细菌的培养和分离
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
细菌的分离培养与纯培养实验报告
细菌的分离培养与纯培养实验报告一、实验目的本实验旨在掌握细菌的分离培养方法，了解纯培养的原理及方法，以及熟悉细菌培养基的制备和使用。
二、实验原理1. 细菌分离培养方法细菌分离培养是指将混合菌落中的单一细菌分离出来，使其在无竞争的环境中独立生长。
常用的方法有均匀涂布法、斜坡涂布法和点式涂布法。
2. 纯培养原理及方法纯培养是指将混合菌落中同一种细菌分离出来并进行单独培养。
常用的方法有挑选法和稀释法。
3. 细菌培养基制备与使用细菌培养基是供给微生物生长发育所需营养物质和条件的一种人工环境。
根据不同需求可制备不同类型的细菌培养基，如寒偏好性、厭氧性、选择性、差异性等。
常用的细菌培养基有普通营养琼脂平板、LB 平板等。
三、实验步骤1. 细菌分离培养（1）取一支无菌的铂丝，将其消毒并冷却。
（2）取一份混合菌落，将铂丝在其表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。
（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上。
（4）重复以上步骤，涂布多个琼脂平板。
（5）将琼脂平板放置于恒温箱中，在适宜的温度下培养。
2. 纯培养（1）取一份混合菌落，在显微镜下观察并挑选出同一种细菌。
（2）取一支无菌的铂丝，在混合菌落表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。
（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上，并进行单独培养。
3. 细菌培养基制备与使用（1）按照需要制备不同类型的细菌培养基，并进行消毒灭菌处理。
（2）将需要进行分离或纯化的混合菌落均匀涂布于培养基上，进行培养。
四、实验结果1. 细菌分离培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上出现单一的细菌菌落。
2. 纯培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上只有挑选出的同一种细菌菌落。
3. 细菌培养基制备与使用制备好的细菌培养基可用于分离、纯化和大量繁殖特定细菌。
五、实验注意事项1. 实验器材需消毒并严格无菌操作。
2. 均匀涂布法需注意铂丝在琼脂平板上均匀涂布。
3. 液体培养基需注意摇晃均匀以使细菌均匀分布。
4. 实验结束后要彻底清洗和消毒实验器材和工作台面。
实验四：细菌的接种、培养和分离技术
实验四：细菌的接种、培养和分离技术一、实验目的与要求：（1）掌握从环境土壤、水体、活性污泥等中分离培养细菌的方法;从而获得若干种细菌纯培养技能（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法..（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等..二、实验原理在土壤、水、空气或人及动、植物体中;不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起;当我们希望获得某一种微生物时;就必须从混杂的微生物类群中分离它;以得到只含有这一种微生物的纯培养;这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化..为了获得某种微生物的纯培养..一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同;而供给它适宜的培养条件;或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长;而抑制其他菌生长的环境;从而淘汰其他一些不需要的微生物;再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物;直至得到纯菌株..三、实验器材1、牛肉膏蛋白胨培养基2、盛9ml无菌水的试管;盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶;1ml和5ml无菌吸管;无菌培养皿；3、接种环;土样;酒精灯等..四、操作步骤1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板;并标明培养基的名称..2、贴标签接种前在试管上贴上标签;注明菌名、接种日期、接种人姓名等..贴在距试管口径2-3厘米的位置..3、点燃酒精灯..4、接种取接种环右手拿接种环如握钢笔一样、在火焰上将环端烧红灭菌;然后将有可能伸入试管的其余部分;均用火烧过灭菌..环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管;先使环接触边壁;使其冷却..取菌种待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环;然后将接种环移出菌种管;注意不要使环的部分碰到管壁;取出后不可使环通过火焰..接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线..划线的方法很多;但无论哪种方法划线;其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释;使形成单个菌落..