石油发酵产蛋白酶菌株Pseudomonas aeruginosa Nu53-1减毒的研究
微生物学智慧树知到答案章节测试2023年武汉科技大学
第一章测试1.一种新的瘟疫正在全球蔓延，它是由病毒引起的（）。
A:艾滋病B:鼠疫C:霍乱D:天花答案:A2.柯赫提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则（）。
A:菌种原则B:柯赫原则C:免疫原理D:巴斯德原则答案:B3.国际通用的细菌命名法是（）。
A:古英文命名法B:德文双名法C:拉丁文双名法D:中文命名法答案:C4.微生物在整个生物界的分类地位，无论是五界系统，还是三域系统，微生物都占据了（）的“席位”。
A:少数B:不太多C:绝大多数D:非常少数答案:C5.细菌分类中，模式菌株是（）的模式。
A:属B:种C:目D:科答案:B6.在微生物分类中Amoeba属于（）。
A:原生生物界B:真菌界C:病毒界D:原核生物界答案:A7.可以产生青霉素的微生物学名是（）。
A:Aspergillus nigerB:Saccharomyces cerevisiaeC:Bacillus subtilisD:Penicillium chrysogenum答案:D8.产生伴孢晶体的微生物学名是（）。
A:Escherichia coliB:Bacillus thuringiensisC:Pseudomonas aeruginosaD:Saccharomyces cerevisiae答案:B9.我国学者汤飞凡教授的（）分离和确证的研究成果，是一项具有国际领先水平的开创性成果。
A:鼠疫杆菌B:天花病毒C:沙眼病原体D:结核杆菌答案:C10.微生物基因组序列分析表明，在某些微生物中存在一些与人类某些遗传疾病相类似的基因好，因此可以利用这些微生物作为（）来研究这些基因的功能，为认识庞大的人类基因组及其功能做出重要贡献。
A:模式生物B:供体C:突变材料D:受体答案:A11.巴斯德不仅用曲颈瓶实验证明微生物非自然发生，推翻了争论已久的“自生说”，而且做了许多其他重大贡献，例如证明乳酸发酵是由为何物引起的，首次制成狂犬疫苗，建立了巴氏消毒法等。
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展
微生物发酵生产脂肪酶的研究进展脂肪酶是一种催化脂肪水解的酶，在食品、医药、洗涤等行业具有广泛的应用。
微生物发酵生产脂肪酶是一种可持续、高效、环保的生产方法，近年来受到越来越多的关注。
本文将对微生物发酵生产脂肪酶的研究现状和进展进行综述。
一、常用生产菌株1、真菌Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Rhizopus oryzae、Rhizomucor miehei等真菌已经被广泛用于脂肪酶的生产，这些菌株生长快，环境适应性强，能够在贫瘠的培养基上生长，同时也有高水平地产酶能力。
2、细菌Pseudomonas aeruginosa、Bacillus subtilis、Escherichia coli等细菌也是常用的脂肪酶产生菌株。
相比于真菌，细菌生长更快，能够利用廉价原料生产酶，具有成本低、效率高的优势。
Pseudomonas aeruginosa可以在低pH、低氧的条件下仍有很好地产酶能力，Bacillus subtilis也可以在含大量盐和大分子多糖的条件下生长，并且不需要经常移植，因此被广泛用于工业生产中。
Escherichia coli是一种常见的大肠杆菌，发酵条件相对简单，同时也具有高产酶能力的优点。
二、生产方法微生物发酵生产脂肪酶可以利用固态和液态发酵两种方法进行。
1、固态发酵固态发酵是指微生物在不含或添加少量水的条件下在固体底物上生长繁殖的过程。
固态发酵具有低成本、低能耗等优点，因此被广泛用于脂肪酶的生产。
6%豆腐渣和啤酒酵母配成的混合物是常用的培养基，长时间的固态发酵可以提高酶活力和酶产量。
同时，加入不同的辅料如磷酸盐、酵母提取物、麦芽粉等也可以提高酶活力。
不同的细菌和真菌对液态培养基的需求是不同的，产酶高峰期也会有所不同。
一般而言，前期生长过程中需要较多的氮源，并需要一定量的葡萄糖，而后期需要适度减少氮源以提供产酶所需的碳源。
液态发酵产酶能力高，且过程易于控制，因此被广泛用于脂肪酶生产中。
产脂肪酶菌株的筛选鉴定及响应面法
摘要本文开展了产脂肪酶菌株的筛选鉴定及响应面法优化发酵工艺试验,确定得到的高产脂肪酶菌株为Youzh-1,对其进行16S rRNA 测序分析,确定其为荧光假单胞菌,在单因素试验的基础上采用响应面法对Youzh-1的发酵工艺进行进一步优化设计,得到最佳发酵工艺为葡萄糖添加量18.825g/L 、牛肉膏添加量25.98g/L 、温度41℃、pH 值6。
在此条件下测得脂肪酶活力为79.87U/mL ,较理论值87.19U/mL 减少了8.39%,证明模型可靠。
关键词脂肪酶;菌株;筛选;鉴定;响应面法;发酵工艺;优化中图分类号TQ925.6文献标识码A 文章编号1007-5739(2022)12-0165-06DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2022.12.046开放科学(资源服务)标识码(OSID ):Screening and Identification of Lipase-producing Strain and Optimization of FermentationProcess by Response Surface MethodologyQIN Hao LIU Kai DENG Wenxi LI Shan YU Shuping WANG Mengyuan GUO Donghui *(College of Life Sciences,Shandong First Medical University,Tai ′an Shandong 271016)Abstract In this paper,the screening and identification of lipase -producing strain and the optimization of fermentation process by response surface methodology were researched.The obtained high lipase-producing strain was Youzh-1,which was determined to be Pseudomonas fluorescens by 16S rRNA sequencing analysis.On the basis of the single factor experiment,the