湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术

微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS

tongbao@https://www.360docs.net/doc/159824999.html,

基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.360docs.net/doc/159824999.html, 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24

摘要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法

DNA Extraction and Removing Humic Substance from

Wetland Soil

LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2

(1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China )

(2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China )

Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies.

Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic

从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分

析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树

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脂[7]、离子交换和高效分子量排阻层析[8]、电洗脱[9]、琼脂糖凝胶电泳[10]和醋酸铵沉淀[10]。但这些纯化处理增加了复杂性, 且费时费力。Taq DNA 聚合酶基因突变[11]可增加对腐殖酸等PCR 抑制物的抗性, 不需要对基因组DNA 进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析。

本文旨在细胞裂解前去除腐殖酸获得较纯的DNA 提取物, 探索能够满足后续分子生物学分析的微生物总DNA 提取方法。土壤中腐殖酸含有大量的活性功能基团, 如羧基和羟基[12]

, 具有很强的与环

境中离子反应和结合的能力

[13]

。本文通过二价阳离

子与腐殖酸的结合反应, 最终获得一种高效去除腐殖酸的可用于微生物分子生态多样性研究的土壤微生物总DNA 提取新方法。

1 材料与方法

1.1 土样采集和保藏

供试土样采集于内蒙古高原天然湿地, 包括: 锡林郭勒典型草原(恢复草原土壤-1和退化草原土壤-2) 2个参比土样以及锡林河中游(河边底泥-3、河中心沉积物-4、牛厄湖塔头间土壤-5、河堆积岸灯芯草土壤-6) 4个湿地土样, 共6个样品, 分别记为W1、W2、W3、W4、W5、W6, 对应于图2至图7中的1、2、3、4、5、6。采集深度: 0?10 cm 。6种土壤样品的部分理化性质见表1。

1.2 DNA 提取新方法

(1) 取1 g 过筛的土样(一般0.5?1.5 g)于2 mL 离心管中, 加入1.5 mL 脱腐缓冲液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L Na 4PO 7, 100 mmol/L Na 2EDTA, 1.0% PVP, 100 mmol/L NaCl, 0.05% Triton X-100, pH 10.0), 涡旋混匀, 12000 r/min 离心5 min, 弃上清。

(2) 加入1 mL 0.5 mol/L 的氯化钙溶液, 涡旋混匀, 12000 r/min 离心5 min, 弃上清。

(3) 加入1 mL 0.05 mol/L 的草酸钠溶液(pH 7.96), 涡旋混匀, 12000 r/min 离心5 min, 弃上清。

(4) 加入700 μL DNA 提取缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl, 1.5 mol/L NaCl, 1% CTAB, pH 8.0), 涡旋混匀, 加入100 μL 溶菌酶溶液(100 g/L), 颠倒几次, 37°C 、200 r/min 温育30 min, 每隔10 min 取出颠倒混匀一次。

(5) 加入200 μL SDS 溶液(20%), 颠倒混匀, 65°C 温育1 h, 每隔10 min 取出颠倒混匀一次。

(6) 12000 r/min 离心5 min; 取上清950 μL 上清液于1.5 mL 离心管中, 12000 r/min 离心5 min 。

(7) 取上清900 μL 于2 mL 离心管中, 加入等体积的酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。

(8) 取上清800 μL 于2 mL 离心管中, 加入等体积的酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。

表1 土壤样品的基本理化性质

Table 1 Properties of soil sample used in DNA extraction

基本理化性质

Basal physical and chemical properties

W1 W 2 W 3 W 4 W 5 W 6 1000 μm 100 100 100 99.10 100 100 500 μm 99.89 99.67 93.73 79.91 100 100 250 μm

96.80 90.31 52.18 18.93 91.56 93.43 100 μm 68.62 53.37 17.15 5.75 30.71 24.72 50 μm 47.23 33.12 9.13 2.281

15.28 4.7 10 μm 16.62 13.70 0.661 0 3.79 0 5 μm 7.86 6.49 0 0 0.98 0 粒度(μm)和百分比 Size and percentage

2 μm

1.298 0.93 0 0 0 0 有机碳(g/kg)

Organic carbon (g/kg) 70.69 62.60 25.08 23.01 27.53 18.09 全氮(g/kg)

Total nitrogen (g/kg) 2.115 2.037 1.089 0.271 1.179 0.976微生物生物量C (μg/g) Microbial biomass carbon (μg/g)

987.01

731.21

246.35

191.88

622.13

442.80

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(9) 取上清700 μL 于1.5 mL 离心管中, 加入等体积的氯仿 : 异戊醇(24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。

(10) 取上清600 μL 于1.5 mL 离心管中, 加入等体积的氯仿 : 异戊醇(24 : 1), 12000 r/min 离心5 min 。

(11) 取上清500 μL 于1.5 mL 离心管中, 加入0.6倍体积的异丙醇, 冰浴20 min, 12000 r/min 离心10 min 。

(12) 弃上清, 用70%的酒精洗沉淀2?3次, 自然干燥。

(13) 50 μL TE 溶解沉淀。

1.3 DNA 提取方法二

使用北京百泰克生物技术有限公司生产的土壤基因组DNA 快速提取试剂盒(离心柱型), 稍作修改。准确称量0.5 g 的新鲜土样到1.5 mL 灭菌的干净离心管中, 加入1 mL 的抽提液, 加入5 μL 的溶液A, 振荡1 min, 充分混匀后37°C 水浴10 min (每隔3 min 剧烈振荡混匀); 加入100 μL 溶液B, 振荡1 min, 充分混匀后65°C 水浴10 min (每隔3 min 剧烈振荡混匀); 10000 r/min 离心10 min 取上清到新的1.5 mL 的离心管中; 加入1/3体积蛋白质沉淀液, 充分颠倒混匀; 冰浴8 min, 13000 r/min 离心10 min 取上清; 纯化柱的处理: 在纯化柱中间加入500 μL 溶液C, 静置1 min, 10000 r/min 离心过滤; 将上一步得到的上清液加入到处理过的纯化柱中, 低速离心(2000 g )过滤, 收集下滤液(含有DNA); 准确估计下滤液的体积, 加入0.6倍体积的异丙醇, 充分混匀, 13000 r/min 离心10 min, 小心倒掉上层滤液, 倒扣离心管直到晾干, 最后用50 μL TE 溶解。

