紫外可见分光光度法
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紫外-可见分光光度法测定
紫外-可见分光光度法测定1. 引言1.1 引言紫外-可见分光光度法是一种常用的分析化学方法，通常用于测定物质的浓度或测定物质的吸光度。
该方法利用紫外-可见光谱仪测量样品对紫外和可见光的吸收情况，从而推断样品中所含物质的浓度或结构。
在化学分析实验中，紫外-可见分光光度法具有灵敏度高、准确性高和简便易行的优点，因此被广泛应用于药物分析、环境监测、食品检测等领域。
本实验旨在通过该方法测定样品中目标物质的浓度，并探讨影响测定结果的因素。
通过对仪器原理、操作步骤、实验结果、数据分析和影响因素的详细讨论，我们将深入了解紫外-可见分光光度法的原理和应用，并为今后在相关领域的研究提供参考和借鉴。
希望本实验能够为我们提供更多关于分光光度法的实际操作经验，提升我们的实验技能和分析能力。
1.2 背景介绍紫外-可见分光光度法是一种广泛应用于化学分析领域的分析方法，通过测定物质在紫外-可见光区域的吸收特性，从而确定物质的浓度或者进行定性分析。
紫外-可见分光光度法具有操作简单、灵敏度高、选择性强的特点，被广泛应用于环境监测、食品安全检测、药品质量控制等领域。
随着科学技术的不断发展，紫外-可见分光光度法在实验室分析中扮演着越来越重要的角色。
通过测定物质在特定波长范围内的光吸收情况，我们可以获得关于物质性质的重要信息，如浓度、溶解度、稳定性等。
掌握紫外-可见分光光度法的原理和操作方法，对于提高实验准确性和效率具有重要意义。
在本文中，我们将介绍紫外-可见分光光度法的仪器原理、操作步骤、实验结果、数据分析和影响因素，希望能够为读者提供一份系统全面的紫外-可见分光光度法测定指南。
通过总结和展望，我们也希望能够进一步探讨该方法在化学分析领域的应用前景。
1.3 研究目的紫外-可见分光光度法是一种常用的分析化学技术，可以用于测定物质的吸光度，从而推断物质的浓度。
本实验的研究目的主要分为以下几点：1. 研究紫外-可见分光光度法在测定物质浓度方面的应用。
紫外可见分光光度法UltravioletVisible
A1 = 1bc1 A2 = 2bc2 A = 1bc1+ 2bc2
当物质中只有一种吸光组分，则上式简化 为：
A=bc
（3）定义2：若将I/I0称为透光度（亦称：透 射率），用T表示， T=I/I0 则 A= lgI0/I= - lgT= bc
2. 朗伯-比尔定律成立的条件及其偏离该定律 的因素 （1）成立的条件 (a) 适用于极稀的溶液(一般c<0.01molL-1)。 (b) 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的 相互作用机制只是光被该成分吸收。 (c) 采用“单色光”。 (d) 吸收成分（分子或离子）的行为相互无 关，且不论其数量和种类如何。
iii) 分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混 合，就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶， 它的吸收峰在可见光区。
特点：电荷转移吸收光谱的最大特点 是：吸收强度大，摩尔吸收系数一般超过 104L/ (mol cm)。
（3）两种吸收谱带的区别 这类光谱一般位于可见光区。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度 大，最大波长处的摩尔吸收系数max可大于 104 L cm-1mol-1。 与电荷迁移跃迁比较，配位场跃迁吸收 谱带的摩尔吸收系数小，一般max< 102L cm-1mol-1。
吸收峰红移，n→*跃迁所产生的吸收峰蓝移。
（3）除上述六种跃迁可产生紫外-可见吸收 谱带外，还有两种跃迁也可产生紫外-可见吸 收谱带，即电荷转移跃迁和配位场跃迁。
综上所述：发生在电磁光谱的紫外和可 见光区内的，由于电子的跃迁或转移而引起 的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型。
3. 在有机物的紫外-可见谱解析中吸收带的分类 在有机物的紫外-可见谱解析中，通常将吸 收带分为以下四种类型。
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
当物质中只有一种吸光组分，则上式简化 为：
A=bc
（3）定义2：若将I/I0称为透光度（亦称：透 射率），用T表示， T=I/I0 则 A= lgI0/I= - lgT= bc
2. 朗伯-比尔定律成立的条件及其偏离该定律 的因素 （1）成立的条件 (a) 适用于极稀的溶液(一般c<0.01molL-1)。 (b) 电磁波辐射和所讨论的吸光成分之间的 相互作用机制只是光被该成分吸收。 (c) 采用“单色光”。 (d) 吸收成分（分子或离子）的行为相互无 关，且不论其数量和种类如何。
iii) 分子络合物内部电荷转移 例如：在乙醇介质中，将醌与氢醌混 合，就可以得到美丽的醌氢醌暗绿色结晶， 它的吸收峰在可见光区。
特点：电荷转移吸收光谱的最大特点 是：吸收强度大，摩尔吸收系数一般超过 104L/ (mol cm)。
（3）两种吸收谱带的区别 这类光谱一般位于可见光区。 电荷迁移吸收带的谱带较宽，吸收强度 大，最大波长处的摩尔吸收系数max可大于 104 L cm-1mol-1。 与电荷迁移跃迁比较，配位场跃迁吸收 谱带的摩尔吸收系数小，一般max< 102L cm-1mol-1。
吸收峰红移，n→*跃迁所产生的吸收峰蓝移。
（3）除上述六种跃迁可产生紫外-可见吸收 谱带外，还有两种跃迁也可产生紫外-可见吸 收谱带，即电荷转移跃迁和配位场跃迁。
综上所述：发生在电磁光谱的紫外和可 见光区内的，由于电子的跃迁或转移而引起 的吸收光谱共有以上八种价电子跃迁类型。