常用的划线方法有下列二种：⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环;先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条;再转动培养皿约70°角;并将接种环上剩余物烧掉;待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线;再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线图A..划线完毕后;盖上皿盖;倒置于温室培养..⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线图 B..划线完毕后;盖上皿盖;倒置温室培养..环灭菌将接种环烧红灭菌..5、挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上;分别置25℃和28℃温室中培养;待菌苔长出后;检查菌苔是否单纯;也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物;若有其他杂菌混杂;就要再一次进行分离、纯化;直到获得纯培养..四、注意事项1、实验操作过程中无菌操作..。
细菌的分离、培养和鉴定
② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质 （如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E）
③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】
④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养
基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，
能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；
从而达到区分不同的微生物.。（TCBS）
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ❖ 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
水可直接涂布平板
• 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生
长状况
（注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭
台面，保持操作台的整洁）
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二、细菌的培养
培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物 培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。
培养基的种类
① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物 质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂）
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生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
细菌的培养与分离技术
细菌的培养与分离技术● 考点◇ 基本条件◇ 细菌的接种与分离技术◇ 细菌培养的方法◇ 细菌的生长现象◇ 细菌L型的检查【内容讲解】细菌培养是将细菌接种到培养基内，并在适当的环境内，使细菌生长和繁殖。
分离培养是指从标本中培养出细菌或者从混有多种细菌的标本中将各个菌种分别同时培养出来。
一、基本条件（一）细菌实验室（二）无菌实验室（三）基本设备和器具（一）细菌实验室标本接种、培养、分离、鉴定及药敏试验等工作都要在此完成。
1.细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。
且室内禁用风扇，避免细菌的播散。
2.细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面lm处，每天开始工作前照射20min。
对其消毒效果要定期检查，及时更换失效的灯管。
3.室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。
同时还应备有供工作人员浸手用的盛有消毒剂的水盆、肥皂及自来水源等。
4.室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦洗l次。
5.对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。
同时要对用过的物品及时进行灭菌处理。
6.细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。
同时室内应设置必要的消防设备。
（二）无菌实验室无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。