response surface methodology was used to further optimize the fermentation process of Youzh-1.The optimum fermentation process was obtained as follows:the addition of glucose was 18.825g/L,the addition of beef extract was 25.98g/L,the temperature was 41℃,and the pH value was 6.Under these conditions,the lipase activity was measured to be 79.87U/mL,which was 8.39%lower than the theoretical value (87.19U/mL),which proved that the model was reliable.Keywords lipase;strain;screening;identification;response surface methodology;fermentation process;optimization产脂肪酶菌株的筛选鉴定及响应面法优化发酵工艺秦昊刘凯邓文玺李珊于淑萍王梦圆郭东会*(山东第一医科大学生命科学学院,山东泰安271016)脂肪酶在人们的生产生活中发挥着重要作用[1]。
原油降解菌株Pseudomonas.aeruginosa AS1生理生化性质及分类研究
原油降解菌株Pseudomonas.aeruginosa AS1生理生化性质及分类研究梁凯强;贾东林;侯亚妮;王飞;惠鑫;马志峰【摘要】原油降解菌株AS1筛选自延长油田油水样,对延长轻质原油具有良好降解能力,通过生理生化指标和16SrDNA基因序列分析进行了菌种鉴定,原油降解菌株AS1的16SrDNA基因序列与Pseu-domonas aeruginosa的相似度为99.1％,因而将其命名为P.aeruginosa AS1.该菌株的最适生长温度为37℃,能以延长轻质原油、液体石蜡为唯一碳源生长,并能合成鼠李糖脂类生物表面活性剂,该表面活性剂对柴油、煤油和原油等均有很好的乳化效果,在常温下形成EI24值为100％的乳状液.鉴于P.aeruginosaAS1的良好生物属性,该菌株有进一步进行微生物矿场试验的潜力.【期刊名称】《内蒙古石油化工》【年(卷),期】2011(000)020【总页数】4页(P120-123)【关键词】原油降解菌株;Pseudomonas aeruginosa;生物表面活性剂;EI24【作者】梁凯强;贾东林;侯亚妮;王飞;惠鑫;马志峰【作者单位】陕西延长石油(集团)有限责任公司研究院,陕西西安710075;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400;陕西延长石油(集团)有限责任公司瓦窑堡采油厂,陕西子长717400【正文语种】中文【中图分类】TE357.9微生物提高石油采收率(M icrob ial Enhanced O il Recovery,M EOR)是目前国内外发展迅速的一项提高原油采收率的技术,被视为一种很有潜力的采油方法。
其主要方法是将地面分离培养的微生物菌液(外源微生物)和营养液注入油层,或单纯注入营养液激活油层内源微生物,使其在油层内生长繁殖,利用微生物及其代谢产物对油藏原油、地层产生作用,提高原油的流动能力,或改变液流方向,从而提高采收率[1]。
玉米糖化物发酵产微生物胞外多糖的研究
玉米糖化物发酵产微生物胞外多糖的研究玉米糖化物是极受欢迎的甜味剂，也是一类多糖物质，最近也受到越来越多的关注。
玉米糖化物发酵过程可以用来制备多发酵产物，其中一类叫做微生物胞外多糖（EPS）。
本文旨在探讨玉米糖化物发酵产微生物胞外多糖的研究。
首先，应该提到的是玉米糖化物发酵涉及的微生物。
目前发现的玉米糖化物发酵所涉及的微生物有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas putida）、大肠杆菌（Escherichia coli）等等。
它们的发酵产物是细菌的链状多糖（polysaccharides），称为微生物胞外多糖（EPS）。
其次，本文将论述玉米糖化物发酵产微生物胞外多糖的过程。
玉米糖化物发酵可以分为三个阶段：第一阶段是活化阶段，其中玉米糖化物被分解，形成糖苷和果糖；第二阶段是发酵阶段，细菌将果糖转化为多糖；第三阶段是收获阶段，即将微生物胞外多糖从发酵液中提取。
在这三个阶段之间，还有其它一些因素会影响玉米糖化物发酵，比如温度、pH值、氧含量等。
接下来，本文将介绍玉米糖化物发酵产微生物胞外多糖的优势。
首先，微生物胞外多糖具有众多优势，比如营养、凝胶形成能力、抗氧化活性、抗菌活性、保湿能力等。
其次，玉米糖化物发酵可以以环保的方式提取出高品质的微生物胞外多糖。
此外，微生物胞外多糖还可以用作药物载体，可以增强药物的有效性，提高治疗效率。
最后，介绍一下玉米糖化物发酵产微生物胞外多糖的应用。
由于其高品质，微生物胞外多糖可以用作食品添加剂、生物材料等。
此外，微生物胞外多糖也可作为医药中药成分，可用于治疗各种疾病。
综上所述，玉米糖化物发酵产微生物胞外多糖备受关注，它具有众多优势，可用于食品添加剂、生物材料、医药中药等领域。
希望本文能够给读者提供一定的参考。
欧洲药典EP8.0 2.6.1无菌检验 sterility中英文翻译
2.6.1. STERILITY2.6.1 无菌检查法The test is applied to substances, preparations or articles which, according to the Pharmacopoeia, are required to be sterile. However, a satisfactory result only indicates that no contaminating micro-organism has been found in the sample examined in the conditions of the test.本检查方法适用于按照药典要求应当无菌的原料、制剂或其他物质。
但是，如果按照本无菌检查法的结果符合要求，仅表明在该检查条件下未发现微生物污染。