3. 在有机物的紫外-可见谱解析中吸收带的分类 在有机物的紫外-可见谱解析中，通常将吸 收带分为以下四种类型。
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
紫外可见分光光度法简介
吸光度: 为透光度倒数的对数，用A表示， 即
A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l 为透光液层厚度。
子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助 色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处 的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。
化合物 苯 氯苯 溴苯 苯酚 苯甲醚
取代基
max / nm 254
Cl 264
Br 262
OH 273
OCH3 272
m ax
300 320 325 1780 2240
1.定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未
知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定 性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困 难。
2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便
的。
如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260的比值，鉴定其纯度。
3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的
光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。
紫外-可见分光光度计
一、主要部件的性能与作用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物 中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。
A=lg1/T=lgI0/It
二、朗伯-比尔定律 朗伯-比尔定律：当一束平行单色光通过含有 吸光物质的稀溶液时，溶液的吸光度与吸光 物质浓度、液层厚度乘积成正比，即
A= κ cl 式中比例常数κ与吸光物质的本性，入射光 波长及温度等因素有关。c为吸光物质浓度，l 为透光液层厚度。
子时，可引起吸收峰的位移和吸收强度的改变，这些基团称为助 色团。如苯环的一个氢原子被一些基团取代后，苯环在254nm处 的吸收带的最大吸收位置和强度就会改变。
化合物 苯 氯苯 溴苯 苯酚 苯甲醚
取代基
max / nm 254
Cl 264
Br 262
OH 273
OCH3 272
m ax
300 320 325 1780 2240
1.定性分析 每一种化合物都有自己的特征光谱。测出未
知物的吸收光谱，原则上可以对该未知物作出定 性鉴定，但对复杂化合物的定性分析有一定的困 难。
2.纯度的鉴定 用紫外吸收光谱确定试样的纯度是比较方便
的。
如蛋白质与核酸的纯度分析中，可用 A280/A260的比值，鉴定其纯度。
3.结构分析 紫外-可见吸收光谱一般不用于化合物的
光源不是点光源，比色皿光径长度不一 致，光学元件的缺陷引起的多次反射等，均 造成光径不一致，从而与定律偏离。
紫外-可见分光光度计
一、主要部件的性能与作用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
结构分析，但利用紫外吸收光谱鉴定化合物 中的共轭结构和芳环结构还是有一定价值。
第一章 紫外-可见分光光度法
➢ *跃迁：可以发生在任何具有不饱和键的 有机化合物分子中，其最大摩尔吸光系数max 很大。
➢ n*跃迁：发生在含有杂原子（O、N、S、P 、卤素等）的不饱和化合物中，其最大摩尔吸 光系数max 比较小。
二、常用术语
➢ *生色团：分子中可以吸收光子产生电子跃迁的基团 。含有键的不饱和基团
➢ *助色团：有些基团本身没有生色作用，但却能增强 生色团的生色能力，即它们与生色团相连时，会使其 吸收带最大吸收波长发生红移，并且增加其强度。通 常是带有非键电子对的杂原子的饱和基团，如-OH、 -NH2、-OR、-SH、-SR、-Cl、-Br、-I等。
不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生 的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。
（4）光多道二极管阵列检测分光光度计
具有快速扫描的特点
可在0.1秒内获得190～ 820nm范围的全光光谱。 用于追踪化学反应的反应 动力学研究。 操作简单，只需将样品放 入无盖开放式样品室，并 点击“开始”即可。
音：
1 暗噪音：检测器与放大电路等各部件不确定性引起。
2 讯号噪音：亦称讯号散粒噪音 电子跃迁的不相等性
测量光强的不确定性
c 0.434K 1 1 c lgT T
➢ 当相对误差 c/c 最小时，求得T=0.368 或 A=0.4343。即当 A=0.4343 时，误差最小！
➢ 通常可通过调节溶液浓度或改变光程l 来控制 A 的读数在 0.2~0.7 范围内。
2. 杂散光 从单色器得到的单色光中与所需波长相 隔较远的光。
3. 散射光与反射光 使透光强度减弱 ，吸光度值偏高。
4. 非平行光 使l 增大影响测量值
（三）透光率测量误差T