1.无菌室应完全封闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。
2.用前应以紫外线消毒30min，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。
3.在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他操作。
4.无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。
5.条件有限的实验室，可用超净工作台代替无菌实验室进行相应的操作。
超净工作台应选择垂直气流通风方式。
6.无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。
（三）基本设备和器具温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；显微镜；高压蒸气灭菌器、干烤箱；冰箱和冷藏柜；接种器具，包括接种环和接种针；pH计；火焰灯或酒精灯；平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。
细菌的培养与分离
– 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖（醇）类、血 液、鸡蛋和动物血清、无机盐类、生长因子
2.水：蒸馏水或去离子水 3.凝固物质：即赋形剂，常用琼脂、明胶
一、培养基
4.抑制剂
– 抑制非检出菌的生长或使其少生长，以利于检 出菌的生长。
– 胆盐、煌绿、亚硫酸钠、某些染料及抗生素等。
5.指示剂
– 常用的指示剂：酚红、中性红、中国蓝、溴甲 酚紫、酸性复红等。
– 菌落：单个细菌在培养基上分裂繁殖成一堆肉 眼可见的细菌集团 • CFU：菌落形成单位，活菌计数用
– 细菌菌落的描述：大小、形状、突起或扁平、 边缘、颜色、表面、透明度等
二、细菌的人工培养
2. 在液体培养基中
– 均匀混浊：大多数细菌 – 沉淀生长：呈链状排列的细菌 – 表面生长：专性需氧菌
3.在半固体培养基
一、培养基
（二）培养基分类
1. 按用途分类
– 基础培养基：只有基本营养成分 – 营养培养基：加有血液 、血清等 – 鉴别培养基：含有特定底物和指示剂 – 选择培养基：含有抑制剂 – 特殊培养基：厌氧、细菌L型
一、培养基
2.按物理性状分类
– 液体培养基：增菌 – 固体培养基：分离培养、纯化、增菌 – 半固体培养基：动力检测、保存菌种
• 无菌技术是保证细菌检验质量，防止污染和病原 菌扩散的基础
二、细菌的人工培养
（二）细菌的接种与分离方法
1.平板划线法：分离单个菌落 2.琼脂斜面接种法：纯培养 3.液体培养基接种法 ：增菌 4.穿刺接种法：观察细菌动力 5.涂布平板法：计数细菌源自量 6.倾注接种法 ：纸片法药敏试验
分区划线分离法
– 琼脂斜面：分装量为试管的1/4~1/3，灭菌后趁 热摆成斜面，斜面长度约为试管的2/3。
分离培养步骤及注意事项
分离培养步骤及注意事项1准备工作细菌培养是细菌学研究的基础，能够完成细菌培养剂制备、细菌分离、细菌种系鉴定以及抗药率分析，都必须具备一定的实验基础和技能，以便能够成功完成细菌的分离培养。
2细菌分离培养步骤1.收集样品：根据实验要求，从自然界或细菌实验室中选择合适的样品，样品必须符合实验要求，很多实验还需要按照试验要求对样品进行配制、抽取、稀释处理等步骤；2.制备培养基：根据实验要求，从常用培养基中选择合适的培养基成分进行自制，搭配合适的培养条件，以降低被害菌类的生存率，并用以减少多样性；3.增殖培养：将收集的样品涂布到增殖培养基，放置于37℃的培养箱内培养发酵，一般不少于18-20小时；4.分离培养：将发酵后的培养品滴液分离部分的样品涂布到分离培养基上，放置在受限的环境内进行培养，待芽菌状散单菌形成后，锁入相应介质中保存；5.鉴定分离菌株：根据形态特征以及生理生化反应等进行菌株鉴定。
3注意事项1.实验过程中注意实验准确、认真，尤其是实验前和实验后的消毒操作，避免误操作；2.用于培养的培养基要拆封使用，不要将同一份培养基用于实验多次，以免大菌斑的影响实验结果；3.尽量使用自制的非营养性培养基，其中的阴离子成分有助于抑制竞争菌类的生长，以便成功发现所需要的细菌；4.放置培养基的培养箱应保持清洁，以及室内总体环境要维持比较干净，减少室外污染物的入侵；5.培养液中的细菌很容易在空气中繁殖，培养过程完毕后要及时封口，以免造成污染；6.对培养成功后的菌株要及时进行归档保存，如用木芯片或正规种系库菌体的保存，以便及时使用，避免菌株的变异，影响实验结果。
以上即是细菌分离培养的步骤及其对应的注意事项，只有实验操作准确、认真，并遵从相关注意事项，才能更好的完成细菌的分离培养，为细菌学研究打下坚实的基础。
细菌的分离与培养
细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
课时安排：2课时操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
实验三：细菌分离接种技术和培养
实验三 细菌分离、接种技术和培养法
目的要求：
1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。
2、掌握平板划线、斜面培养基等接种方法。
3、熟悉细菌分离培养的环境和条件。