PRECAUTIONS AGAINST MICROBIAL CONTAMINATION微生物污染防范The test for sterility is carried out under aseptic conditions. In order to achieve such conditions, the test environment has to be adapted to the way in which the sterility test is performed. The precautions taken to avoid contamination are such that they do not affect any micro-organisms which are to be revealed in the test. The working conditions in which the tests are performed are monitored regularly by appropriate sampling of the working area and by carrying out appropriate controls.无菌检测试验应在无菌的条件下进行。
假单胞菌属Pseudomonas Migula的检验
假单胞菌属Pseudomonas Migula的检验Gˉ，直或微弯的杆菌，0.5-1.0×1.5-5.0μm。
多单在。
不产芽孢。
以单极或数根极毛运动，有的种还具短波长的侧毛。
严格需氧。
不能在酸性下（pH4.5）生长，多数种不需要有机生长因子。
化能异养，有的种利用H2或CO为能源兼性化能自养。
接触酶阳性, 产生各种水溶性色素。
自然界分布极广，土壤、淡海水、污水、动植物体表等均存在。
引起疾病(Pseudomonas Disease)的有绿脓杆菌、荧光假单胞菌、鳗败血假单胞菌和恶臭假单胞菌等。
（一）铜绿假单胞菌（P. Aeruginosa）原称绿脓杆菌。
在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。
各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。
易从外伤、烧伤及尿道感染的标本分离。
本菌存在的重要条件是潮湿的环境。
1 形态及染色特征铜绿假单胞菌为非发酵革兰氏阴性菌，菌体细长，长短不一，呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
菌体一端单鞭毛，暗视野或相差显微镜下可见细菌运动活泼。
2 生长特性专性需氧，生长温度25~42℃，最适25~30℃，4℃不生长，42℃可生长，可用以鉴别该菌。
普通培养基上生长18~24h可见扁平、湿润的菌落，能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等，使得培养基呈亮绿色。
血琼脂平板生长可见菌落周围有溶血环，菌落呈金属光泽；液体培养基呈浑浊状生长，液体表面形成菌膜，培养基底部生长不良。
3 生化特点该菌氧化酶阳性，能氧化分解葡萄糖、木糖，产酸不产气，但不分解乳糖和蔗糖。
液化明胶、可分解尿素，还原硝酸盐为亚硝酸盐并产生氮气。
吲哚阴性，利用枸橼酸盐，精氨酸双水解酶阳性。
4 抗原性与分型该菌含O抗原（菌体抗原）及H抗原（鞭毛抗原）。
O 抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。
O抗原可用以分型。
生物采油解堵剂中产蛋白酶菌株的筛选及培养条件优化
作者简介 ： 左佳敏（ ９ ３ ， ， １ ８ 一） 女 硕士研究生 ， 主要从 事天然 产物 资源化学方面 的研究
・
９ ・ ６
第 ２ 期
左佳 敏 等 ： 物 采 油解 堵 剂 中 产 蛋 白 酶 菌株 的 筛选 及 培养 条 件 优 化 生
１ １ ２ 培养 基 ．＿
无 机 营养 液 （ ／ ） Ｎａ １ ． ； ｇ Ｌ ： Ｃ ０ ＮＨ４ １ ． ； Ｓ ． ２ Ｋ２ Ｏ ・Ｈ２ ． ； ＮＯ ． ； ３ Ｃ １ Ｍｇ Ｏ４ ０ ； ＨＰ ４ ３ Ｏ ０ ２ Ｎａ ３０ ２ ＫＨ２ Ｏ ０ ０ Ｐ ４
１ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
１ １ １ 菌株 ． ．
从 大 庆油 田原 油样 品 中筛选 得到 菌种 ， 经部 分生 理 生化实 验及 １ Ｓｒ ６ ＤＮＡ鉴 定 为铜绿 假单 胞菌 ．
收 稿 日期 ：０ ２—０ ２１ ２—２ ； ８ 编辑 ： 志平 任 基 金 项 目 ： 宁 省 工 业 攻 关 计划 项 目（０ ９２ ０ ３ 辽 ２０ ２ ３０ ）
酪素 培养 基［ （ ／ ： ｇ Ｌ） ＫＨ２ Ｏ４ ． ６ Ｍｇ Ｏ ． ； ｎ １ ０ ０ ４ Ｎ Ｃ ． ６ ＮａＨＰ ４ ７ Ｏ １ Ｏ ； Ｐ ３ ； Ｓ ４０ ５ Ｚ Ｃ ２ ． １ ； ａ １ １ ； ２ Ｏ ・ Ｈ２ ． ７ ０ ０ Ｃ Ｃ ２ ． ０ ； ｅ Ｏ ． ２ 干酪 素 ４ 琼 脂 ２ ． ； 离子 水 １０ ０ｍＬ ｐ ６ ５ ． ． ａ １００ ２ Ｆ Ｓ ４ ０ ； ０ ； ０ ０去 ０ ； Ｈ ． ～７ ０ 以上 培养 基使 用前 在 １ １℃ 、 ． ａ ２ ０ １ＭＰ 条件 下 灭菌 ３ ｉ． ０ｒ ｎ ａ
大
庆
菌株分离——精选推荐
菌株分离（separation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。
菌株分离、筛选（screening）虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分离中的一些措施本身就具有筛选作用。
工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
在实验工作中，为使筛选达到事半功倍的效果，总的说来可从以下几个途径进行收集和筛选：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。
（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。
（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。
该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。
菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。
第一节含微生物样品的采集自然界含菌样品极其丰富，土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物，种类数量十分可观。
但总体来讲土壤样品的含菌量最多。
一、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。
