大豆蛋白的Alcalase酶解及酶解液在酸性条件下的稳定性研究

ｗ）， 底 物 浓 度 ８％ （ｗ／ｗ）。经 预 处 理 后 的 大 豆 蛋 白 分 散
液 ， 降 温 至 ６０℃， 加 入 ０．１％ （ｖ／ｗ） Ａｌｃａｌａｓｅ 酶 ， 在
６０℃下 保 温 搅 拌 进 行 酶 解 。 分 别 于 酶 解 ０、 １０ｍｉｎ、
２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ、２４０ｍｉｎ 时取
×１００％
２ 结果与分析
降低酶解程度。酶解超过 １２０ｍｉｎ， 聚合程度大于 水 解 程度， 降低溶液中游离氨基酸与氢离子的含量， 表现 出来为 ｐＨ 值的升高与水解度的降低。 ２．２ 酶解时间对蛋白溶出率的影响
蛋白溶出率与酶解液的稳定性有较大关系， 通常 在同等条件下， 具有较高蛋白溶出率的酶解液具有较 好的稳定性。商用大豆分离蛋白的溶出率较低， 特别 是在酸性条件下， 因此其稳定性也较差， 限制了其在 食品中的应用。通过酶解， 大豆蛋白被水解为短肽， 溶解性有显著提高。在各酶解时间取样， 测定其蛋白
稳定性。
３ 结论
（ １） Ａｌｃａｌａｓｅ 酶的 酶 解 条 件 为 ： 大 豆 蛋 白 浓 度 ８％ （ｗ／ｗ）， 温 度 ６０℃， 酶 用 量 ０．１％ （ｖ／ｗ）。在 以 上 条 件 酶 解 １２０ｍｉｎ 时水解度和蛋白溶出率达到最大值， 分别为 １１．２５％与 ５０．０９％。
（ ２） 在本试验酶解条件下， 蛋白的酶解与聚合反 应可能同时发生， 酶解初期， 酶解程度远比聚合程度 大 ， 至 酶 解 １２０ｍｉｎ 后 ， 蛋 白 的 聚 合 程 度 较 酶 解 程 度 大， 酶解产物由于疏水性相互作用形成的不溶性絮凝 物增多， 降低酶解液的水解度与蛋白溶出率。
本 试 验 中 分 别 以 酶 解 时 间 为 ０、 ３０ｍｉｎ、 ９０ｍｉｎ、 １２０ｍｉｎ、 １８０ｍｉｎ 的 大 豆 蛋 白 酶 解 液 配 制 蛋 白 含 量 为 １．０％的溶液， 以 柠 檬 酸 调 节 ｐＨ 值 至 ４．１５￣４．２０， 常 温 放置 观 察 其 稳 定 性 ； 放 置 ３０ｄ 后 ， 测 定 溶 液 的 蛋 白 溶 出率， 观察及测定结果见表 １。
样， 酶解液于 ９０￣９５℃下灭菌 １０ｍｉｎ。灭酶后， 按 １．３．４
中方法测定酶解液的 ｐＨ 值、水解度及蛋白溶出率。
１．３．３ 大豆蛋白酶解液的稳定性研究
模拟酸性饮料的配方与工艺， 以大豆蛋白酶解
液配 制 蛋 白 含 量 为 １．０％的 溶 液 ， 以 柠 檬 酸 调 节 ｐＨ
值至 ４．１５￣４．２０， 具体工艺流程如下：
１ 材料与方法来自百度文库
１．１ 试验材料 大豆分离蛋白 （ 蛋白含量为 ９０．１％） ： 山东万得福
实 业 集 团 有 限 公 司 ； Ａｌｃａｌａｓｅ 酶 （ ２．４Ｌ ＦＧ， 活 力 为 ２．４ＡＵ／ｇ） ： 丹 麦 诺 维 信 公 司 ； 亚 硫 酸 钠 ： 食 品 级 ， 市 售； 柠檬酸： 食品级， 市售； 其他试剂均为分析纯。 １．２ 试验仪器
