柱前衍生高效液相色谱法测定食物中氨基酸含量

2.4
实验部分
（AOC） 与氨基酸迅速反应生成在 248 nm 有紫外吸收的高稳定性 2.4.1 衍生反应 衍生试剂 的脲和羟基琥珀酰亚胺 （ NHS） ， 过量的试剂可在慢反应中完全水解， 过程如下：
R1 R1 HN R2 氨基酸 Amino acid + NH 0 # N NH N # R2 + 0 NHS 0 H0 N
表1 流动相梯度洗脱表
2000-04-30 接受。 ! 1999-11-05 收稿； 邮编 265600。 "" 山东省蓬莱市技术监督局，
1092 Tabie 1 Conditions of gradient separation
流速 Fiow rate（mL / min） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
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第9期
苗
虹等： 柱前衍生高效液相色谱法测定食物中氨基酸含量
1093
图1 Fig. 1
氨基酸标准及样品的色谱图 The chromatograms of amino acids standard and food sampies
（ amino acids standard） ； （ Nestie condensed miik） 。1 . aspartate （ Asp） ， （ Ser） ； a. 氨基酸标准 b . 雀巢奶粉 2 . serine 3. （ Giu） ； （ Giy） ； （His） ； （ Arg） ； （ Thr） ； （ Aia） ； giutamate 4 . giycyne 5 . histidine 6 . NH3 ； 7 . arginine 8 . threonine 9 . aianine 10 . （ Pro ） ； （ Cys ） ； （ Tyr ） ； （ Vai ） ； （ Met ） ； （ Lys ） ； 11 . cystine 12 . tyrosine 13 . vaiine 14 . methionine 15 . iysine 16 . proiine （ Iie） ； （Leu） ； （Phe） 。 isoieucine 17 . ieucine 18 . phenyiaianine
分析化学
第 28 卷
时间 （min） Time 0 17 24 34 35 37 38 45
流动相 A （%） Mobiie phase A 100 91 80 68 68 0 100 100
流动相 B Mobiie phase B（ % ） 0 5.4 17 20 20 60 0 0
流动相 C Mobiie phase C（ % ） 0 3.6 3 12 12 40 0 0
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引
言
〔1〕 测定食物中氨基酸含量一般采用氨基酸分析仪， 柱后衍生测定 ， 但氨基酸分析仪价格昂
贵， 分析时间长， 且只能用于分析氨基酸， 限制了氨基酸分析技术的广泛应用。70 年代以来，
〔2 ~ 4〕 柱前衍生高效液相色谱法开始应用于氨基酸的测定 。液相色谱通用性强， 检测灵敏度高，
可用于多种物质的分析。本文采用柱前衍生紫外检测的方法对几种食物中的 16 种氨基酸进 行了测定。
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实验部分
试剂 浓盐酸 （优级纯） ； 苯酚 （分析纯） ； 混合氨基酸标准液 （ Waters 公司） ， 含 17 种蛋白水解氨基
酸： 天冬氨酸 （Asp） 、 丝氨酸 （ Ser） 、 谷氨酸 （ GIu） 、 甘氨酸 （ GIy） 、 组氨酸 （ His） 、 精氨酸 （ Arg） 、 苏氨 酸 （ Thr） 、 丙氨酸 （AIa） 、 脯氨酸 （ Pro） 、 胱氨酸 （ Cys） 、 酪氨酸 （ Tyr） 、 缬氨酸 （ VaI） 、 蛋氨酸 （ Met） 、 赖 、 异亮氨酸 （ IIe） 、 亮氨酸 （ Leu） 、 苯丙氨酸 （ Phe） 、 除胱氨酸浓度为 1.25 mmoI / L 外， 其 氨酸 （ Lys） 余 16 种氨基酸浓度各为 2.5 mmoI / L； 流动相 A， 磷酸盐缓冲溶液 （Waters 公司） ， 按 1 1 10 用双蒸 水稀释， pH 4 . 95。亦可自行配制， pH 值应准确调节。配制方法： 19.0 g 三水醋酸钠， 1.72 g 三 乙胺溶于 1000 mL 水， 用磷酸调 pH 至 4 . 95， 加适量 EDTA， 用 0.45 ! 乙 m 滤膜过滤。流动相 B， 腈； 流动相 C， 双蒸水； 硼酸盐缓冲溶液 （Waters 公司） ； 衍生试剂 6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚 氨基甲酸酯 （AOC） （Waters 公司） ， 用时加入 1 mL 乙腈， 混匀于 55C 烘箱加热 10 min 至溶解。 仪器 "#" 高效液相色谱仪 （ Waters 公司， ； 真空泵 （ WP 600 泵， 2487 紫外检测器， PC800 工作软件） 日本） ； （昆山市超声波仪器厂） ， 15， KO-250 型超声波清洗器 XW-80 型涡旋混合器。 "#$ 色谱条件 （Waters 公司） ； 柱温， 检测波长， 进样量 色谱柱， 高效 4 ! m Nova-pak tm C18 柱 37C ； 248 nm； 梯度洗脱条件， 如表 1。 10 ! L，
!"!
