猪圆环病毒2型病

C端融合TC Tag标签的Cap C端融合DC靶向 Tag 标签的Cap C端融合胸腺肽α1（27aa) 的Cap C端融合胸腺肽α1+ DC Tag 的Cap
对病毒颗粒形成的检测

1） 表达野生型和改造后的Cap蛋白，纯化 后的蛋白通过电镜负染，观察病毒样颗粒 的是否形成以及形态。
猪圆环病毒2型病毒样 颗粒疫苗的研究
汇报人： 张 2011.11.17 鹏
提纲




研究背景 总体思路 疫苗抗原的选择及优化 表达系统的选择 原核大肠杆菌系统及优化 真核酵母表达系统及优化 佐剂的选择 保护剂的选择 疫苗的最终组装
研究背景

猪圆环病毒（PCV-2）自2000年传到中国，目前以广泛流行于我国绝大部分猪 场。PCV-2导致猪免疫力低下和严重的发育障碍，是危害世界养猪业的最为重 要的疫病之一。目前很多人把PCV-2称做猪的HIV。 PCV-2疫苗主要为细胞灭活苗和杆状病毒载体疫苗。 灭活苗使用PK-15和PKK细胞（从PK-15中挑选对PCV-2敏感的细胞克隆） 扩增PCV-2。这两株细胞系均可扩增 PCV-2，但是病毒增殖3-5代后才可看到 70%左右的细胞病变（CPE），病毒滴度低。由于病毒得到比较困难，所以 PCV-2灭活苗的每个头份都在10元以上，这比普通疫苗的价位高10-20倍。 杆状病毒圆环疫苗主要是生产Cap病毒样颗粒或Cap/Rep（ ORF1（PCV-1） /ORF2(PCV-2) ）嵌合病毒颗粒样疫苗。即用杆状病毒表达所形成的嵌合病毒 样颗粒。该疫苗具有非常好的免疫效果。但是因为蛋白纯化的的高费用和免 疫时所需的高抗原剂量，因此价格每头份在30元左右，成本高。 我们目标：应用现代分子生物学方法生产圆环病毒2型的病毒样颗粒，结合传 统和新型疫苗佐剂，开发具有自主知识产权的，成本低，免疫效果好的猪圆 环病毒2型病毒样颗粒疫苗


总体思路
大肠杆菌SUMO 表达系统 酵母SUMO 表达系统
真菌疏水 蛋白保护剂 口服免疫 免疫效果 评价
免疫佐剂 注射免疫
疫苗抗原

Fra Baidu bibliotek

1） wt-Cap 2) N 端缺失的Cap 3） N端密码子优化的Cap 4) N端修饰的Cap 5) 6） 7） 8)
（多个Cap修饰蛋白）
Cap 的M变为C（半胱氨酸）后可被单一聚二乙醇(PEG)修 饰。修 饰后的Cap在体内半衰期延长。
利用pP-αhSUMO3 酵母表达系统生 产圆环病毒病毒样颗粒
目的基因cap
重组酵母 表达质粒p pP-αhSUMO3-Cap 表达载体pP-αhSU MO3-Cap
蛋白纯化， 扫描电镜 Sumo 蛋白酶 在毕氏酵母 观察病毒样 GS115中表达 切除sumo 颗粒 标签，获得 天然蛋白
酵母表达优化策略
TC Tag C端 病毒样颗粒动态示踪 V5 Tag DC细胞 M细胞 靶向tag
标记病毒样颗粒疫苗
DC或M细胞靶向疫苗
N端
异源核酸
DNA疫苗导入系统
真菌疏水蛋白作为圆环病毒病毒样 颗粒口服疫苗的保护剂研究
颗粒样疫苗在 胃肠道中稳定性
真菌 疏 水 蛋白 包裹 疏水蛋白的 脱膜条件和位点 疏水蛋白对病毒 样颗粒进入 DC细胞和M细胞的影响
圆环 病毒 病毒样颗粒
口服 途径 免疫动物
评价真菌 疏水蛋白作为 口服疫苗保护剂 的可行性
免疫效果检测
后续开展工作
Hsp16.5 PCV2 VLPs
真菌疏水蛋白作为圆环病毒病毒样 颗粒口服疫苗的保护剂研究

真菌疏水蛋白是一类具有强表面活性的分 泌型小分子量蛋白质。疏水蛋白的重要特性是 能在亲水 - 疏水界面通过自我组装形成一层紧 密稳定的约10nm厚的两性蛋白膜。疏水蛋白 具有表面活性并能够自我组装，疏水蛋白对温 度却非常的稳定 同时既无带细胞毒性也无强 免疫原性 , 有望成为疫苗耐热保护剂和口服导 入的良好载体。
表达系统的改进
1 SUMO原核表达载体系统的优化 1） 抗原部分优化 （参考上一张幻灯片） 2）表达载体优化 （1）纯化标签由原先His标签改为MBP标签； 增加可溶性和纯化纯度，降低纯化成本。 （2）在MBP标签前加入TEE增强剂，增强 Cap蛋白的表达。 （3） 构建Cap -SD序列多重串联融合表达载 体，实现对Cap的多重高效表达。



1 按照标准实验方案完成对野生型Cap的表达， 纯化，完成相关专利的申请。 2 合成切割SUMO-3相关的蛋白酶，降低购买 商品化蛋白酶的昂贵成本。 3 根据原核表达情况，选择免疫原性更高的 改造后Cap做为抗原，同时利用优化后的酵母 表达系统对Cap进行真核表达。
圆环病毒样颗粒疫苗新型佐剂研究
2）用改造后的cap基因替换野生型PCV-2基 因组中的cap基因，转染猪视网膜上皮细胞， 检测是否有病毒粒子的产生。

利用原核SUMO表达系统生产圆环 病毒病毒样颗粒
Cap目的蛋白 表达载体 pSMK-cap pSMK载体 在大肠杆菌 rossta中表达 蛋白纯化， 切除sumo 标签，获得 天然蛋白 扫描电镜 观察病毒样 颗粒