石油发酵产蛋白酶菌株Pseudomonas aeruginosa Nu53-1减毒的研究
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（ 旦大学生物系 ， 复 上海）
（ Ｈ） ０ １ 优质琼脂 １ －１ ％， Ｎ ，Ｓ ４ ２ 克， ． ． 加蒸馏 ２ ５ ００ ０ ５ 厘米２ ２ 分 灭菌 ０ 中， 获得一株能利用重油作为碳源发酵产蛋白 水定容至 １０ 毫升， ．公斤／ ２ 完全培养基 （ Ｍ） Ｎａｌ Ｃ ： Ｃ ５ 克，蛋白 酶的 绿色极毛杆菌 （ｓｄ ｏ ｓ ｇｏ 钟。（） 铜 Ｐｕｏ ｎ ａｕｎａ ｅ ｍ ａ ｅ ｉｓ ｒ ０ 牛肉膏 ５ 酵母膏 ５ 琼脂 ２ ％， 克， 克， ． ０ ６１１ ．）１ 。此菌株经亚硝基孤 及紫 外 线诱 变处 陈 １ 克， ００毫升， Ｈ ２ １公升／ ｐ ７ ， ． 厘米２ 理，选出了产酶较高的变异株 Ｎｕ３１ 该菌 加水定容至 １０ ５－。 产生的蛋白酶经试验表明在皮 革脱毛上具有良 灭菌 巧 分钟。 ３诱变 ． 诱变剂亚硝基呱由本校遗传学 好的性能。 ４ 菌苔 铜绿色极毛杆菌属于条件致病菌。此菌在 研究所合成。取培养 ２ 小时的斜面一支， Ｈ ５ ． ０细 人的口腔、 皮肤和肠道等处均可发现， 对人体的 用 ｐ ７ 的磷酸缓冲液制成浓度为 ５Ｘ １８ 胞／ 毫升的悬浮液。加亚硝基呱到最终 浓度 为 致病力很弱， 大多属继发性感染， 偶然也可单独 １０ ０ 微克／ 毫升。３℃ 保温 ３ 分钟， ０ ０ 以肉汤稀 致病。它对于烧伤、 放射治疗、 化疗病人等有一 我们在石油发酵蛋白酶产生菌的筛选工作
遗传
１ Ｒ Ｄ Ｔ Ｓ ｅ ｉｇ ２ ６ ＂ － ６ ８ １ Ｅ Ｉ Ａ （ ｉｎ ） （ ） ３ Ｅ Ｂｊ １ ０ ９
石 油 发酵 产 蛋 白酶 菌 株
Ｐｅ ｏｏ ｓ ｇ ｏ Ｎ ５ １ 毒 研 ｓｄ ｎ ａ ｕｎａ ３ 减 的 究 ｕ ｍ ａ ｅ ｉｓ ｕ － ｒ
李 阳 倪 池） 陈 钮） 黄 玉） 育 秋１ １ 耀１
（ 一）嗦吟缺陷型菌株的筛选 １出发菌株 ． 铜绿色极毛杆菌 Ｎ ５－０ ｕ３１ ２培养基 ． （） １基本培养基（ ） 葡萄 ｍｍ ： 糖１ 克，ＫＨ Ｏ ７ ，Ｐ ， 克，Ｋ ２Ｏ ２ ＨＰ ， 克，柠檬酸 三 钠 ・２ ， ０ 克，Ｍ Ｓ ， ２ ０ 克， ＨＯ ． ５ 宫Ｏ ＂ Ｏ ． ７ Ｈ １
所示。
从表 １ 可知添加混合氨基酸后缺陷型出现 率也有明显提高。 表２ 说明添加混合氨基酸后所检出的缺陷
型几乎全部都是碱基缺 陷型。 （ 二）嚷吟缺陷型产蛋白酶情况
比较 ａ ｂ 。 ， 三条生长曲线可以看出， ， 嚓吟
缺陷型 Ｂ ２－ ５在 ＭＭ液中不能生长 ， ６５ ２ 培养 ７ ２
小时浊度仍为零。 而在 ＭＭ中 添加腺嚓吟后 就能生长， 但与 Ｎ ５－ 相比， ｕ３１ 延滞期要稍长一 些， 生长上升速度要稍慢一些， 生长达到平衡时