未酶解的大豆蛋白分散液在酸性条件下表现出较 差的稳定性， 在常温下放置 １ｄ 后即出现沉淀， 蛋白溶 出 率 仅 为 ５．６７％， 为 原 酶 解 液 的 ５４％； 经 酶 解 后 的 大 豆蛋白在酸性条件下表现出较好的稳定性， 且稳定性
表 １ 不同酶解时间的酶解液在酸性条件中的稳定性
样品序号
１
２
３
溶出率。测定结果如图 ２ 所示。 由图 ２ 可知， 酶解前期， 蛋白溶出率随酶解时间
的增加而增加， 酶解 ３０ｍｉｎ 内蛋白溶出率的增长迅速， 超过 ３０ｍｉｎ 后增速减缓， 这种变化与酶解过程中 ｐＨ 值 的降低有关， 酶解过程中 ｐＨ 值的降低能同时降低蛋白 的溶解性， 进而减缓酶解过程中蛋白溶出率的增速。 本 试 验 条 件 下 最 大 蛋 白 溶 出 率 出 现 在 酶 解 １２０ｍｉｎ 时 ， 为 ５０．０９％。酶解超过 １２０ｍｉｎ 后蛋白溶出率随酶解时间 的增加而减少， 至酶解 ２４０ｍｉｎ 时降至 ４６．６０％。结合酶 解过程中水解度与 ｐＨ 值的变化情况， 认为在酶解超过 １２０ｍｉｎ 后， 蛋白的聚合程度大于蛋白的酶解， 酶解产 物由于疏水性相互作用结合的絮凝物增多， 且根据蛋 白溶出率的减少， 推测此絮凝物为不溶性絮凝物。不 溶性絮凝物的形成导致酶解后期蛋白溶出率与水解度 降低， 进而降低酶解液的稳定性。 ２．３ 酶解时间对大豆蛋白酶解液稳定性的影响
除样品 ４ 外， 其他 ３ 种含大豆酶解液的样品均在 放置 ３０ｄ 内 出 现 不 同 程 度 的 分 层 ， 溶 液 上 清 液 的 蛋 白 含 量 也 随 之 变 化 。其 中 ， 样 品 ５ 在 放 置 ３０ｄ 后 ， 出 现 松散的絮状物沉淀， 这与其他 ２ 种样品在放置过程中 产生较坚实沉淀不同。这一现象可用不同酶解液的酶 解情况解释。样品 ２、３ 中的大豆酶解液由于蛋白溶出 率与水解度稍低， 其中含有的大豆蛋白分子结构较大， 在酸性条件中形成较坚实沉淀； 样品 ５ 中的大豆酶解 液由于酶解时间的延长， 其中的酶解产物通过疏水性 相互作用形成不溶性絮凝物， 其分子间结合远不如大 豆蛋白紧密， 因此在酸性溶液中表现为松散的絮凝状 沉淀； 同时， ３ 种样品在放置 ３０ｄ 后， 离心得到的上清 液中蛋白含量也较样品 ４ 低， 证明在本试验条件下， 酶解时间过短或过长都会降低酶解液在酸性条件下的
溶液蛋白溶出率 （％）
５．６７ ３１．８２ ３８．３７ ４４．０８ ４１．０４
注 ： “＋＋” 表 示 状 态 均 匀 ； “＋” 表 示 稍 有 分 层 ， 但 不 明 显 ；
“－ ”表示溶液分层。
随酶解时间增加而增加， 其中， 样品 ４ 表现出最佳的 稳定 性 ， 在 常 温 下 放 置 ３０ｄ 仅 有 少 量 分 层 ， 溶 液 蛋 白 溶出率为 ４４．０８％， 为原酶解液的 ８８％。这与上面所 得 的结论一致， 证明在本试验酶解条件下酶解 １２０ｍｉｎ 的 大豆酶解液在酸性条件下表现出良好的稳定性， 适用 于酸性食品中。
２．１ 酶解时间对酶解液 ｐＨ 值与水解度的影响 在 酶 解 过 程 中 ， 分 别 酶 解 １０ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、