1.4 DNA 提取方法三

采用中国科学院沈阳应用生态研究所分子生物学实验室微生物资源与生态组2006年东北三省微生物分子生态学研究技术培训班实验讲义中环境样品总DNA 提取方法, 稍加修改。取1 g 土壤样品加900 μL 提取Buffer (100 mmol/L Tris + 100 mmol/L EDTA + 1.5 mol/L NaCl), 涡旋5 min; 加50 μL 溶菌酶(100 g/L)涡旋混匀, 37°C 、200 r/min 、30 min, 每隔10 min 取出颠倒混匀一次; 加入100 μL 20% SDS, 65°C 、30 min 混匀, 每隔10 min 颠倒混匀一次; 降至室温, 8000 r/min 离心10 min; 取上清800 μL 加入0.2倍体积KAc (8 mol/L), 冰浴10 min, 室温下

14000 r/min 离心20 min; 取800 μL 上清加入0.5倍体积PEG (50%), 加入0.1倍体积的NaCl (5 mol/L)混匀, 4°C 放置2 h; 室温下14000 r/min 离心20 min; 弃上清, 加入70%的乙醇洗涤沉淀; 室温干燥后, 700 μL TE 溶解核酸; 加入等体积的酚 : 氯仿 : 异戊醇(25 : 24 : 1), 轻轻颠倒混匀, 室温下12000 r/min 离心10 min; 取600 μL 上清, 加入等体积的氯仿 : 异戊醇(24 : 1), 轻轻颠倒混匀, 室温下12000 r/min 离心10 min; 取500 μL 上清, 加入0.1倍体积的NaAc (3 mol/L), 加入0.6倍体积的异丙醇, 混匀, 4°C 沉淀2 h; 室温下14000 r/min 离心20 min; 弃上清, 70%乙醇洗沉淀, 室温下14000 r/min 离心10 min; 弃上清, 干燥后加入50 μL TE 溶解。

1.5 氯化钙去除腐殖酸试验

取2 g 湿地土壤样品平均分成两份分别置于2 mL 的离心管中, 分别加入1.5 mL 的脱腐缓冲液, 涡旋混匀, 12000 r/min 离心5 min, 取1.5 mL 上层液体于另外一支新的1.5 mL 离心管中; 取750 μL 上层液体于另外一支新的1.5 mL 离心管中, 且同时加入750 μL 0.5 mol/L 的氯化钙溶液, 颠倒几次混匀, 12000 r/min 离心5 min, 然后转移液体到一支新的1.5 mL 离心管中, 分别稀释3倍后在320 nm 处测其光吸收值。

1.6 16S rDNA PCR 扩增

反应体系: dNTPs (2.5 mmol/L) 2.0 μL 、27F (10 mmol/L) 1.0 μL 、1492R (10 mmol/L) 1.0 μL 、10 × Buffer (Promrga) 2.5 μL 、Taq 酶(5 U/μL) 0.2 μL 、模板1 μL 、加ddH 2O 到25 μL 。通用引物[16]: 27F (5′- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TA CGGHTACCTTGTTACGACTT-3′)。反应条件: 94°C 5 min; 94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 80 s, 30个循环; 72°C 10 min 。

1.7 紫外线光谱法测定DNA 的产量和纯度

利用NanoDrop ? ND-1000紫外-可见光分光光度计(Nano-Drop Technologies, Wilmington, DE, USA)测定DNA 提取样品在230 nm 、260 nm 和280 nm 下的OD 值。基因组DNA 未经过纯化和稀释直接取2 μL DNA 的TE 溶液进行测定。

1.8 基因组DNA 和16S rDNA 的琼脂糖凝胶电泳 1.8.1 基因组DNA 的琼脂糖凝胶电泳: 取 5 μL DNA 提取液与1 μL 6 × 上样缓冲液点样于0.8%琼

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脂糖凝胶上, 置于TBE 缓冲液(pH 8.3)进行电泳。100 V 50 min, EB 染色5 min, 利用UVItec DBT-08凝胶图像分析系统成像。

1.8.2 16S rDNA 的琼脂糖凝胶电泳: 取 5 μL 16S rDNA 扩增产物与1 μL 6 × 上样缓冲液点样于1%琼脂糖凝胶上, 置于TBE 缓冲液(pH 8.3)进行电泳。EB 染色5 min, 利用UVItec DBT-08凝胶图像分析系统成像。

2 结果与讨论

2.1 氯化钙-SDS -酶法建立依据

加入脱腐缓冲液[15]可以在细胞裂解前去除一部分腐殖酸, 同时增加样品洗脱步骤, 可以去除可溶性的抑制物和胞外DNA [16]。对于腐殖质中弱酸基团, 较高的钙离子表面络合常数(logK int = ?0.52)表明与腐殖质有很强的亲合力, 能形成稳定的金属-腐殖质化合物[17]。氯化钙与腐殖质反应生成沉淀能有效去除腐殖质, 效果见图1, 320 nm 处光吸收值A 1 = 3.777, A 2 = 0.531, 去除率为85.93%。加入草酸钠能螯合多余的钙离子和其他金属离子。

图1 氯化钙去除腐殖酸效果

Fig. 1 Effectiveness of humic acid removal by Calcium

Chloride

注: A1: 处理前; A2: 处理后.

Note: A1: Pre-treatment; A2: Post-treatment.

目前DNA 提取缓冲液中加有EDTA 螯合剂[5,9,14,18?19], 未加入EDTA 螯合剂的比较研究未见报道[10]。DNA 提取缓冲液加入到土壤样品在氯化钙与土壤腐殖酸反应生成沉淀之后, 如果DNA 提取缓冲液中加入EDTA 螯合剂, EDTA 可以将氯化钙与腐殖酸形成的沉淀溶解, 释放出腐殖酸, 降低了氯化钙去除腐殖酸的效率, 影响DNA 提取纯度, 故本方法在DNA 提取缓冲液中未加EDTA 螯合剂。

细胞裂解破壁通常结合化学裂解与酶裂解进行, 主要是变性剂和细胞裂解酶结合使用。变性剂使用最广泛的是SDS [5,9?10,20?21], 细胞裂解酶使用最多的是溶菌酶[22?23]。所以, 为了该提取方法更加普遍和适用, 本文采用了SDS 与溶菌酶相结合的方法裂解细胞。