由表４ 可以看出，ｏ吟缺陷型 Ｂ２－５ ｆ ， ６５２ 的 回复突变率在１ Ｘ － 到 ， Ｘ － （ ． １ ＇ ． １ ｔ 每一 ８ ０ ０ ５ ０ ｏ
细胞、 每一代） 之间。 讨 论
菌营养缺陷型进行毒力研究， 发现需要色氨酸、
半眺氨酸的菌株未能减毒。当在用此减毒菌株 攻击小白鼠的同时注射 １ 毫克黄漂吟， ０ 毒力又
以腹腔注射方式攻击， 注射体积为每只０ 毫 ． ５
升。观察 ３ 天死亡情况， 并计算 Ｌ ５ Ｄｏ ｏ （ 四）生长曲线 Ｎ ５－ 产生的蛋白酶活力为 １０ ｕ３ １ ０多，以４ 株 ２ 嚷吟缺陷型与其相比，按蛋白酶活力相对值分 布范围如图 １ 所示。
取培养２ 小时的斜面， ４ 用基本培养液制成
６０ ０ 细胞／ 毫升左右的悬浮液， 以 １与 ３ 之 再 ０ 比分别接种到基本培养液， 然后， 补加 ０ ０ 沁 ．１ ０ 腺凛吟， ８ 下振荡培养 ７ 小时， ２℃ ２ 间隔一定时 间取样， ２ 用７ 型分光光度计在波长为 ６０ｍ下 ６ｎ Ｍ定浊度， 以此代表细菌之生长程度。 （ 五）回复突变率的测定 将斜面上生长 ２ 小时的菌苔用生理 盐 水 ４ 制成浓度为 １Ｘ１５ ０细胞／ 毫升的悬液， 以每管 ０ ． ５毫升接到 ２ 支装有 ２ 毫升肉汤培养液的 ０ ． ５ 刻度离心管中， ７ 培养 ２ 小时， ３℃ ４ 然后用生理
蛋 白酶活力相对值 （ 外） 图 １ ２株嗦吟缺陷型 按蛋白酶活力相对值的分布 情况 ４
盐水离心洗涤两次， 定容至 １ 毫升， 每管取０ ５ ． ０
毫升菌液涂布于基本培养基平板上， ７ 培养 ３℃ 由图 １ 可见，大部分嗓吟缺陷型菌株产酶 ２ 数出生长菌落数， Ｌｒ 天， 按 ｕｉ Ｄ ｌｕｋ３ 能力低于 Ｎ ５－，只有少数菌株比Ｎ ５ ａ和 ｅｒｃＥ ｂ ＇ ， ｕ３１ ｕ３１ － Ｎｗｏ ｂ８法计算回复突变率。 ｅｃ ｅ ｍ［ ， 高， 经多次摇瓶发酵试验， 筛得一株需要腺嚓吟 或次黄嗓吟的缺陷 型 Ｂ２－５ ６５２。它 和 Ｎ ５－ ｕ３１ 结 果 相比产蛋白酶能力提高２ ％。我们选定此 菌 ９ （ 一）采用青霉素浓缩法筛选营养缺 陷型 株进行毒力测定。 时，添加混合氨基酸对缺陷型出现率和碱基缺 （ 三）毒力试验 陷型出现率的影响 小白鼠毒力测定结果见表 ３ ０ 由表３ 可见嚓吟缺陷型 菌株 Ｂ ５２ ６ － ５的 ２ 表 １ 添加混合氮墓酸后对缺 陷型 出现率的影晌 ＬＳ Ｄ。 有明显 的 提高，与Ｎｕ３ １ 比毒 力 下 ５－ 相 缺陷型 缺陷型 株数 出现率（ ） ％ 降 ８ 倍。 ６ ５ ２ ９ ３１ ４ ５ ５ ３． （ 四）生长曲线 １ ７ ７ １ ３ ６ Ｂ －５及 Ｎ ５－ ６５２ ２ ｕ １的生长曲线如图 ２ ３
衰 ２ 添加混合氮基酸 后对 碱基缺陷型 出现率的影响 添加混合氨 基酸 （ 毫 克／ 毫升）
０ １． ５
缺 陷型 株数
３１ ４ １ ３ ６
各类缺陷型 出现率（ ％） 碱 基 氨基酸｝ 二＊， 双缺
了１ 二〔‘ 七 石 戈了
未 鉴定
０