实验内容：
1、 细菌划线分离培养：连续划线分离培养法 分区划线分离培养法
2、 纯培养获得与移植：试管间的斜面移植； 可疑菌落纯培养移植
Staphylococcus epidermidis on blood agar With on hemolysis
细菌纯培养
细菌斜面 纯培养法
细菌纯培养
液体培养基
半固体培养基穿刺培养
实验报告：
1、细菌分离培养和纯培养的实验过程。 2、本次细菌分离培养的结果。
细菌划线分离培养
Streptococcus pyogenes on blood agar, illustration b-hemolysis.
Streptococcus pneumoniae on blood agar, illustration a-hemolysis.
Staphylococcus aureus on blood agar, illustration b-hemolysis.
3、 液体培养基增菌和培养（示教）
4、 半固体培养基穿刺培养（示教）
说明：
病原菌的人工培养一般采用35～37℃，培养时间多数为18～24 h，但有 时需根据菌种及培养目的作最佳选择，如细菌的药物敏感试验则应选用对数 期的培养物。将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散 作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。一般 经过18～24 h培养后，单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为 菌落（colony）。挑取一个菌落，移种到另一培养基中，生长出来的细菌均 为纯种，称为纯培养（pure culture）。从混杂的微生物群体中获得只含有 某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。微生物在固体培养 基生长形成的单个菌落一般是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取 单菌落而获得一种纯培养。
细菌的分离培养与纯培养实验报告
实验报告：细菌的分离培养与纯培养一、背景细菌是一类微生物，是生命中最简单的有细胞结构的生物。
它们广泛存在于自然界的各个环境中，包括水体、土壤、空气和人体等。
为了了解细菌的性质、研究其生物学特性以及开发应用价值，分离培养并得到纯培养的细菌菌株是必不可少的步骤。
本次实验旨在通过分离培养的方法，从样本中分离出单一种类的细菌，然后进行纯培养，最终得到该细菌的纯培养物。
二、实验方法和步骤1. 实验材料准备•细菌样本：采集自自然环境或已知细菌株。
•培养基：根据细菌的特性选择适当的培养基，如营养琼脂平板。
•培养基成分：包括葡萄糖、氯化钠、琼脂等。
•培养基容器：如琼脂平板、试管等。
•实验器材：消毒锅、试管架、涂布棒等。
•实验仪器：恒温培养箱、显微镜等。
2. 分离培养实验步骤步骤1：样品的采集和制备从自然环境中采集待研究的细菌样品，例如土壤、水样等。
将样品收集在无菌容器中，并在实验室内进行处理。
步骤2：样品的稀释取一定量的培养基，根据需要的适宜稀释倍数（一般为10-1~10-5），将样品和培养基按比例混合，制成一系列不同稀释度的样品溶液。
使用无菌滴管，分别取适量的样品溶液接种到对应的琼脂平板上。
步骤3：平板涂布使用消毒好的涂布棒，将样品溶液均匀涂抹在琼脂平板上，然后用标签标记每个平板。
涂布完毕后，将平板倒置放在无菌培养箱中，孵育一段时间。
步骤4：单菌落的分离观察培养箱中的平板，找出生长菌落较少、分散且各不相连的菌落。
使用无菌的细胞刮取棒在菌落边缘轻轻划线，然后用刮取棒将菌落刮移到另一块琼脂平板上。
此时，细菌已被成功分离。
3. 纯培养实验步骤步骤1：选取单菌落进行培养从分离得到的细菌菌落中挑选出一个单菌落，利用无菌的细胞刮取棒将其转移到新的琼脂平板中。
步骤2：液体培养将得到的单菌落转移到含有适宜培养基的液体培养基中，如含有营养成分和抗生素的葡萄糖盐水。
利用无菌的试管，接种适量的菌落，并在恒温培养箱中以适当条件培养。
微生物检验学之细菌的培养与分离技能技术总结
精心整理细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌L 型的检查一、基本条件（一）细菌实验室1.2.3. 4. 5.菌处理。
6.7. 1. 2. 3.4. 5. pH二、细菌的接种与分离技术（一）平板划线分离法在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落，以便根据菌落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。
常用的平板划线分离法有以下两种： 1.连续划线分离法杂菌不多的标本。
2.分区划线分离法杂菌量较多的标本。
（二）斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。
（三）液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。
（四）穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。
（五）倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。