从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。
一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（1 06）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。
但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。
因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。
烃降解菌株Pseudomonas.aeruginosaS-1性质研究
思； 也包含时间层面的“ 行动中反思” 行动后反思” 即按 与“ ， 任 务行动 的先后顺序思考， 最终得到有效 生长经验。 三、 三格” “ 研修模式： 促进教师积淀“ 有效经验” 所 谓“ 三格” 研修， 就是把 同伴互助 与专业引领有机 结 合起来 的一种教学研究和专业培训形式， 出以研代训， 突 重
训转变观念， 形成新课程理念， 完善和提升教师判断 自我教
学 行 为 的标 尺 ， 从而 自觉 地 改 善 教 学行 为； 过 升 格 培 训， 通
让教师掌握适应新课标需要的不同教学 内容和不同课型的 教学方法模式， 提高课堂教学效益； 通过风格培训， 激发教 师教学创新， 把培养学生的创新精神和实践能力落到实处。 该模式 的基本运行 结构为： １“ ． 入格” 激活。 这主要针对新教师和教学实践经验 不 足的教师， 运用通识性研修 唤醒、 激活和解放教师观念， 通
Ｍｇ Ｏ ・ ７ Ｏ ０６ ５ Ｓ Ｈ： ．１，酵母 粉 ０５ Ｐ ．． 降 解 培养 基 ． Ｈ ７２ 烃 ，
Ｍ２ ｇＬ ：原油 （ （ ／） 液体石蜡） ． ｏ， ２ Ｐ ． ２５ ／ Ｎａ Ｏ １ ，Ｋ Ｏ ｏ Ｈ ５ ＨＰ
３ ８ Ｎ ４ ２ Ｏ ４０ ． ，（ Ｈ ） Ｓ ． ４ ，Ｍｇ Ｏ ０ ，酵 母 粉 Ｏ １ Ｈ ７ ， Ｓ ． ７ ． ，ｐ ． ０ ２ １ １ 灭 菌 ３ 分 钟。 ２℃ ０
集 体 尉备 一 节 和 多 人 同上 一 节 课，或 就集 体 备 课、听课 议 课 、 论 学 习、 题 实验 、 理 课 困惑 研 讨 等 方 面 同伴 互 助 或 相 互
６ 系统 反思。 ． 研修教师针对实际操作的检验结果及时 进行 自我反思和集体反思。不仅包括在逻辑层面的“ 查 检
原油降解菌株Pseudomonas.aeruginosa AS1生理生化性质及分类研究
灭菌３ 分钟。 Ｏ 烃降解培养基Ｍ１ｇＬ ： （／ ）原油 （ 液体石
蜡 ）２ ５ ， ． ＫＨ２ Ｏ４ ． ， ２ Ｏ４ ． ，Ｎａ Ｐ ２ ＮａＨＰ ０ ６ ０ ＮＯ３ ． ２
０，Ｃａ ２ ． １ Ｃ１０ ０ ，Ｆｅ Ｏ４ ． １ Ｓ ０ ０ ，Ｍ ｇ Ｏ４・７ Ｏ ． １ ， Ｓ Ｈ２ ０ ６ ５
的筛 选 ， 包括 能够 直接 利 用烃类 的菌 株 ， 以及通 过 自 身产 物辅 助对 烃 类 的利用 的菌 株等 。能够 降解 烃类
的微 生物 在 自然 界 中广泛 存在 。细 菌通常 在 富含水 的 区域 （ 如湖 泊 ， 海洋 ， 湿地 以及 含水 较多 的土层 等 ）
酵 母 粉 ０５ ｐ ７２ １１ ． ， Ｈ ． ，２ ℃灭菌 ３ 钟 。烃 降 解培 ０分 养基 Ｍ２ｇＬ）原油 （ （／ ： 液体 石蜡 ）． ２ ５％ ， ２ Ｏ １ ＮａＨＰ ．
９， ） 溶剂 Ｂ， ０ （ Ｖ） ４ Ｖ／ 乙腈 ＋０ ０ ｌＬ磷酸 缓 冲 ． ５ｍｏ／
液（ ＫＨ２Ｏ４ Ｐ 一Ｎａ ＯＨ， Ｈ ６ ９ ； 速 １ Ｏ ｐ ． ）流 ． ｍＬ／ ｎ ｍｉ ；
１ Ｓｒ Ｎ ６ Ａ序列分析 ： Ｄ 以菌株基因组 Ｄ Ａ为模 Ｎ
板 ， １ Ｓｒ ＮＡ 通 用 引物 （Ｕｐ ｅ ２ Ｆ） ’ 用 ６ Ｄ ｐ ｒ（ ７ ５ 一ＧＡＧ
１０ ２
内蒙 古石 油化 工
２ １ 年第 ２ 期 ０１ ｏ
原油降解菌株Ｐｅｄｍ ｎｓａ ｕｉ ｓ Ａ １ ｓ ｏ ｏａ． ｒｇ ｏａ Ｓ 生理生化性质及分类研究 ｕ ｅ ｎ
梁凯 强 贾 东林 侯 亚 妮 王 飞。惠 鑫 ｚ 马志 峰 ２ ， ， ， ， ，
实验十细菌生化实验-微生物实验
2、记录大肠杆菌及普通变形杆菌对葡萄糖和乳糖的 发酵试验结果。以“+”表示产酸或产气，“－” 表示不产酸或不产气。
3、记录大肠杆菌和产气杆菌的吲哚试验、甲基红试 验、伏-普试验、柠檬酸盐试验及硫化氢试验结果， 以“+”表示阳性反应。“－”表示阴性反应。
4、不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
五、实验报告
一马当先，全员举绩，梅开二度，业 绩保底 。20.12. 1720.1 2.1708: 2308:23 :3808:2 3:38Dec-20
牢记安全之责，善谋安全之策，力务 安全之 实。202 0年12 月17日 星期四8 时23分 38秒T hursday, December 17, 2020
相信相信得力量。20.12.172020年12月 17日星 期四8 时23分3 8秒20. 12.17
试验名称
培养基名称
菌种名称 接种 接种 方式 管数
吲哚试验
蛋白胨水培养基 大肠杆菌和 液体 1
甲基红试验 葡萄糖蛋白胨培养基 产气肠杆菌 液体 1
伏普试验 葡萄糖蛋白胨培养基
液体 1
柠檬酸盐试验 柠檬酸盐培养基
斜面 1
五、实验报告
1、分别记录试验菌种对淀粉水解、脂肪水解、明胶 液化、石蕊牛奶及尿素试验的结果。以“＋”表示 阳性，“－”表示阴性。
微生物水解蛋壳膜
微生物水解蛋壳膜蛋壳膜因其特殊的膜结构及水不溶性，富含角蛋白及胶原蛋白等多种有机成分，成为近年来备受关注的生物资源。
但由于其稳定的膜结构，难溶于水和溶剂，使得其应用受到很大限制。
如何有效分解蛋壳膜，从中提取水溶性蛋白或多肽并加以利用，是开发蛋壳膜资源的关键所在。
利用微生物发酵的方法降解蛋壳膜相比化学法操作简单、成本低廉，是实现蛋壳膜有效成分利用的一种有效手段。
目前，国内外研究中，能分解蛋壳膜的微生物主要有：乳酸菌、铜绿假单胞杆菌和恶臭假单胞杆菌。
这些微生物能产生分解蛋壳膜的酶，相比于普通的酶，对蛋壳膜的分解能力更强。
然而，目前相关文献虽确定了能分解蛋壳膜的这几种菌种，却没有告诉读者具体的菌型。
因此前期探索实验应：1.分离筛选驯化菌种从而得到具体的菌株（菌型）。
2.确定了某种能分解利用蛋壳膜的菌株后，分离纯化得到该菌分泌的有效酶。
微生物水解蛋壳膜相关文献如下：Osvaldo E Rubilar（2006）等人用乳酸菌分别发酵蛋壳膜和蛋壳以利用蛋壳中的钙和蛋壳膜中的可溶性蛋白质。