DNA 的沉淀可以使用乙醇、聚乙二醇8000和异丙醇, 使用聚乙二醇8000和异丙醇的DNA 产量少于使用乙醇的产量, 且聚乙二醇可能影响PCR, 乙醇沉淀DNA 有利于腐殖酸的共沉淀, 所以选择异丙醇沉淀DNA 。本法在提取土壤基因组DNA 过程中, 去除腐殖质的关键步骤是脱腐缓冲液和氯化钙溶液的使用。

2.2 氯化钙-SDS-酶法与其他两种方法对6种不

同土壤基因组DNA 提取纯度和PCR 扩增

氯化钙-SDS-酶法和其他两种土壤基因组DNA 提取方法提取基因组DNA 结果分别见图2、3、4, 3个重复。结果表明, 3种方法提取土壤微生物基因组DNA 的重复性都很高。基因组DNA 的OD 值测定结果见表2, 新方法提取DNA 的260/280值与其他两种方法提取DNA 的260/280值差异显著, 除W6号样品差异不显著外, 新方法的260/280值高于其他两种方法的260/280值, 且比Zhou J 等[5]、Dave S Bachoon 等[24]报道的高, 比C Yeates 等[25]稀释100倍后高, C Yeates 等[25]稀释100倍仅有1.69这个值高于本文的所有值。新方法提取DNA 的260/230值与方法二提取DNA 的260/230值差异极显著, 260/230值高于方法二; 新方法提取DNA 的260/230值与方法三提取DNA 的260/230值差异显著, 除W6号样品差异不显著外, 260/230值都高于方法三, 且比Jackson CR 等[7]报道的高, Dave S Bachoon 等[24]报道的260/230值最小为1.09, 最大为1.35, C Yeates 等[25]稀释100倍后最小为1.10, 最大值是1.69, 而该法最小0.89, 最大1.97。

PCR 扩增是土壤DNA 提取的主要用途, Taq DNA 聚合酶对腐殖酸很敏感, 腐殖酸的存在影响扩增反应[5] , 成功的PCR 扩增通常作为一种合适的土壤DNA 纯度指标[26]。16S rDNA 扩增时, 新方法提取DNA 样品W1、W2、W5稀释25倍, W3、W4、W6稀释5倍, 3个重复, PCR 结果见图5, 结果表明氯化钙-SDS-酶法所提取的基因组DNA 可以用于扩增16S rDNA, 重复性高。方法二和方法三分别提取

A1 A2

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的6个DNA 样品在原始浓度、稀释5倍、25倍和100倍下进行PCR, 结果分别见图6、图7。图6结果表明, W4号样品在5倍、25倍和100倍稀释下有条带, 且在100倍稀释下, 条带最亮; W3和W5号样品在100倍稀释下有条带。图7结果表明, W1号

样品在25倍和100倍稀释下有条带, 且在100倍稀释下条带亮; W2号样品在25倍稀释下有条带; W3号样品在原始浓度和5倍稀释下有条带; W5号样品在25倍和100倍稀释下有条带, 条带都比较亮; W6号样品在5倍和25倍稀释下有条带。

表2 3种方法对6种不同土壤提取的微生物基因组DNA 的产量和纯度

Table 2 Yield and purity of extracted microbial genomic DNA from six different soils by three methods

Sample

Method

DNA Yield (mg/L)

260

A 280 260/280 260/230 Valid N W 1 1 113.81Aa ± 7.87 2.28Aa ± 0.16 1.41Aa ± 0.09 1.61Aa ± 0.01 1.32Aa ± 0.07 3 W 1 2 505.74Bb ± 15.07 10.11Bb ± 0.30 8.15Bb ± 0.44 1.24Bb ± 0.04 1.03Bb ± 0.10 3 W 1 3 57.10Ac ± 45.50 1.14Ac ± 0.91 0.75Aa ± 0.56 1.49Ac ± 0.09 1.14ABb ± 0.02 3 W 2 1 72.68A ± 8.19 1.45A ± 0.16 0.93Aa ± 0.10 1.56Aa ± 0.01 1.31Aa ± 0.14 5 W 2 2 127.16

B ± 18.97 2.54B ± 0.38 1.78Bb ± 0.31 1.43Bb ± 0.04 0.74Bb ± 0.02 3 W 2 3 37.82

C ± 6.13 0.76C ± 0.12 0.52Ac ± 0.08 1.46Bb ± 0.02 0.89Bb ± 0.09 3 W 3 1 94.45Aa ± 17.67 1.89Aa ± 0.35 1.13Aa ± 0.20 1.67a ± 0.03 1.81A ± 0.10 3 W 3 2 53.75Ab ± 15.05 1.08Ab ± 0.03 0.74Ab ± 0.23 1.46ab ± 0.04 0.57B ± 0.06 3 W 3 3 9.30Bc ± 2.68 0.19Bc ± 0.05 0.14Bc ± 0.05 1.36b ± 0.22 1.04C ± 0.11 3 W 4 1 44.27Aa ± 9.07 0.89Aa ± 0.18 0.58Aa ± 0.11 1.52Aa ± 0.06 1.97Aa ± 0.62 5 W 4 2 39.78Aa ± 4.75 0.80Aa ± 0.10 0.56Aa ± 0.05 1.41Aa ± 0.07 0.58Bb ± 0.03 3 W 4 3 6.74Bb ± 3.00 0.13Bb ± 0.06 0.14Bb ± 0.08 1.05Bb ± 0.19 0.91Bb ± 0.19 3 W 5 1 199.82 ± 12.65 4.00 ± 0.25 2.66 ± 0.21 1.50Aa ± 0.04 0.92Aa ± 0.06 4 W 5 2 239.29 ± 91.52 4.79 ± 1.83 3.50 ± 1.36 1.37Bb ± 0.01 0.70Bb ± 0.02 3 W 5 3 172.90 ± 56.71 3.46 ± 1.13 2.31 ± 0.81 1.51Aa ± 0.05 0.72ABb ± 0.12 3 W 6 1 72.16A ± 12.01 1.44A ± 0.24 1.01A ± 0.17 1.43 ± 0.00 0.89Aa ± 0.07 5 W 6 2 130.36B ± 12.90 2.61B ± 0.26 1.93B ± 0.18 1.35 ± 0.01 0.72Bb ± 0.02 3 W 6

10.45C ± 3.08

0.21C ± 0.06

0.17C ± 0.05

1.27 ± 0.24

0.95Aa ± 0.08

注: 大写字母表示差异极显著(P < 0.01), 小写字母表示差异显著(P < 0.05).