１ ３ ５． ９ ６ ７．
８ １ ０． １． ６ ２． ０ 。 ｛ ０． ６
１ ２
０． ５ ５ ０． ５ ７
１． ８丫 １ － ０ ０３ ２． ３丫 １ － ０ ０１
ｌ Ｐ 为样品中未检出回 ） ｏ 复子的样品的比例： ３ ）按公式 ａ 一（ ２（ Ｐ）Ｎ 计算０ 二 ｌ ）１ ｏ／ ｎ ｎ
２ ）按公式 ， （ ／ ２ｌ（ａ １ ２ ＝ Ｎ ｌ ） ＣＮ ｌ ）计算； ａ ｎ ｎ ｎ
陷型而达到减毒效果的已有一些实例。不同
的作者已分别在筛选肺炎克氏杆 菌［、 号弧 ３逗 １ 菌（ 假鼻疽假单胞杆菌１ ４ １ ５ ３ 的嚓吟缺陷型方面取 得了减毒的效果。考虑到筛选嚓吟缺陷型容易 着手，同时Ｒ吟类物质在发酵生产上也容易满 Ａ 足。 因此， 我们选择了这一方法进行减毒试验。
培养基离心洗涤二次， 并制成悬浮液， 饥饿培养 ２ 小时。离心后， ４ 菌体被重新悬浮于含有青霉 素的基本培养基中（ 青霉素Ｇ钾， 浓度为６５ ２－ ５ ０ 单位／ ，０ ０ 毫升） 培养过夜， 将菌液涂布于完全
实验编 号 样品 数 （ ） 每一 样品的 Ｃ 总菌 数 （ ） Ｎ
２ ０ ２ ０ １． ２义 １ ＇ ５ ００百度文库０． ６丫 １ ＇ ７ ００
每一样品 的回 复子数 （ ｒ ）
３ ０ ４ ２ ０ ０
有 回复子 的样品数
９ ５
Ｐ ＇ ｏ
结
１ ＞ ＇
果
２ ） ＇ ５． ５Ｘ １ －＇ ０ ０ ４． ６火 １ －ｒ ０ ｏ
Ｓ ｕｒｅ Ｆｅ ｍ ｅ ａ ｉｎ ｏ ｃ ｉ ｎ ｒ ｎｔｔｏ
ｌ ）为本校微生物专业 七二届学生，
３
（ 二）蛋白酶活力测定 在 ｐ ．（ Ｈ８ 硼酸一 ５ 氯化钾缓冲液） ３℃的 和 ０ 反应温度下按福林酚试剂法进行测定。 （ 三）毒力测定 采用 １－２ 克的雄性小白鼠。每组 ５ ６ ０ 只，
一 １．３６
０／ ５ ０／ ５
５／５ ０．２２ 亿
Ｎｕ５ － ３ １
｛“ ・ ５ ６ ／ ” ５ １。 ｝‘ ・ “ ， ５ ｝。 ・ ‘ ／ ，｝‘ ５
｝０５ ／ ． 一 ５ ０ ｝： ８
（ 五）回复突变率的测定 二次实验结果列于－ ｋ４ ０
表４ ６５２ Ｂ ２－５暇岭 块陷标记的回复突变率
０ 倍中止反应。 １ 毫升中 取 ５ 止后的菌液， 定的危害。 因此， 近年来对于它的危害已日益 释 １０ ７ －８ 被人重视。为了保证生产和产品使用 的安全， 于 ３℃下增殖培养 ， 小时，用缺氮的基本
对菌种进行减毒是必要的。
目前已有许多减低细菌毒力的方法广泛地 被用来制备减毒活菌苗，其中通过筛选嘿吟缺
培养基平板上， 以点种法检出缺陷型， 用划线法 进行缺陷型的初步鉴定，最后以生长谱法鉴定 缺陷型的营养需要。根据青霉素浓缩缺陷型的 机理， 为了淘汰不需要的氨基酸缺陷型， 在添加 青霉素的同时， 每毫升还补加了 １ 毫克 混合 ． ５ 氨基酸。混合氨基酸由 １ 种主要氨基酸 混合 ５
而成。
材 料 和 方 法
完全恢复了。Ｆｒ ｓ和 Ｒｗ ｙ， ｕｅ ｎｓ ｏｌｔ 在鼠伤寒沙 ｅ９