（六）涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测定，也可用于被检标本中的细菌计数。
三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。
常用的有需氧培养法、二氧化碳培培养瓶置35℃6～18h后，用肉眼观察其生长现象，如：溶血、产生气体或混浊度等。
应每天肉眼检查细菌生长情况，若为生长阳性应做进一步的分离鉴定和药敏；若为生长阴性，应孵至第7天弃去。
有些细菌如奈瑟菌属和嗜血杆菌属的菌株，心杆菌属、放线杆菌属的细菌都需要较长时间培养。
血培养孵育24h后，肉眼观察阴性的血培养瓶，一般不需做常规显微镜检查，因培养物中有105菌落形成单位CFU/ml，才能通过革兰染色检出细菌。
（三）细菌在半固体培养基中的生长现象半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有混浊或细菌生长的小菌落。
五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。
实训六细菌的分离、移植及培养
实训六细菌的分离、移植及培养性状的观察目的要求能利用不同的被检材料进行细菌的分离培养，观察细菌的培养特性，并会进一步移植培养。
仪器及材料温箱、病料、实验用菌种、营养琼脂培养基、肉渣汤（疱肉）培养基、接种环、酒精灯、烙刀、镊子、剪子等。
方法与步骤（一）细菌的分离培养1 ．平板划线分离法（视频四）平板划线是通过将被检材料连续划线而获得单个菌落，因而划线愈长，获得单个菌落的机会也愈多。
具体操作步骤如下：（1）右手持接种环于酒精灯上烧灼灭菌，待冷。
（2）无菌操作取病料若为液体病料，可直接用灭菌的接种环取病料一环；若为固体病料，首先将烙刀在酒精灯上灭菌，并立即用其将病料表面烧烙灭菌，然后用灭菌接种环从烧烙部位插入组织中缓缓转动接种环，取少量组织或液体。
（3）左手持平皿，用拇指、食指及中指将皿盖打开一侧（角度大小以能顺利划线为宜，但以角度小为佳，以免空气中细菌污染培养基）。
⑷将已取被检材料的接种环伸入平皿，并涂于培养基一侧，然后自涂抹处成30〜40°角，以腕力在平板表面轻轻地分区划线。
在细菌病诊断或药敏试验时，为了提高效率，常可将皿盖放于酒精灯附近，左手持培养基，使划线的平面与右侧台面的角度小于90°且在酒精灯附近，右手持接种环取病料连续划线。
（5）划线完毕，烧灼接种环，将培养皿盖好，用记号笔在培养皿底部注明被检材料及日期，倒置37C温箱中，培养18〜24h观察结果（实图6-1）。
凡是分离菌应在划线上生长，否则为污染菌。
2 •倾注分离法取3支融化后冷至50C左右的琼脂管，用灭菌的接种环取一环培养物（或被检材料）移至第一管中，随即用掌心搓转均匀，再由第一管取一环至第二管，搓转均匀后，再由第二管取一环至第三管经同样处理后，分别倒入三个灭菌培养皿中，待凝固后，倒置于37C 温箱中培养24h观察结果。
（实图6-2）（二）厌氧菌的分离培养厌氧菌的分离培养常用肉渣汤（疱肉培养基）培养法。
先将试管倾斜，使培养基表面露出一点，然后接种被检材料或菌种，接种后将试管直立，即封闭液面。
环境微生物学-实验四(五) 细菌的纯培养、分离
实验四（五）环境中微生物分离与培养一、实验目的1、掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾堆肥等）中分离培养细菌的方法，获得若干种细菌纯种培养技能。
2、掌握几种接种技术。
3、了解菌种的保藏方法。
二、实验仪器和材料恒温箱、涂布器、细铁丝、接种环、酒精灯、吸耳球、棉花、记号笔；无菌培养皿（直径90毫米）、无菌移液管（1毫升和10毫升）；肉汤蛋白胨培养基、高氏１号培养基、马铃薯培养基；活性污泥或土壤10克、无菌水90毫升、9毫升无菌水（试管中）；酵母、大肠杆菌。
三、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。
（一）稀释平板分离的方法1、取样用无菌锥形瓶到现场取一定数量的活性污泥或土壤，迅速带回实验室。
2、稀释水样将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6依次编号。
在无菌操作条件下，将样品（10克）置于第一瓶90毫升无菌水中，用手摇10分钟，将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。
用1毫升无菌移液管吸取1毫升10-1浓度的菌液于一管9毫微升无菌水中，同样方法，依次稀释到10-6。
每次稀释时，需用不同的无菌移液管，或将同一移液管用无菌水洗三次。
3、平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。
取1支1毫升无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5毫升菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热熔化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果。
取对照无菌培养皿，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后，观察结果。
细菌的培养和分离
二.接种技术（分离纯化技术）
方法 用具
方法
平板划线法
接种环或接种针
分区划线，形成单细 胞菌落。划线前后和 两次划线之要间灭菌