由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。
紫外可见分光光度法
ΔT =1%, 溶液浓度相对误差Δc/c 与其透光度T 的关系曲线如右图。
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
2024/10/5
措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
2024/10/5
2
溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
2024/10/5
可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
2024/10/5
20
紫外可见分光光度的使用
2024/10/5
21
2024/10/5
22
721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
2024/10/5
10
吸光度的加和性
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
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措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
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溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
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可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
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紫外可见分光光度的使用
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721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
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吸光度的加和性
第四章紫外-可见分光光度法
3. 红移和紫移：吸收带的最大吸收波长发生移动， 向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为 紫移。
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
紫外可见光分光光度法
紫外-可见分光光度法是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。
当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随光的波长不同而变化。
因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，并绘制其吸光度与波长的关系图即得被测物质的吸收光谱。
从吸收光谱中，可以确定最大吸收波长λmax和最小吸收波长λmin。
物质的吸收光谱具有与其结构相关的特征性。
因此，可以通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较，或通过确定最大吸收波长，或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
用于定量时，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或采用吸收系数法求算出样品溶液的浓度。
紫外可见分光光度法
长在 200nm 左右 5 电荷迁移跃迁 电荷迁移跃迁：是指用电磁辐射照射化合物时，电子从给予体向接受体相联系的轨道上跃迁 电荷迁移实质是一个内氧化还原过程，其相应的吸收光谱称为电荷迁移吸收光谱 某些化合物如取代芳烃可产生这种分子内电荷迁移吸收 许多无机络合物也有电荷迁移跃迁产生的电荷迁移吸收光谱（不少过渡金属与含生色团的试剂反应所生成的络 合物以及许多水合无机离子均可产生电荷迁移跃迁） 电荷迁移吸收出现的波长位置取决于电子给予体和电子接受体相应电子轨道的能量差 若中心离子的氧化能力越强或配体的还原能力越强（相反，若中心离子还原能力越强或配体的氧化能力越强） 则发生电荷迁移时吸收的辐射能量越小 电荷迁移吸收光谱最大的特点是：摩尔吸光系数较大，一般εmax>104，用于定量分析，可以提高检测的灵敏 度 6．配位场跃迁 配位场跃迁：跃迁必须在配体的配位场作用下才有可能产生，称为配位场跃迁 与电荷迁移跃迁比较，由于选择规则的限制，配位场跃迁吸收的摩尔吸光系数较小，一般εmax<102，位于可 见光区 （二） 紫外-可见吸收光谱中一些常用术语