６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、 １８０ｍｉｎ、２４０ｍｉｎ 后 取 样 ， 测 其 ｐＨ 值 及 水 解 度 。 大 豆 蛋 白 酶 解 液 在 酶 解 过 程 中 的 ｐＨ 值与水解度变化的过程如图 １ 所示。
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大豆蛋白的 Ａｌｃａｌａｓｅ 酶解及酶解液在酸性条件下的稳定性研究
陈 中 蔡 蕾 林伟锋 鲍志宁
（ 华南理工大学食物蛋白工程研究中心）
【摘要】本文研究了 Ａｌｃａｌａｓｅ 酶对大豆分离蛋白的酶解及大豆酶解液在酸性条件下的稳定性。 酶解条件为： 温度 ６０℃， 底物浓度 ８％ （ｗ／ ｗ）， 酶用量 ０．１％ （ｖ／ ｗ）。酶解 １２０ｍｉｎ 时， 大豆酶解液 具有最高的水解度与蛋白溶出率， 分别为 １１．２５％与 ５０．０９％， 该酶解液在酸性条件下具有良 好 的 稳 定 性 。酶 解 时 间超 过 １２０ｍｉｎ， 酶 解 液 因 酶 解 产 物间 的 疏 水 性 相 互 作 用 而 形 成 不 溶 性 絮 凝 物 ， 酶解液的蛋白溶出率及其在酸性条件下的稳定性下降。
（ ３） 以大豆蛋白酶解液配制蛋白含量为 １．０％的溶 液 ， 以 柠 檬 酸 调 节 ｐＨ 值 至 ４．１５￣４．２０， 大 豆 酶 解 液 在 此酸性条件下表现出较好的稳定性， 酶解 １２０ｍｉｎ 的酶 解产物 在 此 酸 性 条 件 下 放 置 ３０ｄ 后 仅 有 少 量 分 层 ， 溶 液蛋白溶出率为 ４４．０８％， 为原酶解液的 ８８％。
柠檬酸 ↓
大豆蛋白酶解液→混合→调酸→均质→灌装→灭菌→冷却
产品在常温下放置观察稳定性。放置 ３０ｄ 后， 按 １．３．４
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１．３．４ 中方法测定蛋白溶出率。
１．３．４ 测定方法
ｐＨ 值： 以 ｐＨＳ－ ２５ 型酸度计测定。
４
５
酶解液的酶解时间 （ｍｉｎ）
０
３０ ９０ １２０ １８０
溶液 ｐＨ
４．２ ４．１９ ４．２ ４．１８ ４．１５
溶液起始状态
＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
１ｄ 后 稳定性
７ｄ 后
－
＋
＋＋ ＋＋ ＋＋
／
－
＋
＋＋
＋
３０ｄ 后
／
／
－
＋
－
酶解液蛋白溶出率 （％）
１０．５ ４３ ４８．５７ ５０．０９ ５０．０５
图 ２ 蛋白溶出率与酶解时间的关系 （Ｐ ＜０．０５）
图 １ ｐＨ 与水解度随酶解时间的变化趋势 （Ｐ ＜０．０５）