样品分析 不同食品中氨基酸含量的测定结果见表 3。
表 2 回归方程、 线性范围及检测限 Tabie 2 The iinear regression eguation and the iinear ranges of amino acids
氨基酸 Amino acids Asp Ser Giu Giy His Arg Thr Aia Pro Tyr Vai Met Lys Iie Leu Phe 线性回归方程 Linear regression eguation " = 34905 . 19 # + 156824 . 6 " = 44246 . 89 # + 26064 . 99 " = 33442 . 3 # + 100643 " = 56588 . 55 # - 320267 " = 52251 . 17 # + 128165 . 6 " = 83938 . 23 # + 335844 . 3 " = 56982 . 41 # + 110590 . 1 " = 39068 . 44 # + 269224 . 4 " = 45927 . 89 # + 79327 . 17 " = 60066 . 48 # - 22245 . 4 " = 52251 . 17 # + 128165 . 6 " = 61474 . 18 # - 33608 " = 83938 . 23 # + 335844 . 3 " = 56280 . 66 # + 114682 . 6 " = 56982 . 41 # + 110590 . 1 " = 63046 . 17 # - 37357 线性范围 Linear range（ moi / L） ! 10 ~ 80 10 ~ 100 10 ~ 80 10 ~ 100 10 ~ 100 10 ~ 80 10 ~ 100 10 ~ 100 10 ~ 100 10 ~ 100 10 ~ 100 10 ~ 100 10 ~ 80 10 ~ 100 10 ~ 100 10 ~ 100 相关系数 ! Correiation coefficient 0 . 9975 0 . 9996 0 . 9984 0 . 9946 0 . 9980 0 . 9980 0 . 9985 0 . 9914 0 . 9989 0 . 9997 0 . 9980 0 . 9996 0 . 9980 0 . 9986 0 . 9985 0 . 9998
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分析化学
第 28 卷
Biblioteka Baidu
表 3 样品测定结果 Tabie 3 Determination resuits of amino acids in food sampies
氨基酸 Amino acids （mg / g） Asp Ser Giu Giy His Arg Thr Aia Pro Tyr Vai Met Lys Iie Leu Phe 氨基酸总量 Totai amio acid 维维豆奶粉 Weiwei soy miik powder 23 . 92 8 . 22 43 . 57 6 . 82 2 . 68 6 . 10 6 . 07 7 . 61 11 . 17 6 . 50 8 . 87 3 . 22 12 . 70 8 . 71 15 . 96 9 . 94 182 . 07 猪肉松 Meat powder 25 . 27 8 . 59 51 . 51 8 . 12 4 . 58 6 . 05 8 . 14 14 . 05 9 . 73 4 . 71 10 . 98 5 . 33 21 . 01 10 . 02 20 . 25 9 . 93 218 . 28 血粉 Biood powder 74 . 86 31 . 66 95 . 97 28 . 56 30 . 72 13 . 90 31 . 68 63 . 78 29 . 29 27 . 09 45 . 13 14 . 10 68 . 90 26 . 68 82 . 23 45 . 56 710 . 11 雀巢奶粉 Nestie condensed miik 7 . 12 4 . 05 20 . 91 1 . 75 1 . 64 0 . 75 2 . 86 2 . 90 8 . 25 1 . 85 5 . 17 1 . 84 7 . 30 3 . 92 8 . 57 4 . 02 82 . 92 完达山奶粉 Wandashan miik powder 16 . 94 11 . 00 50 . 73 5 . 02 3 . 61 2 . 58 6 . 91 6 . 56 20 . 48 8 . 04 12 . 76 5 . 88 17 . 03 9 . 73 20 . 52 9.8 205 . 99