门氏菌进行种内的毒力转导，以两株由非等位 （ 嚏吟 型菌株Ｂ２ ２和Ｎ ５ １ 的突变所引起的嗓吟缺陷型作为受体，以另一 一） 缺陷 ６５ 。 ｕ３ － － 相比， 毒力下降８倍， ６ 我们另一部分工作中用灭 株具有典型毒力的菌株作为供体，当它们被转 活 铜 色 毛 菌６ 测 Ｌ５ １８ ｃ 导成原养型时，毒力也即恢复。我们曾用筛得 的 绿 极 杆 ． 得 Ｄ为２．亿２ １ ｏ ９ ） 而 Ｂ ２－５ ６５２ 的活菌攻击 Ｌ Ｓ也已达 １． Ｄ。 ８ ５亿， 的漂吟缺陷型 Ｂ２－５攻击家兔并检 查体 内 ９ ６５２ 两者相当接近， 说明毒力下降是明显的。 各主要器官的感染情况， 当其与以 Ｎ ５－ ｕ３１攻 对于病原菌的嚓吟缺陷型减毒的机制，已 击的家兔相比，发现缺陷型菌株所引起的感染 有不少研究。一般认为在人或动物体内游离存 明显地减轻， 这可能也与 Ｂ ２－５未能在体内 ６５２ 在的嘿吟类物质很少，故嚷吟缺陷型在体内不 大量繁殖有关。 （ 二）嚷吟缺陷型菌株 Ｂ２－５突变标记 ６５２ 易获得繁殖所必需的营养物质，从而降低了毒 力， 但是一旦获得嚏吟，其毒力就会恢复。Ｆ－ 稳定， ｏ 产蛋白酶活力略高于亲株， 满足了预定的 ｒａ 等〔 ｍｌ ‘ ， 用通过自发突变分离到的伤寒沙门氏 要求 。
５
「 」 赵云泉等：１７．同上 ｐ ２ ２ ９９ ，． ａ ８ （ 三）在筛选０吟缺陷型的过程中， 如果采 「 １ ａｂｒＥ Ｄ ｅ ａ ： ９２ Ｐ ｏ， ｌＡ ａ． ３ Ｇ ｒｅ ． ｔ １５． ｃＮ ｔ ｃｄ Ｓｉ ， ． ｌ ｒ ａ ． ｃ ． 用青霉素浓缩法，当在添加青霉素的同时再添 Ｔ． Ａ．３ ７ Ｓ． ， ８：６ ３ ９． ４ ａ ｅ Ｂ ｏ ｌ ｌ ９０ Ｐｏ． ． ． ． ｍ ｔ ： ｒ ｏ ｘ 加混合氨基酸时， 碱基类缺陷型比例大大提高。 ［ ］ Ｓｍｕｌ Ｆ ｒ ａ ｅ ａ． １６． ｃＳｃ Ｅ ｐ 刀ｉｌａ ｄ ｅ．１ ３ ２ ：３９ ｏ ｎ Ｍ ｄ， （ ） ５ ． ． ０ 鉴于营养缺陷型在微生物遗传研究及其在发酵 ［５］ Ｌｅｉｅ Ｈ． ａ ｄ ． Ｍａ ｒｒ ９ ８ Ｊ Ｉ ｖｎ ， Ｂ ｎ Ｒ Ｌ ． ． ｕ ｅ ：１５ ． ｍ－ ．
Ｌ Ｙ ｙｎ ｅ ａ． Ｉｖｓｇｔ ｎ ｎ ｅ ｔ ｎ ａｉ ｉ ａｇ ｌ ｎｅｔ ａｉ ｏ ｔ Ａｔ ｕｔ ｎ ｕ ｔ ： ｉ ｏ ｈ ｅ ｏ ｏ ａ ｏｅ ａｅ ｒｄ ｃｎ Ｓｒｉ Ｐｅｄ ｍｏａ ａｒ－ ｆ ｒｔｉ ｓ－ ｏｕｉｇ ａｎ ｕ ｏ ｎｓ ｕ Ｐ ｎ ｐ ｔ ｓ ｅ ｇｎ ｓ Ｎｕ － ｔａ Ｕ ｉｚｓ ａ ａｅ Ｃ ｒｏ ｒｏａ ５ １ ｔ ｌ ｅ Ｎ ｌ ｎ ａ ａｂ ｎ ３ ｈ ｔｉ －ｋ ｓ
的浊度也要低一些。
蛋白酶的摇瓶发酵试验表明，若以对照菌
４
裹 ３ ｕ３１与 Ｂ ２－５毒力比较 Ｎ ５－ ６５２
Ｘ２ －２ ６ ５ ５
攻量，亡／ Ｌ 击（｝数 数 Ｄ 亿死 总 ５ ０