发酵实验设计如下图所示，第一条是蛋壳发酵路线，分成B1和B2组，蛋壳先进行清洗研磨干燥预处理，B1组发酵液包括15%葡萄糖，0.02%乳酸菌，B2组15%葡萄糖，0.02%乳酸菌，1%柠檬酸（CA）于30℃下发酵8天，发酵悬浮液于4℃下静置沉淀2天，B1下层为糊状沉淀，B2下层为胶状沉淀，进行过滤，过滤后滤液和滤渣都进行透析（25℃，3天）。
上层液态部分，也进行透析。
透析后对透析液进行冷冻干燥得到产品。
第二条是蛋壳膜发酵路线，分成B3和B4组，B3组蛋壳膜添加量低于B4组。
蛋壳膜先粉碎至1mm，于30℃下发酵8天。
发酵液成分同蛋壳发酵液，发酵悬浮液于4℃下静置沉淀2天后进行透析，然后对透析液进行冷冻干燥得到产品。
B3组发酵液可溶性蛋白得率最高为88.3%。
这篇研究虽进行了蛋壳膜的发酵实验，但没有分离纯化出乳酸菌分泌的能分解蛋壳膜的酶。
大庆油污土壤中石油降解菌的筛选和鉴定研究
大庆油污土壤中石油降解菌的筛选和鉴定研究随着石油工业的发展和人类经济的增长，石油污染问题也越来越严重。
油污土壤中的石油降解菌具有重要的作用，是处理石油污染土壤的有效途径之一。
本研究旨在筛选并鉴定能够降解石油的菌株，为油污土壤的治理提供参考。
一、材料与方法1. 材料石油污染的土壤样本、均质培养基、双氧水、碘酒、无菌平板、无菌试管、显微镜、培养箱等。
2. 筛选方法从石油污染土壤中采集样本，制备菌液后在均质培养基上进行菌落筛选。
将筛选后的菌株进行分离，培养并保存。
3. 鉴定方法通过形态学观察、生化反应和生理生化特性等方面对菌株进行鉴定，最后进行16S rRNA基因序列测定，进一步确认菌株的分类和系统学位置。
二、结果与分析通过筛选，共获得5株能够降解石油的菌株。
对这5株菌株进行鉴定，鉴定结果如下：菌株名称形态特征氧需求类型阳性/阴性Pseudomonas aeruginosa 不规则形，黄色革兰氏阴性嗜氧菌其中Bacillus sp.和Pseudomonas aeruginosa是最普遍发现的石油降解菌之一，它们的生理代谢能力和适应能力均较强，对不同类型的石油污染都有着较好的降解能力。
而Serratia marcescens、Micrococcus luteus和Alcaligenes faecalis在石油降解方面的应用尚处于研究初级阶段，需要更多的研究来验证其降解效果和适用范围。
三、结论与建议通过筛选和鉴定，本研究获得了5株具有石油降解能力的菌株。
这些菌株的发现和应用对于油污土壤的治理和恢复有重要的意义。
在石油工业生产和使用过程中，应该注意减少污染的发生，加强环境保护工作，以保障生态系统的可持续发展。
此外，还需要加强对石油降解菌的基础研究，探索其适用范围和效果，为油污土壤的治理提供更加科学和有效的方法和手段。
蛋白酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究
蛋白酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究作者：李婵娟，王婧，杨洁来源：《湖北农业科学》 2015年第19期李婵娟１，王婧２，杨洁２（１．华中农业大学楚天学院，武汉４３０２０５；２．湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，武汉４３００６４）摘要：采用干酪素平板透明圈法从垃圾附近的土壤中分离得到１株产蛋白酶的优良菌株，通过测定其１６ＳｒＤＮＡ基因序列，鉴定该菌为铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）。
以酪蛋白为底物对该菌所产蛋白酶粗酶液进行了酶学性质研究，结果表明，该酶最适反应ｐＨ为８．５，为碱性蛋白酶；在ｐＨ６．０～９．０的缓冲液中于４℃放置１２ｈ后仍有９０％以上的酶活性，说明该酶在中性和碱性条件下非常稳定。
该酶最适反应温度为５５℃，在７０℃和８０℃处理３０ｍｉｎ后仍分别保有６８％和４５％的残余酶活性，从而表明该酶具有较好的热稳定性。
Ｍｇ２＋和Ｆｅ２＋对该酶活性几乎没有影响，Ｋ＋和Ｍｎ２＋对该酶活性有轻微的抑制作用，ＥＤＴＡ对该酶活性有明显的抑制作用；Ｃｕ２＋对该酶活性也有２６％的抑制作用，只有Ｃａ２＋对该酶活性有１０％左右的促进作用。
关键词：蛋白酶产生菌；分离；鉴定；酶学性质中图分类号：Ｑ８１４．１文献标识码：A文章编号：0439－８114（２０15）19－4794-04DOI:10.14088/ki.issn0439-8114.2015.19.035ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡＰｒｏｔｅａｓｅ－ＰｒｏｄｕｃｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＩｔｓＰｒｏｔｅａｓｅＬＩＣｈａｎ－ｊｕａｎ１，ＷＡＮＧＪｉｎｇ２，ＹＡＮＧＪｉｅ２（１．ＣｈｕｔｉａｎＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３０２０５，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＱｕａｌｉｔｙＳｔａｎｄａｒｄａｎｄＴｅｓｔｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＡｇｒｏ－Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＨｕｂｅｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｈａｎ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｒｏｄｕｃｉｎｇｈｉｇｈｐｒｏｔｅａｓｅｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌａｒｏｕｎｄｔｈｅｄｕｍｐｂｙｍｅｔｈｏｄｏｆｃａｓｅｉｎｐｌａｔｅ．ＴｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａｂｙｍｅａｓｕｒｉｎｇｉｔｓ１６ＳｒＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｉｓｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄｂｙｕｓｉｎｇｃａｓｅｉｎａｓｔｈｅｓｕｂｓｔｒａｔｅ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅａｓｅｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍａｃｔｉｖｉｔｙａｔｐＨ８．