稀释涂布平板法 移液管，涂布器
将菌液进行梯度稀释 后(每次稀释10倍) ， 取样，用涂布器涂
用途
分离，鉴别
分离，鉴别，计数
梯度（系列）稀释：（1）方法：取样品1ml，放入9ml无 菌水中，每次稀释10倍，重复操作。
第二部分.细菌的培养技术 (分离和计数)
第一节.细菌的培养技术(分离和计数)
一.培养基的配制技术 (一)微生物的营养物质
营养物质
种类
功能
碳 无机： CO2、NaHCO3 提供碳骨架,用于合成 源 有机： 糖类,脂肪,蛋白质 有机物，提供能源物质
氮 无机： 铵盐、硝酸盐、N2 源 有机： 尿素,牛肉膏,蛋白胨
实验４：将突变体ａ1和ａ2一起接种于一般培养基， 数日后出现菌落。 探究实验４中出现菌落的原因(要求：提出问题， 提出假说,设计实验程序，预期实验结果，分析相 应实验结果得出的结论)。
第一节.细菌的培养技术(分离和计数)
(三)固体平板培养基配制程序 1.称量：天平 2.溶解：加热 3.调PH值：PH试纸、NaOH、HCl。 4.包扎灭菌：高压蒸汽灭菌 5.倒平板：培养皿，超净台 6.固体平板培养基应倒置存放
《细菌分离与纯培养》课件
在这个PPT课件中，我们将介绍细菌分离与纯培养的方法，并讨论其应用与意 义。
背景和目的
了解细菌的分离与纯培养的重要性及其在科学研究和应用领域的应用。
1 科学研究
帮助分离和观察不同类型的细菌，为研究其 特性和功能提供基础。
2 应用领域
为制药、食品工业以及环境监测等领域提供 重要的技术支持。
总结与展望
细菌分离与纯培养是微生物学重要的基础实验技术。随着科学技术的进步， 我们将不断改进和创新这些技术，为细菌研究和应用领域带来更多的机遇和 挑战。
实验结果与讨论
我们成功分离了多个细菌菌株，并进行了进一步观察和鉴定。实验结果显示 了不同菌株的形态特征和生长规律。通过讨论分析，我们揭示了细菌在不同 培养条件下的适应性和变异能力。
应用与意义
细菌分离与纯培养技术在医学、环境保护和食品安全等领域具有广泛的应用。通过研究细菌的特性和功能，我 们可以开发新的药物、改善食品质量，并有效控制环境中的细菌传播。
细菌分离的方法
1
无菌操作
保证实验环境和仪器器皿的洁净，避免
菌落计数法
2
外部细菌的污染。
通过分离不同菌落形态，识别细菌的类
型和数量。基的特性，选择适宜的培 养条件来分离细菌。
纯培养的方法
液体培养
在含有营养物质的液体培养基中培养细菌，方便进 行进一步实验和观察。
固体培养
使用含有琼脂的固体培养基，利用菌落形成的特点， 分离出单一细菌。
分离细菌和培养基的条件
分离细菌和培养基的条件细菌分离和培养是微生物学研究中的重要步骤，它可以使我们更好地了解细菌的特性和功能。
在进行细菌分离和培养时，需要一定的条件来保证实验的准确性和成功率。
本文将介绍分离细菌和培养基的条件。
一、细菌分离条件1. 无菌操作环境：细菌分离需要在无菌条件下进行，以避免外界细菌的污染。
实验室中的工作台、培养器具和试剂瓶等都要经过高温高压灭菌处理，操作人员要穿戴好无菌衣物和手套。
2. 样品来源：细菌可以从多种来源中分离得到，如土壤、水体、食品、人体等。
在选择样品时，要考虑到需要研究的细菌类型，并确保样品的新鲜度和质量。
3. 适当的培养基：不同的细菌对培养基的要求不同，因此选择适合目标细菌生长的培养基非常重要。
培养基的成分应包含细菌所需的碳源、氮源、矿物质和生长因子等。
4. 适宜的温度和pH值：不同的细菌对温度和pH值有着不同的适应性。
一般来说，常温下的细菌分离宜在25-30℃进行，而嗜热菌则需要在高温条件下进行。
pH值也要根据细菌的需求进行调整，通常在7左右。
5. 适当的氧气浓度：细菌对氧气的需求也不同，有些细菌需要氧气进行呼吸，而有些则为厌氧菌，不能在氧气存在下生长。
因此，根据细菌的需求选择适当的氧气浓度非常重要。
二、培养基制备条件1. 培养基成分：培养基的成分应根据细菌的需求进行选择和调配。
常见的培养基成分包括碳源、氮源、矿物质、生长因子和缓冲剂等。
这些成分可以提供细菌生长所需的营养物质和环境条件。
2. pH值调节：培养基的pH值对细菌生长有着重要的影响。
一般来说，大多数细菌的生长pH范围在6-8之间。
因此，在制备培养基时，需要根据细菌的需求调节pH值。
3. 灭菌处理：培养基在制备完成后需要进行灭菌处理，以杀灭其中的细菌和其他微生物。
常见的灭菌方法有高温高压灭菌、紫外线照射和过滤等。
4. 培养基的固化：一些细菌需要在固体培养基上进行培养，以便于单个菌落的形成和分离。
在制备固体培养基时，常用的方法是在培养基中加入凝固剂如琼脂。
细菌的分离与培养
细菌的分离与培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
课时安排：2课时操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
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第一节.细菌的培养技术(分离和计数)
(三)固体平板培养基配制程序 1.称量：天平 2.溶解：加热 3.调PH值：PH试纸、NaOH、HCl。 高压蒸汽灭菌 4.包扎灭菌： 5.倒平板：培养皿，超净台 6.固体平板培养基应倒置存放 用途：分离、纯化和计数
倒平板操作的讨论
1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用