， ‘ ，・ ｝ ５／ ５ ４ ５ ／ ‘５ ／ ｛ １ ９ 亿 ８． ５ ２ ８ ６． １ ４ ３．
６． ７ ３． ３５
（ Ｈ） ０ １ 优质琼脂 １ －１ ％， Ｎ ，Ｓ ４ ２ 克， ． ． 加蒸馏 ２ ５ ００ ０ ５ 厘米２ ２ 分 灭菌 ０ 中， 获得一株能利用重油作为碳源发酵产蛋白 水定容至 １０ 毫升， ．公斤／ ２ 完全培养基 （ Ｍ） Ｎａｌ Ｃ ： Ｃ ５ 克，蛋白 酶的 绿色极毛杆菌 （ｓｄ ｏ ｓ ｇｏ 钟。（） 铜 Ｐｕｏ ｎ ａｕｎａ ｅ ｍ ａ ｅ ｉｓ ｒ ０ 牛肉膏 ５ 酵母膏 ５ 琼脂 ２ ％， 克， 克， ． ０ ６１１ ．）１ 。此菌株经亚硝基孤 及紫 外 线诱 变处 陈 １ 克， ００毫升， Ｈ ２ １公升／ ｐ ７ ， ． 厘米２ 理，选出了产酶较高的变异株 Ｎｕ３１ 该菌 加水定容至 １０ ５－。 产生的蛋白酶经试验表明在皮 革脱毛上具有良 灭菌 巧 分钟。 ３诱变 ． 诱变剂亚硝基呱由本校遗传学 好的性能。 ４ 菌苔 铜绿色极毛杆菌属于条件致病菌。此菌在 研究所合成。取培养 ２ 小时的斜面一支， Ｈ ５ ． ０细 人的口腔、 皮肤和肠道等处均可发现， 对人体的 用 ｐ ７ 的磷酸缓冲液制成浓度为 ５Ｘ １８ 胞／ 毫升的悬浮液。加亚硝基呱到最终 浓度 为 致病力很弱， 大多属继发性感染， 偶然也可单独 １０ ０ 微克／ 毫升。３℃ 保温 ３ 分钟， ０ ０ 以肉汤稀 致病。它对于烧伤、 放射治疗、 化疗病人等有一 我们在石油发酵蛋白酶产生菌的筛选工作
遗传
１ Ｒ Ｄ Ｔ Ｓ ｅ ｉｇ ２ ６ ＂ － ６ ８ １ Ｅ Ｉ Ａ （ ｉｎ ） （ ） ３ Ｅ Ｂｊ １ ０ ９
石 油 发酵 产 蛋 白酶 菌 株
Ｐｅ ｏｏ ｓ ｇ ｏ Ｎ ５ １ 毒 研 ｓｄ ｎ ａ ｕｎａ ３ 减 的 究 ｕ ｍ ａ ｅ ｉｓ ｕ － ｒ
李 阳 倪 池） 陈 钮） 黄 玉） 育 秋１ １ 耀１
（ 一）嗦吟缺陷型菌株的筛选 １出发菌株 ． 铜绿色极毛杆菌 Ｎ ５－０ ｕ３１ ２培养基 ． （） １基本培养基（ ） 葡萄 ｍｍ ： 糖１ 克，ＫＨ Ｏ ７ ，Ｐ ， 克，Ｋ ２Ｏ ２ ＨＰ ， 克，柠檬酸 三 钠 ・２ ， ０ 克，Ｍ Ｓ ， ２ ０ 克， ＨＯ ． ５ 宫Ｏ ＂ Ｏ ． ７ Ｈ １
所示。
从表 １ 可知添加混合氨基酸后缺陷型出现 率也有明显提高。 表２ 说明添加混合氨基酸后所检出的缺陷
型几乎全部都是碱基缺 陷型。 （ 二）嚷吟缺陷型产蛋白酶情况
比较 ａ ｂ 。 ， 三条生长曲线可以看出， ， 嚓吟
缺陷型 Ｂ ２－ ５在 ＭＭ液中不能生长 ， ６５ ２ 培养 ７ ２
小时浊度仍为零。 而在 ＭＭ中 添加腺嚓吟后 就能生长， 但与 Ｎ ５－ 相比， ｕ３１ 延滞期要稍长一 些， 生长上升速度要稍慢一些， 生长达到平衡时
由表４ 可以看出，ｏ吟缺陷型 Ｂ２－５ ｆ ， ６５２ 的 回复突变率在１ Ｘ － 到 ， Ｘ － （ ． １ ＇ ． １ ｔ 每一 ８ ０ ０ ５ ０ ｏ
细胞、 每一代） 之间。 讨 论