Note: Uppercase letters represent most significantly different (P < 0.01), and lowercase letters represent significantly different (P < 0.05).

图2 6种不同土壤微生物基因组DNA 电泳图(3个重复)-新方法

Fig. 2 Gel electrophoresis of microbial genomic DNA (three duplicates) from six different soils by new method

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图3 6种不同土壤微生物基因组DNA 电泳图(3个重复)-方法2

Fig. 3 Gel electrophoresis of microbial genomic DNA (three duplicates) from six different soils by method two

图4 6种不同土壤微生物基因组DNA 电泳图(3个重复)-方法3

Fig. 4 Gel electrophoresis of microbial genomic DNA (three duplicates) from six different soils by method three

图5 6种不同土壤微生物基因组16S rDNA 扩增电泳图(3个重复)-新方法

Fig. 5 Gel electrophoresis of microbial genomic 16S rDNA amplification (with different dilutions) from six different soils

by new method

图6 6种不同土壤微生物基因组16S rDNA 在不同稀释倍数下扩增电泳图-方法2

Fig. 6 Gel electrophoresis of microbial genomic 16S rDNA amplification (with different dilutions) from six different soils by

method two

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图7 6种不同土壤微生物基因组16S rDNA 在不同稀释倍数下扩增电泳图-方法3

Fig. 7 Gel electrophoresis of microbial genomic 16S rDNA amplification (with different dilutions) from six different soils by

method three

3 结论

氯化钙-SDS-酶法可以高效去除腐殖酸, 所提取的DNA 纯度较高, 片段大小约为23 kb 左右, 可用于扩增16S rDNA, 且耗时短, 大约4 h 左右完成DNA 的提取, 可应用于草原、湿地或沉积物等富含腐殖质环境中的微生物群落结构研究。

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2010年部分生物、农林类学术期刊联合征订表(2-1)

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2-504

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实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法） 1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。 2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。关于植物总DNA 的提取主要有两种方法： 1．CTAB 法： CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。 2．SDS 法：利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS）使DNA 与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA 为107~109bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA 的分子量为克隆片段长度的4 倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA 的方法必须考虑两个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase 对DNA 的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA 的机械剪切破坏。几乎所有的DNase 都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较学号

学校代码学号分类号密级本科毕业论文学院、系环境与资源学院专业名称环境科学年级2010级学生姓名指导教师 2014年5月

不同土壤DNA提取和纯化试剂盒及方法的比较摘要环境样品DNA的提取和纯化不仅是土壤微生物进行研究的前提条件，而且是环境宏基因组学中最关键的技术问题之一，DNA的产量和纯度对后续的一系列的分子生物学技术操作如：多聚酶链反应(PCR)扩增、核酸内切酶酶切消化、核酸分子杂交等等，都会产生很大的影响，所以后续试验有效进行，必须要先获得一定纯度、数量、有较好代表性和适当片段长度的DNA。本文针对三种典型的土壤类型（壤土、粘土和沙土），对目前应用比较广泛的三种不同的DNA 提取方法和四种不同的DNA 纯化方法的效果进行了比较。经过NanoDrop分光光度计和琼脂糖凝胶电泳对从三种典型土壤中提取和纯化的DNA的浓度和纯度进行检测，结果表明：Power Soil? DNA提取试剂盒和苯酚 - 氯仿抽提，异丙醇沉淀纯化方法的结合能提供满足环境组学研究的宏基因组测序要求的DNA。关键词：土壤微生物,DNA,提取,纯化

Comparison of DNA extraction and purification methods from different soils Abstract The extraction and purification of DNA from environmental samples is not only a prerequisite for microbial research, and is one of the environmental metagenomics most critical technical issues, the yield and purity of DNA on the subsequent series of molecular biology techniques operate such as: polymerase chain reaction (PCR) amplification,restriction enzyme digestion, the nucleic acid hybridization, etc. will have a huge impact, if follow-up tests effectively, you must first obtain a certain purity, quantity, better DNA fragments representative and appropriate length. In this paper, we have compared several different methods of DNA extraction and purification for three different soil, loam, sandy clay . After a NanoDrop spectrophotometer and by agarose gel electrophoresis and purified from the extract of the soil of three DNA concentration and purity, and the results showed that: Power Soil ? DNA extraction kit and phenol-chloroform extraction and isopropanol precipitation purification methods' combined provides the right DNA for the study of environmental groups metagenomic sequencing. Keywords:Microbial soil, DNA , Extraction, Purification

磁珠法土壤基因DNA提取试剂盒

磁珠法土壤基因组DNA提取试剂盒 MagBeads Soil DNA Extraction Kit ［目录号】SMDE-5005、SMDE-5010 【运输条件】2~25 C；【保存条件】磁珠分散液2~8 C；蛋白酶K -20 C；其它组分室温保存; 【试剂盒组成】【注意事项】 1. 磁珠悬浮液严禁反复冻融和离心，以免磁珠受到损害，使用前务必充分混匀； 2. 使用前请检查裂解液1和裂解液2是否出现沉淀，如有沉淀请将试剂瓶置于65 C水浴中温热至液体澄清； 3. 蛋白酶K长期不使用，请置于-20 C保存，融化后4C保存，并尽快使用；【产品简介】本试剂盒适用于从新鲜或冷冻的干燥土壤中提取基因组DNA。试剂盒采用独特的缓冲液