５，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｉｓｅｎｚｙｍｅｗａｓａｎａｌｋａｌｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｔｈｅｃｒｕｄｅｅｎｚｙｍｅｓｔｉｌｌｈａｄ９０％ｏｆｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒｏｖｅｒｎｉｇｈｔｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ４℃，ｐＨ６．０～９．０，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｅｎｚｙｍｅｗａｓｖｅｒｙｓｔａｂｌｅｕｎｄｅｒｎｅｕｔｒａｌｏｒａｌｋａｌｉｎｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｆｔｈｅｅｎｚｙｍｅｗａｓ５５℃．Ａｆｔｅｒｉｎｃｕｂａｔｉｏｎａｔ７０℃ ａｎｄ８０℃ ｆｏｒ３０ｍｉｎ，ｉｔｒｅｍａｉｎｅｄ６８％ａｎｄ４５％ｏｆｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔａｃｔｉｖｉｔｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｓｏｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｅｗａｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｈａｖｅａｓｕｐｅｒｉｏｒｔｈｅｒｍａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｅｍａｙｂｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｄｉｖａｌｅｎｔｍｅｔａｌｉｏｎｓ，ｂｅｃａｕｓｅｉｔｗａｓｎｏｔａｆｆｅｃｔｅｄｂｙＭｇ２＋ｏｒＦｅ２＋ａｎｄｗａｓｓｌｉｇｈｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＫ＋ａｎｄＭｎ２＋，ｂｕｔｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＥＤＴＡ，ｓｔｒｏｎｇｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙＣｕ２＋，ｒｅｄｕｃｉｎｇｂｙ２６％ｏｆｉｔｓａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄｏｎｌｙＣａ２＋ｃｏｕｌｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｂｙ１０％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅａｓｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ；ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｙ收稿日期：２０１５－０６－１５基金项目：湖北省农业科技创新中心资助项目（２０１４－６２０－０００－００１）作者简介：李婵娟（１９８３－），女，湖北武汉人，讲师，硕士，主要从事微生物工业应用和酶分子工程研究，（电话）１５６２３０１７３５８（电子信箱）２１４８０７８２４＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者，杨洁（１９６９－），女，湖北武汉人，副研究员，主要从事食品分析与应用研究，（电话）１３２９７９４９６３１（电子信箱）jiangjie１１２７＠１６３．ｃｏｍ。
发酵工程实验指导书
发酵工程实验指导书————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：发酵工程实验指导书辽宁石油化工大学环境与生物工程学院主编《发酵工程》实验指导书实验学时：24学时适用专业：生物工程生物技术是当前优先发展的高新技术之一，本课程是为了和生物工程专业理论教学相配合，通过实践教学，培养学生对生物工程专业知识的具体实际应用的能力。
发酵工程实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学生学习了《生物化学及实验》、《微生物学及实验》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的，课程目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个微生物生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。
通过学习，使学生能掌握发酵工程常用的实验方法和常见的发酵工程设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。
本实验指导书包括：实验一、细菌增殖曲线的测定（6学时）实验二、土壤中放线菌的分离与纯化（6学时）实验三、发酵菌株的初筛实验四、枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育（6学时）（必做）实验五、淀粉酶的固态发酵（6学时）实验六、发酵过程中糖的利用（6学时）实验七、玉米淀粉液化和糖化（6学时）实验八、淀粉酶的固定化生产（6学时）实验九、摇床培养确定酵母菌体的培养和营养条件（6学时）（必做）实验十、小型连续发酵实验（6学时）实验十一、甜酒酿的制作（6学时）备注：实验一至实验七为基础实验，实验八至实验十一为设计性和综合性实验，除必做实验外，其他可选做。
实验总时间为24学时，包括设计实验、准备实验、进行实验、书写实验预习及最终报告及所需仪器药品清单等。
实验一发酵菌株的初筛一、实验目的与要求目的：1、从已分离到的细菌或真菌中筛选出能产生生理活性物质的菌株。
2、学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的筛选方法。
要求：1、复习微生物学及实验过程所学到的微生物培养的方法和过程，了解影响微生物生长各种条件因素。
α糜蛋白酶作用温度
α糜蛋白酶作用温度
α糜蛋白酶，又称离屑酶或溶肉酶，是一种由Pseudomonas aeruginosa菌株产生的外源性酶。
α糜蛋白酶可以分解糜蛋白并使其变为溶解状态，从而迅速溶解坏死组织，促进创面愈合。
α糜蛋白酶的作用温度是相当重要的参数，因为温度的变化会影响酶
的活性和稳定性。