菌营养缺陷型进行毒力研究， 发现需要色氨酸、
半眺氨酸的菌株未能减毒。当在用此减毒菌株 攻击小白鼠的同时注射 １ 毫克黄漂吟， ０ 毒力又
以腹腔注射方式攻击， 注射体积为每只０ 毫 ． ５
升。观察 ３ 天死亡情况， 并计算 Ｌ ５ Ｄｏ ｏ （ 四）生长曲线 Ｎ ５－ 产生的蛋白酶活力为 １０ ｕ３ １ ０多，以４ 株 ２ 嚷吟缺陷型与其相比，按蛋白酶活力相对值分 布范围如图 １ 所示。
取培养２ 小时的斜面， ４ 用基本培养液制成
６０ ０ 细胞／ 毫升左右的悬浮液， 以 １与 ３ 之 再 ０ 比分别接种到基本培养液， 然后， 补加 ０ ０ 沁 ．１ ０ 腺凛吟， ８ 下振荡培养 ７ 小时， ２℃ ２ 间隔一定时 间取样， ２ 用７ 型分光光度计在波长为 ６０ｍ下 ６ｎ Ｍ定浊度， 以此代表细菌之生长程度。 （ 五）回复突变率的测定 将斜面上生长 ２ 小时的菌苔用生理 盐 水 ４ 制成浓度为 １Ｘ１５ ０细胞／ 毫升的悬液， 以每管 ０ ． ５毫升接到 ２ 支装有 ２ 毫升肉汤培养液的 ０ ． ５ 刻度离心管中， ７ 培养 ２ 小时， ３℃ ４ 然后用生理
蛋 白酶活力相对值 （ 外） 图 １ ２株嗦吟缺陷型 按蛋白酶活力相对值的分布 情况 ４
盐水离心洗涤两次， 定容至 １ 毫升， 每管取０ ５ ． ０
毫升菌液涂布于基本培养基平板上， ７ 培养 ３℃ 由图 １ 可见，大部分嗓吟缺陷型菌株产酶 ２ 数出生长菌落数， Ｌｒ 天， 按 ｕｉ Ｄ ｌｕｋ３ 能力低于 Ｎ ５－，只有少数菌株比Ｎ ５ ａ和 ｅｒｃＥ ｂ ＇ ， ｕ３１ ｕ３１ － Ｎｗｏ ｂ８法计算回复突变率。 ｅｃ ｅ ｍ［ ， 高， 经多次摇瓶发酵试验， 筛得一株需要腺嚓吟 或次黄嗓吟的缺陷 型 Ｂ２－５ ６５２。它 和 Ｎ ５－ ｕ３１ 结 果 相比产蛋白酶能力提高２ ％。我们选定此 菌 ９ （ 一）采用青霉素浓缩法筛选营养缺 陷型 株进行毒力测定。 时，添加混合氨基酸对缺陷型出现率和碱基缺 （ 三）毒力试验 陷型出现率的影响 小白鼠毒力测定结果见表 ３ ０ 由表３ 可见嚓吟缺陷型 菌株 Ｂ ５２ ６ － ５的 ２ 表 １ 添加混合氮墓酸后对缺 陷型 出现率的影晌 ＬＳ Ｄ。 有明显 的 提高，与Ｎｕ３ １ 比毒 力 下 ５－ 相 缺陷型 缺陷型 株数 出现率（ ） ％ 降 ８ 倍。 ６ ５ ２ ９ ３１ ４ ５ ５ ３． （ 四）生长曲线 １ ７ ７ １ ３ ６ Ｂ －５及 Ｎ ５－ ６５２ ２ ｕ １的生长曲线如图 ２ ３
衰 ２ 添加混合氮基酸 后对 碱基缺陷型 出现率的影响 添加混合氨 基酸 （ 毫 克／ 毫升）
０ １． ５
缺 陷型 株数
３１ ４ １ ３ ６
各类缺陷型 出现率（ ％） 碱 基 氨基酸｝ 二＊， 双缺
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未 鉴定
０
１ ３ ５． ９ ６ ７．