吸收光谱：又称吸收曲线，是以波长λ（nm）为横坐标，以吸光度 A（或透光率 T）为纵坐标所描绘的曲线 1 吸收峰：曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长（λmax） 2 谷：峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长（λmin） 3 肩峰：在一个吸收峰旁边产生的一个曲折，称为~ 4 末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称为~ 5 生色团：有机化合物分子结构中含有π→ π*跃迁或 n→ π*跃迁的基团，如 C＝C；C＝O；C＝N；—N＝ N—，—NO2 等，能在紫外可见范围内产生吸收的原子团 6 助色团：含有非键电子的杂原子饱和基团，如—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X 等，当它们与生色团 或饱和烃相连时，能使该生色团或饱和烃的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加的基团 7 红移：由于化合物结构改变，如发生共轭作用、引入助色团以及溶剂改变等，使吸收峰向长波方向的移动 8 蓝（紫）移：当化合物的结构改变时或受溶剂影响使吸收峰向短波方向移动 9 增色效应：由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加称增色效应或浓色效应 10 减色效应：由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度减弱称减色效应或淡色效应 11 强带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数εmax 值大于 104 的吸收峰称为~ 12 弱带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数εmax 值小于 103 的吸收峰称为~ （三） 吸收带及其与分子结构的关系（考过简答）
吸收光谱：又称吸收曲线，是以波长λ（nm）为横坐标，以吸光度 A（或透光率 T）为纵坐标所描绘的曲线 1 吸收峰：曲线上吸收最大的地方，它所对应的波长称最大吸收波长（λmax） 2 谷：峰与峰之间的部位叫谷，该处的波长称最小吸收波长（λmin） 3 肩峰：在一个吸收峰旁边产生的一个曲折，称为~ 4 末端吸收：在图谱短波端只呈现强吸收而不成峰形的部分称为~ 5 生色团：有机化合物分子结构中含有π→ π*跃迁或 n→ π*跃迁的基团，如 C＝C；C＝O；C＝N；—N＝ N—，—NO2 等，能在紫外可见范围内产生吸收的原子团 6 助色团：含有非键电子的杂原子饱和基团，如—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X 等，当它们与生色团 或饱和烃相连时，能使该生色团或饱和烃的吸收峰向长波方向移动，并使吸收强度增加的基团 7 红移：由于化合物结构改变，如发生共轭作用、引入助色团以及溶剂改变等，使吸收峰向长波方向的移动 8 蓝（紫）移：当化合物的结构改变时或受溶剂影响使吸收峰向短波方向移动 9 增色效应：由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度增加称增色效应或浓色效应 10 减色效应：由于化合物结构改变或其他原因，使吸收强度减弱称减色效应或淡色效应 11 强带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数εmax 值大于 104 的吸收峰称为~ 12 弱带：化合物的紫外可见吸收光谱中，凡摩尔吸光系数εmax 值小于 103 的吸收峰称为~ （三） 吸收带及其与分子结构的关系（考过简答）
紫外-可见分光光度法
单色器质量的优劣，主要决定于 色散元件的质量。色散元件常用棱镜 和光栅。
3 吸收池
吸收池又称比色皿或比色杯，按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前 者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多，其光径可在 0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池 最为常用。
4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光 信号转变为电信号。现今使用的分光光度 计大多采用光电管或光电倍增管作为检测 器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计， 电位调节指零装置，以及自动记录和数用 基本结构:
光源→单色器→吸收池→检测器→信号显示系统 ↑ 样品
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光 源有两类：热辐射光源和气体放电光源
热辐射光源用于可见光区，如钨灯和 卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如 氢灯和氘灯。
2 单色器
单色器的主要组成：入射狭缝、出射 狭缝、色散元件和准直镜等部分。
4 要点与注意事项 4.1 开机前将样品室内的干燥剂取出， 仪器自检过程中禁止打开样品室盖。 4.2 比色皿内溶液以皿高的2/3～4/5为 宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。 测定时应保持比色皿清洁，池壁上液 滴应用滤纸擦干，切勿用手捏透光面。 测定紫外波长时，需选用石英比色皿。
4.3 测定时，禁止将试剂或液体物质放在 仪器的表面上，如有溶液溢出或其它原因 将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。 4.4 如果仪器不能初始化，关机重启。 4.5 如果吸收值异常，依次检查：波长设 置是否正确（重新调整波长，并重新调 零）、测量时是否调零（如被误操作，重 新调零）、比色皿是否用错（测定紫外波 段时，要用石英比色皿）、样品准备是否 有误（如有误，重新准备样品）。
2.1.2 按数字[1]键进入%T/ABS（透过率/吸 光度测定）子菜单，选中对应的数字键来 设定测定条件：①NUM WL(设定测试波长 的数目，最多可设定6个不同波长)；②WL Setting （设定测试波长具体数值）③ Data Mode( 选择测定吸光度或透光率 ) ，设定完 毕后点击 [Enter] 键确定，所有项目设定完 毕后按数字[0] 键确定，等待仪器调整至准 备状态。