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2.4.2 氨基酸衍生步骤 用微量注射器移取 10 ! L 稀释的氨基酸标准溶液或样品水解液放 入 6 X 50 mm 样品管底部； 加入 70 ! 涡旋混合 10 s； 边涡旋混合边加入 20 ! L 硼酸盐缓冲溶液， L 衍生试剂溶液； 用封口膜密封样品管， 置于 55C 烘箱中加热 10 min； 从烘箱中取出样品管冷却 至室温， 供分析用。此衍生样品于 4C 可保存两周。 （约 0.5 ~ 1 . 0 g） 于水解管中， 加入 6 moi / L 盐酸 10 ~ 15 2.4.3 样品水解 精密称取适量样品 加入少量新蒸馏的苯酚， 抽真空， 充高纯氮气， 重复 3 次。迅速将已充好氮气的水解管拧 mL， 紧盖子， 放入 110C 烘箱中水解 22 h。水解完毕， 将水解液过滤， 定容。取适量， 于 55C 减压干 燥至干， 再用适量二次蒸馏水复溶， 备用。 2.4.4 工作曲线制作 将氨基酸标准液配制成浓度分别为 100， 200， 400， 600， 800， 1000 ! moi / L 的溶液， 每一标准液取 10 ! 色谱分离见图 1。 L 依上法衍生后进行测定，
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0 0 AOC
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N
衍生氨基酸 Derivatized amino acid
3
3.1
结果与讨论
回归方程、 线性范围和检测限
根据工作曲线， 以峰面积 （ A） 与浓度 （ C） 进行回归分析， 回归方程结果见表 2。按 S / N = 各氨基酸的检测限为 0 . 5 ! 10， moi / L。 3.2 重现性和加标回收率实验 精密称取约 0.5 g 完达山全脂奶粉样品， 平行称 5 份， 经 2.4.2 和 2.4.3 处理后进行分析。 结果表明， 平行样间各种氨基酸的相对标准偏差 RSD 在 2.29% ~ 7.96% 之间， 重现性较好。 精密称取约 0.01 g 已知氨基酸含量的完达山全脂奶粉样品 5 份， 分别加入 2.5 mmoi / L 的 混合氨基酸标准溶液 0.25 mL， 经同样处理后进行分析。各种氨基酸的加标回收率在 88% ~ 测定结果较好。 110% 之间，
第 28 卷 2000 年 9 月
分析化学（FENXI HUAXUE） 研究简报 Chinese JournaI of AnaIyticaI Chemistry
第9期 1091 ~ 1095
柱前衍生高效液相色谱法测定食物中氨基酸含量
苗 虹! 杨 涛 霍君生 刘期成"" 卢承前
（中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所， 北京 100050）
摘 要 采用柱前衍生高效液相色谱法， 测定了食物中天冬氨酸、 赖氨酸、 亮氨酸等 16 种氨基酸含
量。衍生试剂为 6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯 （ AOC） ， 流动相为磷酸盐缓冲溶液、 乙腈、 水， 梯度洗脱。色谱柱为 4 ! 紫外检测。氨基酸浓度与峰面积呈良好的线性 m 的 Nova-Pak tm C18 柱， 关系， 相关系数均在 0.99 以上， 回收率在 88% ~ 110% 之间， 样品测定结果良好。 关键词 高效液相色谱法， 梯度洗脱， 柱前衍生， 氨基酸