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１． ８丫 １ － ０ ０３ ２． ３丫 １ － ０ ０１
ｌ Ｐ 为样品中未检出回 ） ｏ 复子的样品的比例： ３ ）按公式 ａ 一（ ２（ Ｐ）Ｎ 计算０ 二 ｌ ）１ ｏ／ ｎ ｎ
２ ）按公式 ， （ ／ ２ｌ（ａ １ ２ ＝ Ｎ ｌ ） ＣＮ ｌ ）计算； ａ ｎ ｎ ｎ
陷型而达到减毒效果的已有一些实例。不同
的作者已分别在筛选肺炎克氏杆 菌［、 号弧 ３逗 １ 菌（ 假鼻疽假单胞杆菌１ ４ １ ５ ３ 的嚓吟缺陷型方面取 得了减毒的效果。考虑到筛选嚓吟缺陷型容易 着手，同时Ｒ吟类物质在发酵生产上也容易满 Ａ 足。 因此， 我们选择了这一方法进行减毒试验。
培养基离心洗涤二次， 并制成悬浮液， 饥饿培养 ２ 小时。离心后， ４ 菌体被重新悬浮于含有青霉 素的基本培养基中（ 青霉素Ｇ钾， 浓度为６５ ２－ ５ ０ 单位／ ，０ ０ 毫升） 培养过夜， 将菌液涂布于完全
实验编 号 样品 数 （ ） 每一 样品的 Ｃ 总菌 数 （ ） Ｎ
２ ０ ２ ０ １． ２义 １ ＇ ５ ００百度文库０． ６丫 １ ＇ ７ ００
每一样品 的回 复子数 （ ｒ ）
３ ０ ４ ２ ０ ０
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（ 二）蛋白酶活力测定 在 ｐ ．（ Ｈ８ 硼酸一 ５ 氯化钾缓冲液） ３℃的 和 ０ 反应温度下按福林酚试剂法进行测定。 （ 三）毒力测定 采用 １－２ 克的雄性小白鼠。每组 ５ ６ ０ 只，
一 １．３６
０／ ５ ０／ ５
５／５ ０．２２ 亿
Ｎｕ５ － ３ １
｛“ ・ ５ ６ ／ ” ５ １。 ｝‘ ・ “ ， ５ ｝。 ・ ‘ ／ ，｝‘ ５
｝０５ ／ ． 一 ５ ０ ｝： ８
（ 五）回复突变率的测定 二次实验结果列于－ ｋ４ ０
表４ ６５２ Ｂ ２－５暇岭 块陷标记的回复突变率
０ 倍中止反应。 １ 毫升中 取 ５ 止后的菌液， 定的危害。 因此， 近年来对于它的危害已日益 释 １０ ７ －８ 被人重视。为了保证生产和产品使用 的安全， 于 ３℃下增殖培养 ， 小时，用缺氮的基本
对菌种进行减毒是必要的。
目前已有许多减低细菌毒力的方法广泛地 被用来制备减毒活菌苗，其中通过筛选嘿吟缺
培养基平板上， 以点种法检出缺陷型， 用划线法 进行缺陷型的初步鉴定，最后以生长谱法鉴定 缺陷型的营养需要。根据青霉素浓缩缺陷型的 机理， 为了淘汰不需要的氨基酸缺陷型， 在添加 青霉素的同时， 每毫升还补加了 １ 毫克 混合 ． ５ 氨基酸。混合氨基酸由 １ 种主要氨基酸 混合 ５
而成。
材 料 和 方 法
完全恢复了。Ｆｒ ｓ和 Ｒｗ ｙ， ｕｅ ｎｓ ｏｌｔ 在鼠伤寒沙 ｅ９
