两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则

遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。

定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

定量PCR常用的三个常用概念

扩增曲线、荧光阈值、Ct值

扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化

荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保

证回归系数大于0.99。

CT值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

C(t) value

扩增曲线阈值及CT值

荧光定量PCR的数学原理

理想的PCR反应：

X=X0*2n

非理想的PCR反应：

X=X0* (1+Ex)n

（n：扩增反应的循环次数；X：第n次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex：扩增效率）在扩增产物达到阈值线时:

XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)

XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M

方程式(1)两边同时取对数得:

log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)

整理方程式(2)得:

log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3)

由此可见，log X0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的该基因的初始模板量。

Sample

利用相对定量的方法分析目的基因的表达

研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于RNA纯化后得率不同、RNA 反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了

品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。

假定在1生理时期，X基因的表达量为X1；其内参基因表达量为Y1；X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在2生理时

期，X2/Y2就将2生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能较为真实的反应在1、2生理时期，X基因的变化情况。

常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-delta Ct法。

一、双标准曲线法

所谓的双标准曲线法就是对内参基因和所研究的目的基因都做绝对定量，然后将各生理阶段的目的基因的量和内参基因的量相除，得出一个比值；最后再将不同生理阶段所得的比值相除，最终得出目的基因在不同生理阶段的表达变化。

公式如下：

双标准曲线法的特点：

1、考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率，最大限度的避免了误

差；

2、思路直观、条理清晰、应用简便，无需像Delta-delta CT法那样对实验进行严格的优

化；

3、其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做标准曲线；

4、该方法适合样品量大，但是所分析目的基因较少的实验。

二、2 -△△CT法

公式如下：

1、2 - △△CT 方法的推导

PCR 指数扩增的公式是：

Xn 是第n 个循环后目标分子数；X 0 是初始目标分子数；Ex 是目标分子扩增效率；n 是循环数；C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数

因此：

X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数；C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数；Kx 是一个常数；对于内参反应而言，也有同样的公式：

用X T 除以R T 得到：

对于使用Taqman 探针的实时扩增而言，X T 和R T 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。

假设目标序列与内参序列扩增效率相同：

或：

X N 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△C T 表示目标基因和内标基因C T 值的差异（C T,X -C T,R ）

整理上式得：

最后用任一样本q 的X N 除以参照因子（calibrator ，cb ）的X N 得到：