不能区分死菌与活菌； 不适于对运动微生物的计数； 只能测量含量较高的样品； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；
六.微生物数量的测定 2.稀释涂布平板法 (活菌计数法) 每毫升或每克样品菌数 = 菌落平均数×稀 释倍数÷稀释液体积(0.1ml) (待菌落数稳定时计数，菌落数少于活菌数) 3.滤膜法 (测活菌数) 饮用水中微生物的测定 已知体 过滤 滤 放入 伊红美蓝培 积的水 膜 养基培养 统计黑色 菌落数量
第一节.细菌的培养和分离
2.无菌技术实例
操作对象 操作空间(超净台) 培养基 玻璃器皿,金属用具 无菌技术 紫外线灯消毒 高压蒸汽灭菌（121˚C） 干热灭菌（160˚C）
接种环,涂布器,管口瓶口
接种,倒平板等实验操作 衣着和手
灼烧灭菌
在酒精灯火焰附近进行 酒精消毒
3.人工操作方法： 各种操作均应在超净台的酒精灯火焰附近进行
什么办法来估计培养基的温度？
用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时 即可开始倒平板。 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基
表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表
面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培 养基，造成污染。 4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿 盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？
为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上
滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
牛肉膏 5.0克 葡萄糖 10.0克 (1)根据用途分,该培养基称 乳糖 5.0克 为_____ 鉴别 培养基,利用该培养 KNO3 2.0克 基的目的是______________. 鉴别大肠杆菌 伊红-美蓝 0.2克 (2)根所物理性质分,该培养 琼脂 12.0克 固体 培养基,该培养 基称为______ 水 定容至 基可用于微生物的_________. 分离和计数 1000ml (3)该培养基中能提供碳源的是____________, 牛、葡、乳 能提供 牛肉膏、 KNO3 从培养基成分来分析,该培养基 氮源的是 __________, 所培养的微生物的同化作用类型为______ 异养型。配制该平 板培养基培养基的程序为称量、溶解、____________ 、 调PH值 _____________ 。 高压蒸汽灭菌 、____________ 倒平板
发醉法生产酒精后的废液（pH4.3）含有大量有机物， 可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养 、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下：
（3）为确定菌体产量，图中②操作之前，应先称量 _______________的质量。过滤后需反复烘干称量，直至 _____________________。所得菌体干重等于________。
生长因子
(微量有机物)
维生素、氨基酸、 碱基、核苷酸 PO43- SO42-等
生长不可缺少，自身已无 法合成(酶,核酸的组分)
水和无机盐
维持渗透压，PH，原料
牛肉膏,蛋白胨：分别是牛肉和大豆的水解产物（主要是多肽）。
问题讨论2：判断对错
同一种物质不可能既作碳源又作氮源。 凡是碳源都能提供能量。 除水以外的无机物仅提供无机盐。 能以氮气为氮源的微生物为_______生物。 能利用无机碳源的生物属于型_______生物， 在生态系统中充当________。 只能利用有机碳源的生物属于______生物， 在生态系统中充当________。
第一节.细菌的培养和分离
(二)培养基的类型
分类 类型
物理 液体 性质 固体
成分
无凝固剂 加凝固剂(琼脂)
作用
培养(扩增)、分离 分离,计数,鉴别
某化学物质有无，允许 分离特定微生物，如含青霉 选择 特定种类微生物生长， 素培养基能分离出酵母菌和 抑制其它微生物生长。 霉菌但抑制细菌放线菌生长 按用
重 复 多 次 直 至 获 得 目 的 菌
振荡培养若干天后，测定各瓶中化合物A的含量
固体培养基
（4）转为固体培养时，常 采用 的方法接种，获得 单菌落后继续筛选。 （5）若研究“目的菌”的 生长规律，将单个菌落进行 液体培养，可采用 的 方法进行计数，以时间为横 坐标，以 为纵 坐标，绘制生长曲线。 （6）实验结束后，使用过 的培养基应该进行 处 理后，才能倒掉。
同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。
问题4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析
其可能的原因。 无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可 能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了 污染。
第一节.细菌的培养和分离
