地高辛标记及检测试剂盒说明书讲述

仅仅研究于生命科学，不适合在诊断过程使用

只能在体外使用

地高辛DNA标记和检测试剂盒1

和NBT/BCIP一起用于颜色检测

通过酶联免疫法采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记和检测货号：11 745 832 910

此试剂盒储存条件-15o C—-25o C

此试剂盒可对10ng-3ugDNA进行12次标记反应

可检测100cm2面积的杂交膜24张

指导手册

2009.11版

1前言

1.1内容表

1前言 (2)

1.1内容表 (2)

1.2试剂盒内容 (3)

2简介 (5)

2.1产品概述 (5)

3步骤和所需材料 (8)

3.1开始之前 (8)

3.2地高辛DNA标记 (9)

3.3 标记效率的测定 (11)

3.4 DNA 的转移和固定 (14)

3.5杂交 (16)

3.6免疫检测 (18)

3.7 DNA印记的洗脱和再杂交 (20)

4结果 (21)

4.1典型的结果 (21)

5附录 (23)

5.1故障排除 (23)

5.2引用 (24)

5.3订购信息 (25)

1.2 试剂盒内容

附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得

2 介绍

2.1 产品概况

实验原则

此试剂盒采用地高辛（DIG），一种甾类半抗原，去标记DNA探针从而通过酶免疫分析

应用

地高辛标记DNA探针可以用于：

所有类型的滤膜杂交

总基因组DNA中单拷贝基因的检测，甚至对于高度复杂的生物也可以进行

检测，如人，大麦和小麦。

样品材料

至少100bp的DNA片段

线性的质粒，cos质粒或者λDNA

超螺旋的DNA

实验时间

此表格列出了每一步实验所需的反应时间

检测数量

一个试剂盒足够用于：

不超过3ug的模板DNA的12个标准的标记反应

和100cm2有24个斑点的检测

质量控制

根据操作步骤中的描述，对未标记的对照品DNA（PBR328）进行标记，0.1pg同源DNA 在点杂交中通过16h的显色来检测（1pg同源DNA可以通过1小时的显色进行检测）。

试剂盒的储存和稳定性

未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15o C到-25o C（保质期印在标签上）。在干冰中运输

一旦开封，请根据下表达选择适宜的储存条件。

灵敏度和特异性

采用southern 杂交从1ug消化胎盘DNA中检测到单拷贝人基因

注意：灵敏度同时依据在杂交中标记的DNA浓度和颜色反应的时间

优点

此表描述了这个试剂盒的优点和特征

3 实验步骤和所需材料

3.1 在你开始前

主要的操作要求

此表中描述了地高辛标记和检测中主要的提示

流程图

3.2 地高辛标记DNA

介绍

随机引物标记的DNA带有地高辛--11--dUTP，这一标记采用的是地高辛高效引物试剂，这是一种含有随机六碳糖，5乘浓度标记的混合物，其中，dNTP混合物包括碱性标记的地高辛--11--dUTP，标记级的Klenow酶和适合的反应缓冲液。

附加设备和所需试剂

水浴

冰水混合物

模板DNA

标记从琼脂糖凝胶上分离的DNA

如果你想要完成基因组的southern 杂交，你应该利用琼脂糖凝胶电泳将插入载体的模板DNA从载体上分离出来。

从凝胶中分离DNA片段，为获得更好的结果，可以用高效的PCR产物纯化试剂盒或者用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒来从凝胶中分离DNA。

步骤

此步骤用于标记10ng-3μg DNA 。可以通过扩大所有成分和体积标记更大量的DNA（最高达10μg）。

标记反应的产量

表1：

此表向您展示了在适宜条件下地高辛高效引物标记的产量。

在标准反应中每个实验采用1μg DNA 作为模板。1小时内，大约有15%的核苷酸参与到了0.8μg新合成的地高辛标记DNA中。20小时后消耗了大约38%约2μg的核苷酸。

使用地高辛高效引物溶液，增加不同模板DNA的量进行反应，并检测反应1小时和反应20小时的差异。地高辛标记DNA的产量由放射线示踪器进行测定，并通过斑点杂交进行证实（10个独立标记实验的平均值）。

3.4 标记效率的确定

介绍

地高辛标记DNA产量的确定对于获得最佳的，具有可重现性的杂交结果十分重要。在杂交混合物中探针浓度过高容易产生背景，而太低浓度则容易导致信号弱。

实验原则

检测标记探针质量的好方法是直接检测法。

所需附加溶液的制备

请找出下表中的成分和所需制备的试剂。下表中的缓冲液也可以在地高辛洗涤和封阻缓冲液，DNA酶和RNA酶系列产品中获得。

请注意：这些溶液也用于3.6中的检测步骤，可大批量准备

试剂盒工作溶液的制备

下表中列出试剂盒工作溶液的制备方法：

稀释系列

根据合成核苷酸的预期产量开始下面的的系列稀释，标记的探针和地高辛标记的对照DNA（Vial 2）应该稀释到1ng/μL。利用第3.2章中图表1可以最好的估计出在你的探针中地高辛标记DNA的预期产量。产量取决于起始时的模板量和孵育时间。

注意：表1中给出的产量是采用高纯度的DNA模板在最佳条件下生产出的。