体系，在裂解液环境中基因组DNA与磁珠高效结合，经过清洗和洗脱等步骤之后，可去除土壤中的杂质与腐植酸，获得高质量基因组DNA产物，OD260/OD280比值一般在1.7~1.9之间, 可直接用于酶切、PCR、电泳、Southern Blot、分子标记等下游分子生物学实验。【试剂盒说明】【自备仪器、耗材和试剂】手动普通版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、EP管（2.0mL ）、EP管配套用磁力架、异丙醇、无水乙醇、RNase A 溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH值8.0）。手动高通量版：涡旋混合仪、水浴锅或金属浴、48孔尖底板、48孔板配套专用磁力架、超强磁板架48孔板专用硅胶盖、异丙醇、无水乙醇、RNase A溶液（100mg/mL，分散液：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH 值8.0 ）。【手动普通版】本操作方法在2.0mL EP管中进行操作。 1. 释放土壤微生物称取100~500mg 土壤样本至2.0mL EP管中，依次加入1.0mL裂解液1和20卩蛋白酶K，涡旋振荡1~3min，将土壤样本分散均匀，58 C温浴10min，期间每隔5min颠倒3次混匀内容物。注：1）如需去除RNA，请额外加入5 RNase A溶液；2）干燥的土壤样本请研磨至均一细小颗粒，有助于微生物的高效释放。 2. 获得土壤基因组DNA粗液室温、12000rpm将EP管离心5min，然后转移全部上清液至新的 2.0mL EP管中。加入 400卩裂解液2，颠倒混匀，再次室温、12000rpm将EP管离心5min。 3. 核酸结合转移全部上清液至另一只2.0mLEP管，依次加入400卩屏丙醇和50卩磁珠悬浮液（提前摇晃均匀），涡旋振荡5min。 4. 磁性分离将EP管置于磁力架上静置约20s至磁珠吸附完全，如EP管内盖有残留磁珠，可保持EP管

dna粗提取的实验步骤

实验步骤——以洋葱为实验材料： 1、称取30克已切碎的洋葱，放入研钵中，加入少量石英砂助研，倒入10mL 2mol/L 的氯化钠溶液，充分研磨。洋葱含有挥发性刺激物，有效减少刺激，才能使实验顺利进行。上课前，教师可先将洋葱放入冰箱冷冻一会儿，使其凉透但又不能结冰；或将洋葱切成几大块，放入清水泡一会儿，让其挥发性刺激物溶于水，可以减轻刺激。然后将洋葱切碎备用。研磨的目的主要是使洋葱细胞破裂，使DNA溶于2mol/L的氯化钠溶液，没必要将洋葱研成粥糊状，后者既浪费时间又影响实验效果。研磨时，切忌使用搅拌器（榨汁机）。使用搅拌器虽可以提高研磨效率，但搅拌器将洋葱切成极细小的颗粒，无法通过过滤将洋葱颗粒剔除。只能将酒精直接倒入滤液中，许多洋葱小颗粒因为轻会漂浮起来，DNA藏在其中，无法分辨。学生看不到白色纤维状粘稠物的DNA。 2、研磨后，用漏斗和纱布将汁液过滤到小烧杯中，得到滤液。 3、向滤液中加入95%的酒精溶液20mL，沿烧杯壁缓缓倒入，不要震动或搅拌。此时，烧杯中的液体分为上、下两层，下层较浑浊，上层澄清，很快上层溶液中就会有白色纤维状粘稠物析出，用玻璃棒可将其轻轻卷起。实例: 用鸡血细胞液粗提取DNA 并鉴定步骤 1、提取鸡血细将制备好的鸡血细胞液(已在课前配好) 5~10mL，注入到50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5min，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL 的烧杯中，取其滤液。图示胞的细胞核物质 2、溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液40 mL 加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA 在溶液中呈溶解状态。 3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。 4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL 的烧杯中。取纱布上的黏稠物。 5、将DNA 的粘稠物再溶解取一个50 mL 烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2mol/ L 的NaCl 溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl 溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。 6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100 mL 烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液(DNA 溶于滤液中)。 7、提取含杂质较少的DNA 在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95% 的酒精溶液50 mL(加入时动作要慢)，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。取两支20 mL 的试管，各加入物质的量浓度为0.015mol/ L 的NaCl 溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。

土壤DNA提取

1 试验材料吉林省松江河镇人参栽培土壤。每份土壤样品经多点取样后充分混匀，用前过10 目筛，去除土壤中的须根、枯枝等杂物[2]。 1 . 2 仪器设备及药品电子分析天平、恒温水浴锅、紫外凝胶成像系统、电泳槽、电泳仪、高速冷冻离心机、微量加样器、PCR 仪等。 TENP 缓冲液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100mmol/L Na Cl，1% PVP，pH 10.0）、CTAB 提取缓冲液（100mmol/L Tris，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L Na3PO4，1.5mol/L Na Cl，1%CTAB，pH 8.0）、 SDS 提取缓冲液（100 mmol/LTris，50 mmol/L EDTA，50 mmol/L Na Cl，pH8.0，灭菌后加β-巯基乙醇至10 mmol/L）、异丙醇、氯仿、异戊醇、无水乙醇、琼脂糖、EB、Taq DNA 聚合酶、d NTP、6×凝胶上样缓冲液、DNAMarker 等。主要试剂有十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ）、十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）、异硫氰酸胍，均为分析纯级。 1 .3 试验方法 1.3.1 土壤微生物的洗涤取土壤样品2g，置于50m L 灭菌的离心管中；加入10m L TENP 缓冲液[3]悬浮土样，磁力搅拌器搅拌15 min；10000r/min 离心5min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本无色；最后将沉淀收集至1.5ml 离心管中。 1.3.2 DNA 的提取 1.3. 2.1 CTAB 法按照李钧敏[4]的方法略作改动。将沉淀重悬于500μl CTAB 提取缓冲液→65℃水浴2h→8000r/min，室温离心15 min，取上清→加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1），12,000r/min 离心10 min，取上清→加入0.6 倍体积的异丙醇，4℃淀过夜→12000 r/min 4℃离心20min 收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100 μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。 1.3. 2.2 SDS 法按照焦晓丹[5]的方法略作改动。取沉淀，重悬于500μl SDS 提取缓冲液，轻轻混匀→向管中加入50μL 20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA 断裂→65℃保温2h，每隔20min 轻轻摇匀1 次→加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇（24∶1），混匀后12000r/min 离心10min，取上清→加入2 倍体积的无水乙醇，静止于室温下2h →以12000r/min 离心20min，收集DNA 沉淀→70%乙醇漂洗两次→干燥后将沉淀溶于100μl p H 8.0 TE 缓冲液，备用。

实验 __DNA的粗提取与鉴定

实验 DNA 的粗提取与鉴定教学目的 1．初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2．观察提取出来的DNA 物质。实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使DNA 充分溶解而使杂质沉淀或DNA 沉淀而杂质溶解。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA 对蛋白酶、高温和洗涤剂（可以溶解细胞的细胞膜，除去脂质和蛋白质，而对DNA 没有影响）都具有较好的耐性。 4． DNA ＋二苯胺?? →?沸水浴蓝色（用于DNA 的鉴定）实验材料：鸡血细胞液（5-10ml ），体积分数为95%的酒精溶液（冷却），蒸馏水，质量浓度为0.1g/ml 的柠檬酸钠溶液(抗凝剂)，物质的量浓度分别为2mol/l 和0.015mol/l 的氯化钠溶液，二苯胺试剂实验步骤 1．材料制备 0.1g/ml 柠檬酸钠100ml 置于500ml 烧杯内→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清液→即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀）活鸡血180ml