四.无菌操作技术 1.方法
（1）消毒 用温和的理化方法（酒精、紫外线）来杀 死物体表面和内部的微生物。 （2）灭菌 用强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生 物（包括芽孢和孢子）。 1.灼烧灭菌 灭菌 2.干热灭菌： 3.高压蒸汽灭菌： 4.砂芯漏斗过滤灭菌（对尿素溶液）
练习：观察表格中培养基成 分数据，回答问题：
实验设计：
实验１：将Ａ接种于一般培养基，结果出现菌落。 实验２：用放射线处理Ａ，以产生突变体ａ1，将 其接种于一般培养基，不出现菌落。但在培养基中 添加物质甲后，就出现菌落。 实验３：另用放射线处理Ａ，得突变体ａ2，将其 接种于一般培养基，也不出现菌落。但在培养基中 添加营养物质乙后，就出现菌落。 实验４：将突变体ａ1和ａ2一起接种于一般培养基， 数日后出现菌落。 探究实验４中出现菌落的原因(要求：提出问题， 提出假说,设计实验程序，预期实验结果，分析相 应实验结果得出的结论)。
31。某化工厂的染水池中，含有一种有害的、难于降解 的有机化合物A，研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以 及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化 合物A的细菌（目的菌）。实验的主要步骤如图所示。 请分析回答问题：
（1）培养基中加入化合物的目的是 筛选 ，这种培养基属 于 培养基。 （2）“目的菌”生长所需的氮源和 碳源是来自培养基中的 ，实 验需要振荡培养，由此推测“目的菌 ”的代谢类型是 。 （3）培养若干天后，应选择培养瓶 中化合物A含量 的培养液，接入新 的培养液中连续培养，使“目的菌” 的数量 。
食品 主要 微生物 制作装 置或操 作步骤 A 果酒 酵母菌 B 果醋 醋化醋杆菌 （醋酸菌） C 腐乳 毛霉 D 泡菜 醋酸菌
发醉法生产酒精后的废液（pH4.3）含有大量有机物， 可用于培养、获得白地霉菌体，生产高蛋白饲料。培养 、制取白地霉菌体的实验过程示意图如下：
（1）实验过程中培养白地霉的培养基是_________。 培养基定量分装前，先调节____________, 分装后用棉 塞封瓶口，最后______________________处理。 （2）图中 ① 过程称为__________，从甲到丁的培养 过程是为了_______。白地霉的代谢类型为_________。
未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，
菌落？它们的大小、形状、颜色相似？
如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、 形状、颜色相似的菌落。
问题3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？ 如果不同，请分析产生差异的原因？
培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不
五.培养和保存纯化菌株
1.试管低温临时保存
将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落
后，置于4OC的冰箱中保存。
2.甘油管长期保存 在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL
培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的
冷冻箱中保存。
六.微生物数量的测定
1.血球计数板计数法 （显微镜直接计数法） 缺点
样品菌数含量（个/ ml ）= 菌落平均数×稀 释倍数÷接处稀释液体积（ml） 练一练 某同学在稀释倍数为105的培养基中测得平板 上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的 菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为 0.1ml）( A ) A.2.34× 108 个菌落/ ml B.2.34× 109个菌落/ ml C.2.34× 106个菌落/ ml D.23.4个/ 菌落ml
牛肉膏 5.0克 葡萄糖 10.0克 (1)根据用途分,该培养基称 乳糖 5.0克 为_____ 鉴别 培养基,利用该培养 KNO3 2.0克 基的目的是______________. 鉴别大肠杆菌 伊红-美蓝 0.2克 (2)根所物理性质分,该培养 琼脂 12.0克 固体 培养基,该培养 基称为______ 水 定容至 基可用于微生物的_________. 分离和计数 1000ml (3)该培养基中能提供碳源的是____________, 牛、葡、乳 能提供 牛肉膏、 KNO3 从培养基成分来分析,该培养基 氮源的是 __________, 所培养的微生物的同化作用类型为______ 异养型。
途分
加入指示试剂，使菌 鉴别菌种。如伊红-美蓝可 鉴别 落或菌落周围出现特 使大肠杆菌的菌落呈现出紫 定的颜色或形态变化。黑色。
配制何种培养基可选择出下列微生物?
土壤中的固氮微生物 能分解有机污染物A的细菌 分离土壤中能分解纤维素的细菌 分离土壤中能分解尿素的细菌 分离金黄色葡萄球菌（耐盐） 说出碳源和氮源即可。
七.微生物的分离纯化
平板划线法, 稀释涂布平板法, 选择培养基分离法,
鉴别培养基分离法。