细胞工程第7章干细胞[可修改版ppt]

（2）分化抑制物的选择
目前有三种分化抑制物比较常用： ➢①饲养层（feeder layer） ➢②条件培养基（conditioned medium，CM） ➢③白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,
LIF）
① 饲养层细胞 feeders
是将选用的细胞经γ射线照射或经 丝裂霉素C（mitomycin C）处理 而阻断其有丝分裂所得到的细胞 层。常用的有STO（一种已成系 的小鼠成纤维细胞）、原代小鼠 胎儿成纤维细胞、同源胎儿成纤 维细胞和子宫上皮细胞，其中前 两种比较常用。
细胞工程第7章干细 胞
干细胞(stem cells)
• 干细胞是具有自我复制和多项分化潜能的 原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人 体各种组织、器官的祖先细胞。
干细胞的分类
按来源分类
或按发育阶 段分类
胚胎干细胞 成体干细胞
按分化潜能分类
全能干细胞 多能干细胞 专能干细胞
胚胎wenku.baidu.com细胞
（embryonic stem cell，ESCs，简称ES或EK细胞）
C：组织培养法
• 胚胎用外源激素处理后，所分化出的胚泡 进行体外培养，其中的ES细胞垂直向上生 长，呈卵圆柱状，可显微镜下检出另培养。
D：显微外科学法
• 用显微操作系统直接从胚泡中吸取ES细胞。
2. ES细胞的分化抑制培养
（1）、在ES细胞的培养过程中，一方面要给 以足够的营养物质以满足其增殖的需要， 另一方面要抑制其分化，其中前者由基础 培养基来解决，后者则由分化抑制物来完 成。
• 类胚体:是由胚胎干细胞在缺乏分化抑制剂 的情况下形成的球状细胞团并相互融合的 混杂集合体。
• 嵌合体：一种含有两种以上基因型组织的 机体，可能是基因突变、染色体异常分离 或移植的结果。
7.1.4 ES细胞的分化与调控
• 1. ES细胞的分化 • ES细胞在体外极易分化。 • ES细胞中碱性磷酸酶 （AKP ）及端粒酶
B:免疫外科学方法
• 利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体与补体结 合后所产生的对其它细胞的毒性杀伤作用，除去滋 养层细胞，保留ES细胞。
• 聚集在胚胎的一端，个体较大的细胞，称为内细胞 团（inner cell mass，ICM），属于ES细胞，将 来发育成胎儿的各种组织，而沿透明带内壁扩展和 排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，不能 发育成胚体，它们将来只能发育成胚外结构如，胎 膜和胎盘。
7.1.3 胚胎干细胞的全能性
• (1)指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参 与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力， 即ES细胞具有发育成完整动物体的能力。
• (2) ES细胞发育全能性的标志是ES细胞表 面表达时相专一性胚胎抗原（Stage specific embryonicant，SSEA），
活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。 • 把ES细胞与饲养层细胞共培养，可以抑制
其分化，维持其稳定的增殖状态。解除共 培养，则会导致ES细胞自发分化。
2. ES细胞分化的调控
• （1）内源性调控 • 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号
起反应从而调节其增殖和分化，包括调节 细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的 核因子等。 • 这种内源性调控主要来自ES细胞内所含蛋 白（如结构蛋白等），以及部分转录因子。
• 胚胎干细胞是早期胚胎（原肠胚期之前）或 原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体 外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特 性。
7.1 胚胎干细胞
• 胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化 细胞。它具有发育的全能性，能分化出成 体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被 诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。
• 1995年，Thomson等从恒河猴的囊胚中分离建立了世界 上第一株灵长类动物的胚胎干细胞。1998年，他们从接 受不孕症治疗的夫妇所捐献的处于囊胚阶段的早期胚胎中 分离出了人的ES细胞。同年，Gearhart的研究小组从选 择性流产所得到的胚胎生殖腺中分离出人EG细胞，研究 证实这些细胞均具有全能性，掀起了ES细胞研究的高潮。
• 1999年，《Science》将人类胚胎干细胞研究成果评为当 年世界十大科技进展之首
7.1.2 胚胎干细胞的生物学特性
• ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，
细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染 色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细 胞排列紧密，呈集落状生长。用碱性磷酸酶染色， ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。 • 细胞克隆和周围存在明显界限，形成的克隆细胞 彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。 细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。
• 而且可以检查到OTC4基因的表达，这两种 蛋白是发育全能性的标志。
(3) ES细胞的全能性的体现
• 可以形成畸胎瘤； • 可形成类胚体； • 可直接分化为特定种系的细胞； • 可形成嵌合体。
• 畸胎瘤：由种质细胞或胚胎干细胞衍生而 来的瘤性组织，排列结构错乱，往往含有 外、中、内三个胚层的多种组织成分。
（2）外源性调控
• 间质细胞的分泌因子，能维持ES细胞增殖分化等； • 膜蛋白介导的细胞间互作（信号转导）影响ES细
胞分化。 • 整合素与细胞外基质影响ES细胞的分布和分化方
向。
7.1.5 建立胚胎干细胞系
• 1、分离ES 细胞 • （1）ES细胞的主要来源：胚泡内的内细
胞群和生殖嵴中的原始生殖细胞。
7.1.1胚胎干细胞的研究概况
• 1958年，Steven通过把小鼠早期胚胎移植到129小鼠精 巢或肾脏被膜下得到了胚胎瘤细胞（embrynoic carcinoma cell, ECC）。
• 1981年，英国的Evans等用延缓着床的胚泡首次成功地 分离了小鼠ES细胞，从而拉开了ES细胞研究热潮的序幕。
• 胚泡：桑椹胚的细胞在子宫腔内继续分裂， 细胞数目不断增多，发育到第5天时已有100 多个细胞，这时细胞重新排列成泡状。
• 生殖嵴：脊椎动物胚胎后半部，背系膜侧面 中胚层形成的纵行上皮加厚的细胞条。可发 育为生殖腺。
（2）ES细胞的分离方法：
• A: 免疫学方法 • 利用ES细胞所具
有的特殊标记，借 助荧光细胞分离器 从单细胞悬液分离 ES细胞。