根据研究，α糜蛋白酶的最适工作温度为37℃左右，处于它的酶解活性极高的状态。
而在较高或较低的温度下，酶的活性
会逐渐降低。
糜蛋白酶的最高温度达到了65℃，但在持续作用于高温下，酶会因受热而失去活性。
除了温度之外，α糜蛋白酶的活性还受其他因素的影响，例如酶的浓度、pH值和离子强度等。
当酶的浓度较低时，其酶解活性会受到限制。
而当酶的浓度过高时，酶的稳定性可能会降低。
酶在特定的pH值下
工作最为有效，通常为pH7.5-8.5.酶的活性还受离子强度的影响，高
离子强度会抑制酶的活性。
在实际应用中，α糜蛋白酶在医学、食品和饲料等领域得到了广泛的
应用。
在医学领域，它通常被用于治疗创伤、烧伤、浅表性坏死性筋
膜炎等疾病。
在食品和饲料加工中，α糜蛋白酶常常被用来降解蛋白质，从而提高产品的质量和口感。
总之，作为一种重要的外源性酶，α糜蛋白酶的作用温度是影响其酶解活性和稳定性的重要因素之一。
在实际应用中，需要根据不同的情况来选择合适的温度条件，以保证其酶解效果和酶解产物的质量。
鼠李糖脂1.doc
鼠李糖脂由于在日化行业表现出的性能如下： 1）卓越的增溶能力，适于配制功能性透明产品； 2）良好的去污性、润湿性、乳化性、分散性和钙皂分散力； 3）良好的发泡性和泡沫稳定性，发泡力不受水的硬度和介质 pH 的影响； 4）对眼睛和皮肤非常温和，并能显著改善配方的温和性。 5）具有良好的配伍性能，能与任何离子型或表面活性剂配伍； 6）易生物降解，在强碱环境中可降解为鼠李糖和脂肪酸，自然条件下较为稳定。 7）无毒，使用安全，用量少。
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3
1、 SLS和SLES的天然替代品[3]
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鼠李糖脂是天然的表面活性剂和乳化剂，可 以替代石油化学类表活剂如护肤品、香波、肥皂 等常见的月桂基磺酸钠 (SLS)、十二烷基硫酸钠 （SDS)和月桂醇醚硫酸钠 (SLES)。
2、 国际认证
美国环保局（EPA）已经批准鼠李糖脂用于食品行业，因此其被囊括在国际化妆品命名 组分（INCI）。
性； 5） 最低的用量和最优的价格； 6） 最低的油井设备、材料运输和储存价格。
（二）化妆品行业
化妆品行业使用大量的表面活性剂，几乎包含每种产品，如护肤品、染色剂、香波、牙 膏、摩丝、指甲油、眼影、沐浴液、香水等，随着消费者们对化学产品的危害性的重视使得 人们逐渐关注这些产品的安全、环保和天然。
http://www.
鼠李糖脂作为表面活性剂比其他化学产品价格低、环境友好且更高效，在美国能源部 (DOE)三年的研究中发现，填砂模型试验中，42%的剩余油只需用250mg/L的鼠李糖脂即可 轻松清洗下来。
鼠李糖脂表活剂的技术优势： 1） 可以驱出40%的剩余油； 2） 比化学合成的表面活性剂效果更好； 3） 纯天然、安全环保、无毒性物质残留； 4） 与合成类和其他EOR技术相比更具经济
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１ ２
０． ５ ５ ０． ５ ７
１． ８丫 １ － ０ ０３ ２． ３丫 １ － ０ ０１
ｌ Ｐ 为样品中未检出回 ） ｏ 复子的样品的比例： ３ ）按公式 ａ 一（ ２（ Ｐ）Ｎ 计算０ 二 ｌ ）１ ｏ／ ｎ ｎ
２ ）按公式 ， （ ／ ２ｌ（ａ １ ２ ＝ Ｎ ｌ ） ＣＮ ｌ ）计算； ａ ｎ ｎ ｎ
的浊度也要低一些。
蛋白酶的摇瓶发酵试验表明，若以对照菌
４
裹 ３ ｕ３１与 Ｂ ２－５毒力比较 Ｎ ５－ ６５２
Ｘ２ －２ ６ ５ ５
攻量，亡／ Ｌ 击（｝数 数 Ｄ 亿死 总 ５ ０
， ‘ ，・ ｝ ５／ ５ ４ ５ ／ ‘５ ／ ｛ １ ９ 亿 ８． ５ ２ ８ ６． １ ４ ３．
６． ７ ３． ３５
５
「 」 赵云泉等：１７．同上 ｐ ２ ２ ９９ ，． ａ ８ （ 三）在筛选０吟缺陷型的过程中， 如果采 「 １ ａｂｒＥ Ｄ ｅ ａ ： ９２ Ｐ ｏ， ｌＡ ａ． ３ Ｇ ｒｅ ． ｔ １５． ｃＮ ｔ ｃｄ Ｓｉ ， ． ｌ ｒ ａ ． ｃ ． 用青霉素浓缩法，当在添加青霉素的同时再添 Ｔ． Ａ．３ ７ Ｓ． ， ８：６ ３ ９． ４ ａ ｅ Ｂ ｏ ｌ ｌ ９０ Ｐｏ． ． ． ． ｍ ｔ ： ｒ ｏ ｘ 加混合氨基酸时， 碱基类缺陷型比例大大提高。 ［ ］ Ｓｍｕｌ Ｆ ｒ ａ ｅ ａ． １６． ｃＳｃ Ｅ ｐ 刀ｉｌａ ｄ ｅ．１ ３ ２ ：３９ ｏ ｎ Ｍ ｄ， （ ） ５ ． ． ０ 鉴于营养缺陷型在微生物遗传研究及其在发酵 ［５］ Ｌｅｉｅ Ｈ． ａ ｄ ． Ｍａ ｒｒ ９ ８ Ｊ Ｉ ｖｎ ， Ｂ ｎ Ｒ Ｌ ． ． ｕ ｅ ：１５ ． ｍ－ ．
衰 ２ 添加混合氮基酸 后对 碱基缺陷型 出现率的影响 添加混合氨 基酸 （ 毫 克／ 毫升）
０ １． ５
缺 陷型 株数
３１ ４ １ ３ ６
各类缺陷型 出现率（ ％） 碱 基 氨基酸｝ 二＊， 双缺
了１ 二〔‘ 七 石 戈了
未 鉴定
０
１ ３ ５． ９ ６ ７．
８ １ ０． １． ６ ２． ０ 。 ｛ ０． ６
完全恢复了。Ｆｒ ｓ和 Ｒｗ ｙ， ｕｅ ｎｓ ｏｌｔ 在鼠伤寒沙 ｅ９
门氏菌进行种内的毒力转导，以两株由非等位 （ 嚏吟 型菌株Ｂ２ ２和Ｎ ５ １ 的突变所引起的嗓吟缺陷型作为受体，以另一 一） 缺陷 ６５ 。 ｕ３ － － 相比， 毒力下降８倍， ６ 我们另一部分工作中用灭 株具有典型毒力的菌株作为供体，当它们被转 活 铜 色 毛 菌６ 测 Ｌ５ １８ ｃ 导成原养型时，毒力也即恢复。我们曾用筛得 的 绿 极 杆 ． 得 Ｄ为２．亿２ １ ｏ ９ ） 而 Ｂ ２－５ ６５２ 的活菌攻击 Ｌ Ｓ也已达 １． Ｄ。 ８ ５亿， 的漂吟缺陷型 Ｂ２－５攻击家兔并检 查体 内 ９ ６５２ 两者相当接近， 说明毒力下降是明显的。 各主要器官的感染情况， 当其与以 Ｎ ５－ ｕ３１攻 对于病原菌的嚓吟缺陷型减毒的机制，已 击的家兔相比，发现缺陷型菌株所引起的感染 有不少研究。一般认为在人或动物体内游离存 明显地减轻， 这可能也与 Ｂ ２－５未能在体内 ６５２ 在的嘿吟类物质很少，故嚷吟缺陷型在体内不 大量繁殖有关。 （ 二）嚷吟缺陷型菌株 Ｂ２－５突变标记 ６５２ 易获得繁殖所必需的营养物质，从而降低了毒 力， 但是一旦获得嚏吟，其毒力就会恢复。Ｆ－ 稳定， ｏ 产蛋白酶活力略高于亲株， 满足了预定的 ｒａ 等〔 ｍｌ ‘ ， 用通过自发突变分离到的伤寒沙门氏 要求 。
０ 倍中止反应。 １ 毫升中 取 ５ 止后的菌液， 定的危害。 因此， 近年来对于它的危害已日益 释 １０ ７ －８ 被人重视。为了保证生产和产品使用 的安全， 于 ３℃下增殖培养 ， 小时，用缺氮的基本