[思考]为什么要除去血液中的上清液？ 2．方法步骤取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质（1）提取鸡血细胞的细胞核物质原理：血细胞吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂（2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L）（4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上（5）DNA粘稠物再溶解：在50ml的烧杯中注入20ml 2mol/L的NaCl溶液，缓慢搅拌3 min 使上述粘稠物尽量多的溶解在溶液中。（6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋冷却的95%的酒精50ml，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。（8）DNA鉴定：

土壤总DNA的几种提取方法

土壤总DNA的几种提取方法 SDS 高盐法(方案1) 具体步骤: 称取1 g 土壤,放入研钵中,倒入适量的液氮,立即研磨;再倒入适量的液氮,研磨,重复3 次,使土壤颗粒研成粉末; 将13.5 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸盐[pH = 8.0 ] ,0.1 mol/L EDTA [pH 8.0 ] ,0.1 mol/L Tris-HCl [pH 8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1.0 % CTAB) 和50μl 蛋白酶K(10 g/L ) 与5 g 土壤置于50 ml 的离心管中,放入37 ℃恒温摇床上,225 r·min - 1振荡30 min ; 加入1.5 ml20 % SDS ,轻轻混匀,65 ℃水浴加热2 h ,每隔15～30 min 轻轻摇匀1 次;5 000 r·min - 1离心10 min ,将上清液转入新的50 ml 离心管中;取4.5 ml 提取缓冲液加入原离心管,摇匀泥浆,加入0.5 ml 20 % SDS ,65 ℃水浴15 min ,用上述同样的离心速度离心10 min ,将上清液与原上清液合并;再重复此步骤1 次; 用与上清液等量的三氯甲烷于离心管中混匀,5000 r·min - 1离心20 min ;收集上清液,并加入0.6 倍体积的异丙醇,室温静置1 h ;25 ℃下12 000 r·min - 1离心20 min ,倒出上清液,干燥后加入500μl 去离子水,溶解粘附于离心管壁的DNA 及其杂质,并收集于1.5 ml 的微型离心管中. 变性剂加SDS 高盐法(方案2) 具体步骤：取1 g 土样和等量的灭菌石英砂在研钵中混合,加入1 ml 变性剂(4 mol/L异硫青酸胍,10mmol/L Tris-HCl [pH 7.0 ] ,1 mmol/L EDTA[pH 8.0 ] ,0.5 % 2-巯基乙醇) ;液氮冰冻,研磨至溶解,重复3 次; 转入50 ml 离心管中,加入9 ml 提取缓冲液(0.1 mol/L磷酸钠[pH 7.0 ] , Tris-HCl [ pH 7.0 ] , 0.1 mol /L EDTA [ pH8.0 ] ,1.5 mol/L NaCl ,1 %CTAB ,2 %SDS) ;65 ℃水浴1 h ,每10 min 轻轻混匀1 次;5 000 r·min - 1 离心10 min ,取上清; 在原管中加入5 ml 提取缓冲液,混合后,65 ℃水浴10min ,离心,取上清,合入上述上清液;重复一次;加入等体积的氯仿混合,5 000 r·min - 1离心20 min ,取上清;加入0.6 倍体积的异丙醇,室温沉淀1 h ;20～25 ℃,12 000 r·min - 1离心20 min ,TE 溶解沉淀. SDS-酚氯仿抽提法（方案3）称取1g土壤样品，加入1ml 0.1mol/l PH8.0 磷酸缓冲液，玻璃珠振荡1min。溶菌酶5mg，使终浓度为 2.5mg/ml,室温振荡15min,放置冰箱30min，加125ul 20%SDS振荡处理15min，离心，分装EP管，加酚（1：1体积），抽提1次，氯仿-异戊醇（1：1体积），抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置1h,离心，70%乙醇清洗，200Ul TE 溶解。冻融溶菌酶SDS裂解法（方案4）取1g土壤样品，加如0.5ml灭菌的抽提缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl , 100 mmol/L EDTA, 200 mmol/L NaCl, 1.0% PVP, 2.0%CTAB , PH8.0）, 加玻

实验6 动物肝脏中DNA的提取

实验六：动物肝脏中DNA的提取及定量测定一、实验目的 1、学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术。 2、了解常见生化组分提取技术。 3、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。二、实验原理核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形成存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA 主要存在于核仁及胞质中，在制备核酸时应防止过酸、过碱及其他能引起核酸降解的因素的作用。全部操作过程应在低温下(4℃)进行，必要时还要加入酶抑制剂。如柠檬酸、氰化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸(EDTA)等可以抑制DNA酶活性，皂土可抑制RNA酶活性，同时SDS 或苯酚等蛋白变性剂也可使核酸降解酶破坏。动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液(如1mol/L NaCl)，但在0.14mol/L的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。将抽提得到的脱氧核糖核蛋白用SDS(十二烷基硫酸钠)处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成w-羟基-r-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物(λmax=595nm)。 DNA(脱氧戊糖基) [H+]HO-CH2-C(=O)-CH2-CH2-CHO 二苯胺蓝色化合物在DNA浓度为20~200μg/ml范围内，吸光度与DNA浓度成正比，可用比色法测定。三、实验器材猪肝，分光光度计（595nm），比色杯，匀浆器，量筒（50ml、10ml），离心机(5000r/min)，离心管，试管及试管架，移液管（1.0ml、2.0ml、5.0ml），恒温水浴锅四、实验试剂氯化钠，柠檬酸钠，95%乙醇，SDS，氯仿，异戊醇，二苯胺试剂，DNA标准溶液（200μg/m1），二苯胺试剂等。五、实验操作 1、配制溶液： 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（2.925g氯化钠，20.85g柠檬酸钠，溶解于500mL 蒸馏水）。氯仿-异戊醇混合液：按照体积比20:1配制500mL。 5％SDS溶液：10g SDS溶于200ml水中。二苯胺试剂：称取纯二苯胺（如不纯，需在70％乙醇中重结晶2次）5克溶于500ml 分析纯的冰醋酸中，再加入50ml过氯酸(A.R，60％以上)，混匀待用。当所用药品纯净时，配得试剂应为无色。临用前加入5ml 1.6％乙醛溶液(乙醛溶液应保存于冰箱中，一周内可使用)，贮于棕色瓶。 2、称取猪肝2g，用匀浆器磨碎(冰浴)，加入4ml的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min下离心10min，弃上清；沉淀中再加入6ml缓冲液，于4000r/min离心10min；取沉淀。