第二章 紫外-可见分光光度法
1、光源
作用：供给符合要求的入射光。 （1）可见光光源 常见的可见光光源有：钨丝灯和卤钨灯。 （2）紫外光光源 常见的紫外光光源有：氢灯和氘灯。 •另外，为了使光源发出的光在测量时稳定，光 源的供电一般都要用稳压电源，即加有一个稳 压器。
2、单色器
作用：把光源发出的连续光谱分解成单色光，并 能准确方便地“取出”所需要的某一波长的光， 它是分光光度计的心脏部分。 组成：单色器一般由狭缝、色散元件（棱镜和光 栅）、透镜系统组成。 （1）棱镜单色器 •玻璃棱镜：可吸收紫外光，只能用于可见光区域。 •石英棱镜：用于紫外、可见和近红外三个光区域。 （2）光栅单色器 •可用于紫外、可见及红外光区域，目前生产的紫外可见分光光度计大多采用光栅作为色散元件。
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
四、分光光度计的维护 1、仪器对工作环境的要求
•稳固、温度15～28℃、干燥、无腐蚀性气体、 光线不宜过强
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
2、紫外-可见分光光度计——双光束
•/vlabcq/flash/分光光度计/分光光度 计.html
二、紫外-可见分光光度计的类型及特点 1、按使用的波长范围分
•可见分光光度计：使用波长范围是400～780nm， 只能用于测量有色溶液的吸光度 •紫外-可见分光光度计：使用波长范围是200～ 1000nm，可测量在紫外、可见、近红外有吸收 的物质的吸光度。
紫外可见分光光度法
模块二
紫外－可见分光光度法
第一节 紫外-可见吸收光谱 第二节 朗伯-比尔定律 第三节 紫外－可见分光光度计 第四节 分析条件的选择
第五节 测定方法
概
述
紫外可见分光光度法(Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)，又称:紫外-可见分子 吸收光谱法(Ultraviolet-Visible Molecular Absorption Spectrometry)是利用被测物质 对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定 量和定性的分析方法。
形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；
在样品的吸收光谱区无明显吸收；
如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。
5．pH值的影响
很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同 pH的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其 吸收光谱的形状、λmax和吸收强度可能不一样。
OH O-
OHH+
λmax 210.5nm ,270nm
完全透过
无色
吸收黄色光
2014-12-23
蓝色
13
课堂互动
1．紫外-可见光的波长范围是 A．200~400nm B．400~780nm C．200~780nm D．360~800nm 2．下列叙述错误的是 A．光的能量与其波长成反比 B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈 C．物质对光的吸收有选择性 D．光的能量与其频率成反比
2mg/ml的溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测
定吸光度A。规定A≤0.05。
(三)、结构分析
有机化合物的紫外吸收光谱 可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系
和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目 。
1.饱和碳氢化合物 只产生ơ→ơ*跃迁，所需能量很大， 200－400nm没有吸收，常作为溶剂。
紫外－可见分光光度法
第一节 紫外-可见吸收光谱 第二节 朗伯-比尔定律 第三节 紫外－可见分光光度计 第四节 分析条件的选择
第五节 测定方法
概
述
紫外可见分光光度法(Ultraviolet-Visible Spectrophotometry)，又称:紫外-可见分子 吸收光谱法(Ultraviolet-Visible Molecular Absorption Spectrometry)是利用被测物质 对光的吸收特征和吸收强度对物质进行定 量和定性的分析方法。
形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性；
在样品的吸收光谱区无明显吸收；
如果要与标准品的吸收光谱相比较，须用相同的溶剂。
5．pH值的影响
很多化合物都具有酸性或碱性可解离基团，在不同 pH的溶液中，分子的解离形式可能发生改变，其 吸收光谱的形状、λmax和吸收强度可能不一样。
OH O-
OHH+
λmax 210.5nm ,270nm
完全透过
无色
吸收黄色光
2014-12-23
蓝色
13
课堂互动
1．紫外-可见光的波长范围是 A．200~400nm B．400~780nm C．200~780nm D．360~800nm 2．下列叙述错误的是 A．光的能量与其波长成反比 B．有色溶液越浓，对光的吸收也越强烈 C．物质对光的吸收有选择性 D．光的能量与其频率成反比
2mg/ml的溶液，在1cm吸收池中，于310nm处测
定吸光度A。规定A≤0.05。