门氏菌进行种内的毒力转导，以两株由非等位 （ 嚏吟 型菌株Ｂ２ ２和Ｎ ５ １ 的突变所引起的嗓吟缺陷型作为受体，以另一 一） 缺陷 ６５ 。 ｕ３ － － 相比， 毒力下降８倍， ６ 我们另一部分工作中用灭 株具有典型毒力的菌株作为供体，当它们被转 活 铜 色 毛 菌６ 测 Ｌ５ １８ ｃ 导成原养型时，毒力也即恢复。我们曾用筛得 的 绿 极 杆 ． 得 Ｄ为２．亿２ １ ｏ ９ ） 而 Ｂ ２－５ ６５２ 的活菌攻击 Ｌ Ｓ也已达 １． Ｄ。 ８ ５亿， 的漂吟缺陷型 Ｂ２－５攻击家兔并检 查体 内 ９ ６５２ 两者相当接近， 说明毒力下降是明显的。 各主要器官的感染情况， 当其与以 Ｎ ５－ ｕ３１攻 对于病原菌的嚓吟缺陷型减毒的机制，已 击的家兔相比，发现缺陷型菌株所引起的感染 有不少研究。一般认为在人或动物体内游离存 明显地减轻， 这可能也与 Ｂ ２－５未能在体内 ６５２ 在的嘿吟类物质很少，故嚷吟缺陷型在体内不 大量繁殖有关。 （ 二）嚷吟缺陷型菌株 Ｂ２－５突变标记 ６５２ 易获得繁殖所必需的营养物质，从而降低了毒 力， 但是一旦获得嚏吟，其毒力就会恢复。Ｆ－ 稳定， ｏ 产蛋白酶活力略高于亲株， 满足了预定的 ｒａ 等〔 ｍｌ ‘ ， 用通过自发突变分离到的伤寒沙门氏 要求 。
５
「 」 赵云泉等：１７．同上 ｐ ２ ２ ９９ ，． ａ ８ （ 三）在筛选０吟缺陷型的过程中， 如果采 「 １ ａｂｒＥ Ｄ ｅ ａ ： ９２ Ｐ ｏ， ｌＡ ａ． ３ Ｇ ｒｅ ． ｔ １５． ｃＮ ｔ ｃｄ Ｓｉ ， ． ｌ ｒ ａ ． ｃ ． 用青霉素浓缩法，当在添加青霉素的同时再添 Ｔ． Ａ．３ ７ Ｓ． ， ８：６ ３ ９． ４ ａ ｅ Ｂ ｏ ｌ ｌ ９０ Ｐｏ． ． ． ． ｍ ｔ ： ｒ ｏ ｘ 加混合氨基酸时， 碱基类缺陷型比例大大提高。 ［ ］ Ｓｍｕｌ Ｆ ｒ ａ ｅ ａ． １６． ｃＳｃ Ｅ ｐ 刀ｉｌａ ｄ ｅ．１ ３ ２ ：３９ ｏ ｎ Ｍ ｄ， （ ） ５ ． ． ０ 鉴于营养缺陷型在微生物遗传研究及其在发酵 ［５］ Ｌｅｉｅ Ｈ． ａ ｄ ． Ｍａ ｒｒ ９ ８ Ｊ Ｉ ｖｎ ， Ｂ ｎ Ｒ Ｌ ． ． ｕ ｅ ：１５ ． ｍ－ ．
Ｌ Ｙ ｙｎ ｅ ａ． Ｉｖｓｇｔ ｎ ｎ ｅ ｔ ｎ ａｉ ｉ ａｇ ｌ ｎｅｔ ａｉ ｏ ｔ Ａｔ ｕｔ ｎ ｕ ｔ ： ｉ ｏ ｈ ｅ ｏ ｏ ａ ｏｅ ａｅ ｒｄ ｃｎ Ｓｒｉ Ｐｅｄ ｍｏａ ａｒ－ ｆ ｒｔｉ ｓ－ ｏｕｉｇ ａｎ ｕ ｏ ｎｓ ｕ Ｐ ｎ ｐ ｔ ｓ ｅ ｇｎ ｓ Ｎｕ － ｔａ Ｕ ｉｚｓ ａ ａｅ Ｃ ｒｏ ｒｏａ ５ １ ｔ ｌ ｅ Ｎ ｌ ｎ ａ ａｂ ｎ ３ ｈ ｔｉ －ｋ ｓ
的浊度也要低一些。
蛋白酶的摇瓶发酵试验表明，若以对照菌
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裹 ３ ｕ３１与 Ｂ ２－５毒力比较 Ｎ ５－ ６５２
Ｘ２ －２ ６ ５ ５
攻量，亡／ Ｌ 击（｝数 数 Ｄ 亿死 总 ５ ０
， ‘ ，・ ｝ ５／ ５ ４ ５ ／ ‘５ ／ ｛ １ ９ 亿 ８． ５ ２ ８ ６． １ ４ ３．
６． ７ ３． ３５