WB原理及操作注意事项

3.免疫检测前如何判断转移效果
4.操作要规范
• “三明治”结果如何放置 • 排尽气泡 • 滤纸更换
膜上有明显的气泡,why? 膜上有明显的气泡
操作时气泡没有排完全
操作很过细， 操作很过细，还是有气 泡，why? 靠膜一侧的胀滤纸不平， 靠膜一侧的胀滤纸不平， 更换！ 更换！
三. 免疫杂交
2. 高背景
• 正确使用封闭剂很关键： • eg1：脱脂奶粉不能与生物素化或者刀豆蛋 白标记的抗体一起使用 • eg2：检测磷酸化的抗体，不能使用含有磷 酸酶的封闭剂 • 所以说：适用于一种抗原抗体组合的封闭 剂不一定适用于另外组合。 • 甲醇是封闭么？？
2. 高背景
封闭剂和二抗中的颗粒杂 质造成 解决办法： 解决办法： 提前配置封闭剂（牛奶）， 提前配置封闭剂（牛奶）， 充分溶解完全后再用。 充分溶解完全后再用。 0.45um滤膜过滤封闭剂 滤膜过滤封闭剂
2. 背景
四. 信号检测
• 1. 较低的信号，低灵敏度 • 2. 整体高背景和荧光高背景
1. 较低的信号，低灵敏度
• 增强信号： 优化一抗 浓缩样品 选择更高敏感度的发光底物（millipore的 比Thermo的敏感很多）
2. 整体高背景和荧光高背景
• 减少曝光时间 • 荧光高背景针对免疫荧光wb，PVDF和NC 膜会造成相当高的自发荧光背景，可选用 Immobilon-FL,专门针对荧光检测使用，背 景比PVDF低10倍，比NC低2倍
原理
• 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹 (Western blotting)，是根据抗原抗体的特异性结 合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在 凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的 一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDSPAGE的高分辨力和固相免疫测定高特异性和敏 感性，现已成为蛋白质分析的一种常规技术。免 疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对某种蛋白进 行定性和半定量分析。
1. 低特异性 2. 高背景
1. 低特异性
• 主要原因还是一抗 • 提高一抗和二抗的稀释度 • 降低SDS-PAGE中蛋白的上样量
2. 高背景
• 即便是抗体是高特异性的，而且稀释度也 进行了优化，但还是出现了不能接收的背 景问题，why？ • 可能是斑点状的噪音背景和整体的暗背景， 问题出在封闭剂的使用。
2.目标蛋白表达量低
• 加大上样体积 • 浓缩样品 超滤离心，快速、高效，且可以起到一 定的提纯效果，去除一些小分子蛋白 • 增大胶厚度
二、蛋白质转印
• • • • 1.转印不完全 2.小分子蛋白的穿流 3.免疫检测前如何判断转移效果 4.操作规范
1.转印不完全
要选对膜！ 常用的膜有两种： PVDF：聚偏二氟乙烯 NC： 硝酸纤维素
优化转移过程
• 调节转移缓冲液成分： SDS（<0.05%） 甲醇（10%-20%小分子除外） • 延长凝胶在转移缓冲液中平衡时间（去除 凝胶种的SDS） 5-30min
• In SDS-PAGE systems, the running buffer is supplemented with SDS. This SDS concentrates from the cathode reservoir and runs into the gel behind the bromophenol blue tracking dye. Since most gels are run until the tracking dye is at the bottom of the gel, all of the excess SDS remains in the gFra Baidu bibliotekl and is carried over into the blotting procedure. If it isn’t allowed to diffuse out of the gel prior to transfer, it will interfere with protein adsorption. Equilibration times can be extended up to 30 minutes, and sufficient buffer should be used to reduce the SDS to a minimal level.
• In this study, radioactive BSA was resolved by SDSPAGE, and the gels were equilibrated in transfer buffer for periods ranging from 0 to 30 minutes. Protein was transferred to Immobilon-P transfer membrane backed up with a piece of Immobilon-PSQ transfer membrane to adsorb any BSA not retained by the Immobilon-P transfer membrane. At the end of the transfer period,the BSA in the gel, on the primary blot (Immobilon-P transfer membrane) and on the back-up blot (Immobilon-PSQ transfer membrane) was quantified. Retention improved to 90% when the duration of the equilibration period was increased to 30 minutes. Other proteins have been found to behave similarly
显影液放置30sec 显影液放置
显影液放置>1min 显影液放置
• The high affinity of PVDF for protein gives efficient transfer and high detection efficiency, but it can make background control more difficult. PVDF is the membrane of choice for stripping and reprobing.
WB原理及操作注意事项
• 印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而 后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维 素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后 人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分 析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对 单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹 法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分 子的印迹分析称为Eastern印迹法。
2.小分子蛋白穿流
• 使用PSQ膜
2.小分子的流穿
• 增加甲醇的浓度到30-40% • 甲醇能帮助蛋白分子与SDS解离，故增加 甲醇的浓度也可以降低小分子蛋白的转印 速度，避免转印过度 • 也可以减少转移缓冲液种的SDS（但为啥 我们实验室还用含SDS的缓冲液？），或 者减少转移时间，以防止转移过度
特点
• 1.SDS-PAGE的高分辨力
• 2.固相免疫测定高特异性和敏感性
常见问题和注意事项
• • • • 一.蛋白处理与样品处理 二.蛋白质转印 三.免疫杂交 四.信号检测
一、蛋白处理与样品处理
• 1.如何选择裂解液？ • 2.目标蛋白含量低怎么办？
1.如何选择裂解液
• 变性裂解液：快速，含有离子型去垢剂，作用强，可迅速 从组织和细胞中提取大量蛋白质 • eg：2*SDS上样缓冲液 • 非变性裂解液：较温和，适用于识别非变性的抗原表位的 抗体，可配合免疫沉淀、活性分析等应用 • eg：RIPA buffer（含TritonX-100，提全细胞蛋白） Total protein Extraction Kit (含NP-40，更温和) Whole Cell Extraction Kit(最温和，可做酶活性分析) Nuclear Extraction Kit(用来提取核蛋白)