由图 １ 可知， 酶解主要发生在酶解的前 ６０ｍｉｎ， 且 水解度随酶解时间增加而增加。在本试验条件下， 酶 解 ３０ｍｉｎ 内 酶 解 程 度 较 剧 烈 ， 这 与 一 般 结 果 一 致 ； 最 大水解度出现在酶解 １２０ｍｉｎ， 此时酶解液具有最低 ｐＨ 值 及 最 高 水 解 度 ， 分 别 为 ６．４０％与 １１．２５％。酶 解 超 过 １２０ｍｉｎ 后 ， ｐＨ 值与水解度呈与之前相反的变化趋 势 。 产生这一差异的原因与酶解产物的相互作用有关。目 前， 对于 Ａｌｃａｌａｓｅ 酶解大豆蛋白的研究中， 除了以 Ａｌ－ ｃａｌａｓｅ 酶 解 大 豆 蛋 白 外 ， 在 适 当 条 件 下 以 Ａｌｃａｌｓｅ 酶 处 理大豆蛋白， 也可以形成蛋白凝胶。在酶解过程中， Ａｌｃａｌａｓｅ 酶将蛋白的一些肽键打断， 使其中的疏水性氨 基酸残基暴露出来， 这些残基可以通过疏水作用形成 网络结构。在本试验条件下， 酶解与聚合同时发生， 随着蛋白酶解， 酶解产物在疏水性作用下形成絮凝物，
０．０２％ （ｗ／ ｗ） 亚硫酸钠 Ａｌｃａｌａｓｅ 酶
↓
↓
大 豆 分 离 蛋 白 → 溶 解 →８０℃ 预 处 理 １０ｍｉｎ →６０℃ 酶
解→ ９０￣９５℃灭酶 １０ｍｉｎ→冷却
１．３．２ 大豆分离蛋白的酶解
参照其他文献关于 Ａｌｃａｌａｓｅ 酶解大豆蛋白的研究，
选 用 酶 解 条 件 为 ： 酶 解 温 度 ６０℃， 加 酶 量 为 ０．１％ （ｖ／
水解度： 以甲醛滴定法测定。
蛋白质含量： 以凯氏定氮法测定。
蛋 白 溶 出 率 ： 酶 解 液 在 ３ ０００ｇ 离 心 ３０ｍｉｎ， 得 到
上清液， 并分别测定酶解液与上清液的蛋白含量， 按
下式计算蛋白溶出率：
蛋白溶出率＝
上 清 液 蛋 白 含 量 ×上 清 液 量 酶 解 液 蛋 白 含 量 ×酶 解 清 液 量
【关键词】Ａｌｃａｌａｓｅ 酶； 酶解； 稳定性 中图分类号： ＴＱ９３６．１ 文献标识码： Ａ 文章编号： １６７３－ ７１９９ （２００７） ０７－ ００７８－ ０３
大豆含有约 ４０％的蛋白质， 其氨基酸组成较完全， 是优质的食物蛋白。但大豆蛋白的消化率低， 且其加 工性能如溶解性、稳定性等较差， 大大限制了大豆蛋 白在食品中的应用。Ａｌｃａｌａｓｅ 酶是一种由地衣型芽孢杆 菌生产所得的丝氨酸蛋白酶， 近年来逐渐用于蛋白的 水 解 。 目 前 关 于 Ａｌｃａｌａｓｅ 酶 解 大 豆 蛋 白 的 研 究 包 括 酶 解的工艺优化、过程研究、酶解制备大豆肽等， 但对 于酶解产物的应用及其在酸性条件中的稳定性研究相 对 较 少 。 本 文 以 Ａｌｃａｌａｓｅ 酶 对 商 用 大 豆 分 离 蛋 白 进 行 酶解， 研究大豆分离蛋白在酶解过程中的变化， 并进 行酶解产物在酸性条件下的稳定性研究。
ｐＨＳ－ ２５ 型 ｐＨ 计 ： 上 海 精 密 科 学 仪 器 有 限 公 司 ； ｈｉｍａｃ ＣＲ ２２Ｇ 型大容量高速冷冻离心机： 日本 Ｈｉｔａｃｈｉ 公司； Ｂüｃｈｉ Ｂ－ ２９０ 凯氏定氮仪： 瑞士 Ｂüｃｈｉ 公司。
粮油加工
７８ ２００７ 年第 ７ 期
１．３ 试验方法
１．３．１ 大豆分离蛋白酶解液的制备工艺
大豆蛋白的等电点为 ｐＨ 值 ４．５ 左右， 因此， 在酸 性饮料中， 大豆蛋白的稳定性差， 大大限制大豆蛋白 的应用。大豆蛋白酶解液具有良好的溶解性与稳定性， 且具有较好的消化性， 可用于酸性蛋白饮料的生产。
粮油加工
７９ ２００７ 年第 ７ 期
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