(三)、结构分析
有机化合物的紫外吸收光谱 可以推定分子骨架，判断发色团之间的共轭关系
和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目 。
1.饱和碳氢化合物 只产生ơ→ơ*跃迁，所需能量很大， 200－400nm没有吸收，常作为溶剂。
4紫外-可见分光光度法
在进行光度测量时，调节仪器的零点，消除由于吸收池壁及溶剂对 入射光的反射和吸收带来的误差，有时还可以扣除干扰的影响
• 2.参比溶液的选择原则：
• (1)溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂 不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；
• (2) 试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反 应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。
紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法
一、紫外-可见分光光度法原理 二、紫外-可见分光光度计 三、紫外-可见分光光度法应用
紫外-可见分光光度法
分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
电子能级间隔比振动能级和转 动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有 振-转能级的跃迁，形成所谓的 带状光谱。
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
Lambert-Beer 定律适用范围： ①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。 ②均匀、无散射溶液、固体、气体。
吸光度具有加和性：
不仅适用于紫外光、可见光，也适用红外光；在同一波长下， 各组分吸光度具有加和性
A=A1+A2++An
（1）入射光必须为单色光 （2）被测样品必须是均匀介质 （3）在吸收过程中吸收物质之间不能发生相
偏离Lambert-Beer 定律的因素 1. 样品性质影响
1）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收 能力发生变化--- 变化；
2）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响； 3）被测溶液不均匀导致的偏离
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
• 2.参比溶液的选择原则：
• (1)溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂 不吸收时，直接采用溶剂（多为蒸馏水）为参比；
• (2) 试样参比：如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反 应时，可以试样作参比（不能加显色剂）。
紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法
一、紫外-可见分光光度法原理 二、紫外-可见分光光度计 三、紫外-可见分光光度法应用
紫外-可见分光光度法
分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
电子能级间隔比振动能级和转 动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有 振-转能级的跃迁，形成所谓的 带状光谱。
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
Lambert-Beer 定律适用范围： ①入射光为单色光，适用于可见、红外、紫外光。 ②均匀、无散射溶液、固体、气体。
吸光度具有加和性：
不仅适用于紫外光、可见光，也适用红外光；在同一波长下， 各组分吸光度具有加和性
A=A1+A2++An
（1）入射光必须为单色光 （2）被测样品必须是均匀介质 （3）在吸收过程中吸收物质之间不能发生相
偏离Lambert-Beer 定律的因素 1. 样品性质影响
1）待测物高浓度--吸收质点间隔变小—质点间相互作用—对特定辐射的吸收 能力发生变化--- 变化；
2）溶剂的影响：对待测物生色团吸收峰强度及位置产生影响； 3）被测溶液不均匀导致的偏离
第一节 基本原理
二 Lambert- Beer 定律
紫外可见分光光度法
颜色 紫 蓝
绿蓝 蓝绿
绿 黄绿
黄 橙 红
.
互补光 黄绿 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
16
四、光吸收定律 1、光吸收定律 又叫朗伯—比耳定律。
.
17
光吸收定律： 当一束平行单色光垂直入射通过均 匀、透明的吸光物质的稀溶液时，溶 液对光的吸收程度与溶液的浓度及液 层厚度的乘积成正比。
通式是：A = kbc
.
41
光电管结构如图：
1
2
3
4
1是光电管的阳极；镍环或镍片组成
2是光电管的阴极；由金属片上涂一层
光敏物质（如氧化铯）构成
3为电池； 4为放大.器
42
光电倍增管：它是一个非常灵敏的 光电器件，可以把微弱的光转换成电 流。其灵敏度比前2种都要高得多。它 是利用二次电子发射以放大光电流， 放大倍数可达到108倍。
② 具有鲜明的颜色，ε都很大 （一般可达到104以上），所以
测定的灵敏度很高；
③ 选择性好
④ 有些有色配合物易溶于有机溶
剂，可进行萃取光度分析，提
高了测定的灵敏度和选择性。
.