湿地土壤微生物DNA提取及其脱腐技术

微生物学通报 AUG 20, 2010, 37(8): 1130?1137 Microbiology China ? 2010 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@https://www.360docs.net/doc/159824999.html, 基金项目：国家973计划前期研究专项项目(No. 2009CB125909) *通讯作者：Tel: 86-471-4991676; : ndzj@https://www.360docs.net/doc/159824999.html, 收稿日期：2010-01-25; 接受日期：2010-05-24 摘要: DNA 分子生物学技术的广泛应用, 为全面了解微生物群落提供了有力的工具。本文建立了一种新的从湿地土壤中提取微生物总DNA 的方法, 即氯化钙-SDS-酶法。在直接提取DNA 过程中采用氯化钙去除腐殖酸, DNA 提取缓冲液中不使用EDTA 螯合剂, 提取过程用时4 h 左右。与其他两种方法相比, 该方法高效去除湿地土壤腐殖酸, 纯度较高, 满足PCR 扩增, 为微生物生态学研究提供了一种高效的湿地土壤微生物总DNA 提取和纯化技术。关键词: 湿地土壤, DNA 提取, 腐殖酸, PCR 扩增, 氯化钙-SDS-酶法 DNA Extraction and Removing Humic Substance from Wetland Soil LI Jing-Yu 1 ZHAO Ji 2* BIAN Yu 2 WU Lin-Hui 2 YU Jing-Li 2 (1. College of Life Sciences , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) (2. College of Environment & Resources , Inner Mongolia University , Huhhot , Inner Monglia 010021, China ) Abstract: DNA-based molecular biology techniques have widely been used as a powerful tool to un-derstand the microbial community. In this paper, a new method to extract microbial genomic DNA from wetland soil was established, namely Calcium Chloride-SDS-Enzymatic. Calcium chloride rather than EDTA chelating agent was used to remove humic acids in the process of direct DNA extraction. The extracting time is less than 4 hours. In comparing with other two methods, this method is more efficient in removing humic acids from wetland soil, and the purity of extracted DNA is higher which can be ap-plied to PCR amplification. It provides an efficient technology to extract and purify microbial genome DNA from soil for microbial ecological studies. Keywords: Wetland soil, DNA extraction, Humic acid, PCR amplification, Calcium chloride- SDS-enzymatic 从土壤和沉积物样品中提取微生物总DNA 是研究微生物多样性的前提和基础, 方法大致可以分为直接提取和间接提取两大类[1]。直接提取法获得DNA 的量较大, 但腐殖酸的存在会影响到下游的分析[2]。为了获得纯度较高的微生物总DNA, 需要对其进行纯化处理。纯化处理的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法[3]、PVPP 纯化法[4]、CTAB 法[5]、氯化铯密度梯度离心法[6]、交联葡聚糖和琼脂糖凝胶过滤树

dna提取实验步棸

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入5ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。（2）转入2ml 离心管中（转2管或4管），每管转入1ml，用台式离心机以12000 rpm 离心5min,弃上清收集沉淀。（3）加入300ul 10×TE缓冲液悬浮沉淀（4）加入100μl 200mg/ml的溶菌酶，37℃水浴1h；（4）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml蛋白酶K在50℃恒温水浴锅中水浴3h ,间歇振荡数次。（4）加入100μl 5mol/L NaCl，65℃水浴10min （5）加等量（570ul）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心12000 rpm，10min。（6）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离心12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。（7）加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀20min ，12000 rpm离心,10min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。（8）用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ，5min。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。（11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。（12）Nanophotometer仪测定DNA浓度及OD值。（13）-20℃保存备用。 1.3.2菌群16S rRNA基因V3高变区PCR扩增（1）16S rRNA基因V3高变区通用引物： V3F：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R：5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G为GC 夹。

实验室土壤DNA提取方法

改良CTAB-SDS法 1、称取1 g土壤样品，加1ml DNA提取液（0.1 mol/L Tris-Hcl；0.1 mol/L EDTA； 0.1 mol/L 磷酸钠；1.5 mol/L Nacl；1％CTAB；pH 8.0,将各种试剂按配置的体积数称量混合即可。），在漩涡震荡仪上混匀。 2、加入100ul溶菌酶温和37℃裂解30min,液氮冷冻10 min，65℃水浴10 min，反复冻融3次。 3、加入20％ SDS缓冲液溶液100μl，65℃水浴2h，每20 min轻轻颠倒几次。8000 r/min离心10 min，取上清。 4、剩余残渣中再加500μl DNA提取液和100μl SDS 缓冲液，65℃水浴30 min，8000 r/min室温离心10 min，取上清，合并两次的上清液。 5、等体积的氛-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提2至3次(氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次)，静置10min，12000rpm，10min取上清。 6、加入0.1倍体积的NaAc和0.6倍体积的无水乙醇混匀，4℃沉淀过夜。 7、13000 r/min离心5 min，70%乙醇清洗2次，30μl ddH 2 O溶解。 8、提取粗DNA在0.6%（1%）的Agrose，70 V（100V）电压下电泳1.5 h（40min）。注意事项：这个千万不要4℃过夜啊，4℃过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。提取土壤微生物总DNA的纯度和浓度检测对提取的土壤微生物总DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测,同时采用紫外分光光度计分别测定提取土壤微生物总DNA稀释液在230 nm，260 nm，280 nm处的光密度值。以OD 260/OD 280 （DNA/蛋白质），OD 260 /OD 230 （DNA/腐植酸）比值检测DNA纯度。 DNA浓度=OD 260 值×50μg／ml×80×DNA 溶液体积／干土质量[68]