对菌种进行减毒是必要的。
目前已有许多减低细菌毒力的方法广泛地 被用来制备减毒活菌苗，其中通过筛选嘿吟缺
实验编 号 样品 数 （ ） 每一 样品的 Ｃ 总菌 数 （ ） Ｎ
２ ０ ２ ０ １． ２义 １ ＇ ５ ００ ０． ６丫 １ ＇ ７ ００
每一样品 的回 复子数 （ ｒ ）
３ ０ ４ ２ ０ ０
有 回复子 的样品数
９ ５
Ｐ ＇ ｏ
结
１ ＞ ＇
果
２ ） ＇ ５． ５Ｘ １ －＇ ０ ０ ４． ６火 １ －ｒ ０ ｏ
（ 一）嗦吟缺陷型菌株的筛选 １出发菌株 ． 铜绿色极毛杆菌 Ｎ ５－０ ｕ３１ ２培养基 ． （） １基本培养基（ ） 葡萄 ｍｍ ： 糖１ 克，ＫＨ Ｏ ７ ，Ｐ ， 克，Ｋ ２Ｏ ２ ＨＰ ， 克，柠檬酸 三 钠 ・２ ， ０ 克，Ｍ Ｓ ， ２ ０ 克， ＨＯ ． ５ 宫Ｏ ＂ Ｏ ． ７ Ｈ １
Ｌ Ｙ ｙｎ ｅ ａ． Ｉｖｓｇｔ ｎ ｎ ｅ ｔ ｎ ａｉ ｉ ａｇ ｌ ｎｅｔ ａｉ ｏ ｔ Ａｔ ｕｔ ｎ ｕ ｔ ： ｉ ｏ ｈ ｅ ｏ ｏ ａ ｏｅ ａｅ ｒｄ ｃｎ Ｓｒｉ Ｐｅｄ ｍｏａ ａｒ－ ｆ ｒｔｉ ｓ－ ｏｕｉｇ ａｎ ｕ ｏ ｎｓ ｕ Ｐ ｎ ｐ ｔ ｓ ｅ ｇｎ ｓ Ｎｕ － ｔａ Ｕ ｉｚｓ ａ ａｅ Ｃ ｒｏ ｒｏａ ５ １ ｔ ｌ ｅ Ｎ ｌ ｎ ａ ａｂ ｎ ３ ｈ ｔｉ －ｋ ｓ
所示。
从表 １ 可知添加混合氨基酸后缺陷型出现 率也有明显提高。 表２ 说明添加混合氨基酸后所检出的缺陷
型几乎全部都是碱基缺 陷型。 （ 二）嚷吟缺陷型产蛋白酶情况
比较 ａ ｂ 。 ， 三条生长曲线可以看出， ， 嚓吟
缺陷型 Ｂ ２－ ５在 ＭＭ液中不能生长 ， ６５ ２ 培养 ７ ２
小时浊度仍为零。 而在 ＭＭ中 添加腺嚓吟后 就能生长， 但与 Ｎ ５－ 相比， ｕ３１ 延滞期要稍长一 些， 生长上升速度要稍慢一些， 生长达到平衡时
以腹腔注射方式攻击， 注射体积为每只０ 毫 ． ５
升。观察 ３ 天死亡情况， 并计算 Ｌ ５ Ｄｏ ｏ （ 四）生长曲线 Ｎ ５－ 产生的蛋白酶活力为 １０ ｕ３ １ ０多，以４ 株 ２ 嚷吟缺陷型与其相比，按蛋白酶活力相对值分 布范围如图 １ 所示。
取培养２ 小时的斜面， ４ 用基本培养液制成
６０ ０ 细胞／ 毫升左右的悬浮液， 以 １与 ３ 之 再 ０ 比分别接种到基本培养液， 然后， 补加 ０ ０ 沁 ．１ ０ 腺凛吟， ８ 下振荡培养 ７ 小时， ２℃ ２ 间隔一定时 间取样， ２ 用７ 型分光光度计在波长为 ６０ｍ下 ６ｎ Ｍ定浊度， 以此代表细菌之生长程度。 （ 五）回复突变率的测定 将斜面上生长 ２ 小时的菌苔用生理 盐 水 ４ 制成浓度为 １Ｘ１５ ０细胞／ 毫升的悬液， 以每管 ０ ． ５毫升接到 ２ 支装有 ２ 毫升肉汤培养液的 ０ ． ５ 刻度离心管中， ７ 培养 ２ 小时， ３℃ ４ 然后用生理
由表４ 可以看出，ｏ吟缺陷型 Ｂ２－５ ｆ ， ６５２ 的 回复突变率在１ Ｘ － 到 ， Ｘ － （ ． １ ＇ ． １ ｔ 每一 ８ ０ ０ ５ ０ ｏ
细胞、 每一代） 之间。 讨 论
菌营养缺陷型进行毒力研究， 发现需要色氨酸、
半眺氨酸的菌株未能减毒。当在用此减毒菌株 攻击小白鼠的同时注射 １ 毫克黄漂吟， ０ 毒力又
遗传
１ Ｒ Ｄ Ｔ Ｓ ｅ ｉｇ ２ ６ ＂ － ６ ８ １ Ｅ Ｉ Ａ （ ｉｎ ） （ ） ３ Ｅ Ｂｊ １ ０ ９
石 油 发酵 产 蛋 白酶 菌 株
Ｐｅ ｏｏ ｓ ｇ ｏ Ｎ ５ １ 毒 研 ｓｄ ｎ ａ ｕｎａ ３ 减 的 究 ｕ ｍ ａ ｅ ｉｓ ｕ － ｒ
李 阳 倪 池） 陈 钮） 黄 玉） 育 秋１ １ 耀１
一 １．３６
０／ ５ ０／ ５
５／５ ０．２２ 亿
Ｎｕ５ － ３ １
｛“ ・ ５ ６ ／ ” ５ １。 ｝‘ ・ “ ， ５ ｝。 ・ ‘ ／ ，｝‘ ５
｝０５ ／ ． 一 ５ ０ ： ８
（ 五）回复突变率的测定 二次实验结果列于－ ｋ４ ０
表４ ６５２ Ｂ ２－５暇岭 块陷标记的回复突变率
培养基平板上， 以点种法检出缺陷型， 用划线法 进行缺陷型的初步鉴定，最后以生长谱法鉴定 缺陷型的营养需要。根据青霉素浓缩缺陷型的 机理， 为了淘汰不需要的氨基酸缺陷型， 在添加 青霉素的同时， 每毫升还补加了 １ 毫克 混合 ． ５ 氨基酸。混合氨基酸由 １ 种主要氨基酸 混合 ５
而成。
材 料 和 方 法
陷型而达到减毒效果的已有一些实例。不同
的作者已分别在筛选肺炎克氏杆 菌［、 号弧 ３逗 １ 菌（ 假鼻疽假单胞杆菌１ ４ １ ５ ３ 的嚓吟缺陷型方面取 得了减毒的效果。考虑到筛选嚓吟缺陷型容易 着手，同时Ｒ吟类物质在发酵生产上也容易满 Ａ 足。 因此， 我们选择了这一方法进行减毒试验。
培养基离心洗涤二次， 并制成悬浮液， 饥饿培养 ２ 小时。离心后， ４ 菌体被重新悬浮于含有青霉 素的基本培养基中（ 青霉素Ｇ钾， 浓度为６５ ２－ ５ ０ 单位／ ，０ ０ 毫升） 培养过夜， 将菌液涂布于完全
Ｓ ｕｒｅ Ｆｅ ｍ ｅ ａ ｉｎ ｏ ｃ ｉ ｎ ｒ ｎｔｔｏ
ｌ ）为本校微生物专业 七二届学生，
３
（ 二）蛋白酶活力测定 在 ｐ ．（ Ｈ８ 硼酸一 ５ 氯化钾缓冲液） ３℃的 和 ０ 反应温度下按福林酚试剂法进行测定。 （ 三）毒力测定 采用 １－２ 克的雄性小白鼠。每组 ５ ６ ０ 只，
（ 旦大学生物系 ， 复 上海）
（ Ｈ） ０ １ 优质琼脂 １ －１ ％， Ｎ ，Ｓ ４ ２ 克， ． ． 加蒸馏 ２ ５ ００ ０ ５ 厘米２ ２ 分 灭菌 ０ 中， 获得一株能利用重油作为碳源发酵产蛋白 水定容至 １０ 毫升， ．公斤／ ２ 完全培养基 （ Ｍ） Ｎａｌ Ｃ ： Ｃ ５ 克，蛋白 酶的 绿色极毛杆菌 （ｓｄ ｏ ｓ ｇｏ 钟。（） 铜 Ｐｕｏ ｎ ａｕｎａ ｅ ｍ ａ ｅ ｉｓ ｒ ０ 牛肉膏 ５ 酵母膏 ５ 琼脂 ２ ％， 克， 克， ． ０ ６１１ ．）１ 。此菌株经亚硝基孤 及紫 外 线诱 变处 陈 １ 克， ００毫升， Ｈ ２ １公升／ ｐ ７ ， ． 厘米２ 理，选出了产酶较高的变异株 Ｎｕ３１ 该菌 加水定容至 １０ ５－。 产生的蛋白酶经试验表明在皮 革脱毛上具有良 灭菌 巧 分钟。 ３诱变 ． 诱变剂亚硝基呱由本校遗传学 好的性能。 ４ 菌苔 铜绿色极毛杆菌属于条件致病菌。此菌在 研究所合成。取培养 ２ 小时的斜面一支， Ｈ ５ ． ０细 人的口腔、 皮肤和肠道等处均可发现， 对人体的 用 ｐ ７ 的磷酸缓冲液制成浓度为 ５Ｘ １８ 胞／ 毫升的悬浮液。加亚硝基呱到最终 浓度 为 致病力很弱， 大多属继发性感染， 偶然也可单独 １０ ０ 微克／ 毫升。３℃ 保温 ３ 分钟， ０ ０ 以肉汤稀 致病。它对于烧伤、 放射治疗、 化疗病人等有一 我们在石油发酵蛋白酶产生菌的筛选工作