 于1.5 mL 离心管中, 加入等体积的氯仿 : 异戊醇(24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。
(11) 取上清500 µL 于1.5 mL 离心管中, 加入0.6倍体积的异丙醇, 冰浴20 min, 12000 r/min 离心10 min 。
(12) 弃上清, 用70%的酒精洗沉淀2−3次, 自然干燥。
(13) 50 µL TE 溶解沉淀。
1.3 DNA 提取方法二使用北京百泰克生物技术有限公司生产的土壤基因组DNA 快速提取试剂盒(离心柱型), 稍作修改。