实验一 DNA提取

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明

土壤基因组DNA提取试剂盒使用说明货号：D2600 规格：50T/100T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。试剂盒内容：D2600-50T D2600-100T 溶液A25ml50ml 溶液B3ml6ml 溶液C5ml10ml 溶液D10ml20ml 漂洗液15ml15ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个收集管50个100个 PCR增强剂500ul1ml 说明书1份1份注：试剂盒开封后溶液A、B、C、D需在2-8℃保存。PCR增强剂-20℃保存。产品简介: 本试剂盒适合于从褐土、淤泥、火山灰等各种极端土壤环境中提取微生物DNA。对土壤中各种细菌、真菌有很好裂解效果，最大限度的保留了微生

物DNA的多态性。本试剂盒采用我公司特有的腐殖质吸附材料，可高效专一的去除各种腐殖质成分而丝毫不会影响DNA的产率，纯度较酚、氯仿抽提法提高数倍。使用本试剂盒提取的DNA产量大、完整性好，可直接用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。操作步骤：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、称取土壤样本0.1-0.5g，在液氮中充分研磨成细粉末，加入450ul溶液A震荡混匀。 *也可直接称取样本0.1-0.5g于离心管(建议使用2ml圆底管)，加入450ul溶液A剧烈震荡混匀1-2min至没有固体块。使用液氮研磨效果最佳。 2、加入50ul溶液B充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，65℃水浴6min，每2min充分颠倒混匀一次。 3、加入100ul溶液C充分颠倒混匀(不要剧烈震荡)，12000rpm离心10min。 4、将上清转移到新的离心管，12000rpm离心2min。 5、在吸附柱中加入200ul溶液D，将离心后的上清加入到带有溶液D 的吸附柱中，用移液器吹吸几次混匀，12000rpm离心1min。 6、将收集管中的滤出液混匀后重新吸入吸附柱(必须)，12000rpm离心1min。

PowerSoil 试剂盒提取土壤DNA

PowerSoil 试剂盒提取土壤DNA 1、加入0.25g 土壤样品到一个PowerBead Tubes中。 2、轻轻涡旋混匀。 3、检测Solution C1。若出现沉淀，60℃水浴至全溶解。 4、加入60μl Solution C1，上下颠倒数次混匀。 5、把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速（3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5~10min）涡旋连续振荡10min。 6、室温10000g离心30s。 7、转移上清至一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。 8、加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育5min。 9、室温10000g离心1min。 10、避开沉淀小珠，转移上清≤600μl 到一个新的收集管（2ml Collection Tube）中。 11、加入200μl Solution C3到上清中，涡旋混匀。4℃孵育5min。 12、室温10000g离心1min。 13、避开沉淀小珠，转移上清≤750μl到一个新的收集管中。 14、Solution C4 使用前先摇匀。加入1200μl Solution C4到上清中，涡旋混匀5s。 15、加载约675μl 上清到Spin Filter 中，室温10000g离心1min。弃去滤液，继续加载675μl 上清，室温10000g离心1min。重复直至过滤完所有上清。（每个样品共需加载3 次。） 16、加500μl Solution C5到Spin Filter 中，室温10000g离心30s。 17、弃去上清 18、室温10000g 离心1min。 19、小心转移Spin filter 到2ml Collection Tube 中，尽量避免Solution C5 污染。 20、加入100μl Solution C6到白色滤膜中心。 21、室温10000g 离心30s。 22、弃去Spin Filter。此时收集管中的DNA 可直接用于下游实验，无需进一步纯化。DNA 冷冻保存（-20℃~-80℃）。

简单DNA提取实验

实验材料透明杯子、筷子、盐、洗洁精、冰箱冷藏的白酒、冰块、隐形眼镜护理液、蒸馏水、牙签等实验步骤 1.获取口腔上皮细胞。含一口蒸馏水，开始漱口，试着用自己的舌头舔口腔内壁，大约2分钟； 2.用透明的杯子收回口腔中的液体； 3.在杯中加入半勺盐，缓慢搅拌10圈，记住动作要慢哦； 4.在杯中加入洗洁精5~6滴，均匀慢速地搅拌3分钟，切记越慢越好； 5.加入5滴隐形眼镜清洗液，继续缓慢搅拌10圈，加入冰块静置5分钟； 6.再次搅拌10圈，从冰箱拿出冷藏的白酒，缓慢倒入杯中，于是酒精便自然分层游离在唾液上方，唾液则沉淀在杯底； 7.由于DNA不溶于酒精，此时在上清下浑的酒精和唾液分层中间，能看到固态絮状的DNA。用筷子轻轻搅拌，将DNA缠绕起来，缓缓拉出水面，就能目睹DNA的真容了。这就是你的DNA哦！ 8.将DNA放入小瓶中，也可加入一些精油或酒精。这样，一条兼具观赏价值与特殊含义的精油项链就做好了。实验原理：

DNA主要存在于真核生物的细胞核中，动物、植物都属于真核生物。在高温的条件下，DNA会变性(被破坏)，而在常温和低温条件下，则可以保存。由于哺乳动物成熟的红细胞不含有细胞核，因此人类的血液当中含有的DNA是比较少的，如果想要在非实验室环境下提取自己的DNA，建议选择其他容易获得的细胞，比如口腔的上皮细胞等。下面我们就对具体操作步骤中涉及的原理进行解释 1.获取细胞：用漱口的方式，获取的是口腔的上皮细胞。 2.盐的作用：在漱口时细胞已经破碎，加盐可吸附DNA。带正电的钠离子会和DNA分子中带负电的区域发生反应，可使DNA分子聚到一起。 3.洗洁精的作用：洗洁精中含有十二烷基硫酸钠，它可以破坏细胞膜，这样就可以将细胞内的物质溶解于溶液当中，从而释放DNA，也可用牙膏、洗发香波等来代替。 4.缓慢搅拌：防止用力太大，速度太快会使DNA断裂。 5.隐形眼镜清洗液的作用：去除镜片上的蛋白质，主要是依靠清洗液中含有的蛋白酶，蛋白酶可以分解溶液中的蛋白质。加入隐形眼镜清洗液，其中蛋白酶的成分就可去除溶液中蛋白质的干扰，使DNA 更容易被提取出来，也可用菠萝或嫩肉粉来代替。 6.冰块和冷藏酒：在低温环境下，由于DNA不溶于酒精，因此可以析出DNA。如果是植物细胞，就先要加洗洁精，然后再加盐。因为植物细胞有细胞壁，清水中不能吸水胀破。所以要先去除细胞壁。另外，在实验室提取DNA的过程中，会进行多次的氯化钠(NaCl)浓度调节，并且