60
3．常见的有机显色剂： ① 磺基水杨酸： OH
其结构式如下：
SO3H
可用于测定三价铁离子。
COOH
.
61
② 邻二氮菲（邻菲罗啉，1， 10—二氮菲）：
.
21
3 吸光系数的二种表示方法：
k值的单位和大小随着b和c的单位 不同而不同。
.
22
（1）质量吸光系数： 厚度以cm表示，浓度以g/L表示的 吸光系数叫“质量吸光系数”。 用α表示 其单位为L/(cm·g)，此时：
A= α b ρ
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1.6.1 朗伯—比耳定律： A＝lg（I0/It)= εb c
式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；
b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；
c：溶液的摩尔浓度，单位mol· L－１；
ε ：摩尔吸光系数，单位L· mol－１· cm－１；
1、原理与概述
透光度(透光率)T
透过度T : 描述入射光透过溶液的程度:
为什么需要使用参比溶液？
测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强
度。
参比溶液的选择一般遵循以下原则：
⑴若仅待测组分与显色剂反应产物在测定 波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯 溶剂（水)作参比溶液；
3、测量条件的选择 ⑵若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸 收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加 试样溶液)作参比溶液； ⑶若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等 无吸收，则可用“试样空白” ( 不加显色剂 ) 作 参比溶液； ⑷若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸 收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分 掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。
2、紫外－可见分光光度计
2、紫外－可见分光光度计
(3)双波长：将不同波长的两束单色光 (λ1、λ2) 快速交替通过同一吸收池 而后到达检测器。产生交流信号。无 需参比池。△=1～2nm。两波长同时
扫描即可获得导数光谱。
3、测量条件的选择
第三节 显色与测量条件的选择
3.1、显色反应的选择 3.2、显色反应条件的选择 3.3、共存离子干扰的消除 3.4、测定条件的选择 3.5、提高光度测定灵敏度和选择性的途径
中国中化集团公司员工培训教材
——紫外可见分光光度法
2008年10月
目
录：
1. 原理与概述 2. 紫外可见分光光度计 2.1 紫外可见分光光度计的结构 2.2 紫外可见分光光度计的类型 3、分析条件的选择 4、应用实例
1、原理与概述
1.1、吸收光谱的分类
在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建 立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有: 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围 2.51000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围 200400 nm，可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围 400780 nm ，主要用于有色物质的定量分析。
1.5.金属配合物的紫外—可见吸收光谱
金属离子与配位体反应生成配合物的颜色 一般不同于游离金属离子(水合离子)和配位 体本身的颜色。
• 例：Fe3＋与SCN－形成血红色配合物， 在490nm处有强吸收峰。其实质是发生 了如下反应：
[Fe3＋ SCN－ ] ＋hν= [Fe SCN ]2＋
1、原理与概述 1.6 定量依据
⑤在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所
以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入
射光波长的重要依据。
1、原理与概述 1.3紫外可见吸收光谱原理
有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃 迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。
在化合物的分子中有形成单键 的σ电子：形成双键或三键的
3、测量条件的选择
3.1、显色反应的选择 1.选择显色反应时，应考虑的因素： 灵敏度高、选择性高、生成物稳定、 显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有
色物最大吸收波长之差：“对比度”，要 求△ > 60nm。
3、测量条件的选择
2.氧化还原显色反应
某些元素的氧化态,如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ ）在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧 化还原反应对待测离子进行显色后测定。 例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直 接进行光度测定
εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于
强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均
可发生该类跃迁。如乙烯π→π*跃迁的 λmax为162nm，εmax为1×104L·mol-1·cm
－1。
⑷ n→π＊跃迁 需能量最低，吸收波长λ>200nm。丙 酮n→π＊跃迁的λmax为275nm εmax为22
4.显色剂
无机显色剂： 硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多 偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成 配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳 定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度 大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。
3、测量条件的选择 3.2、显色反应条件的选择
1.显色剂用量 吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图 所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。
π电子、未共用的（非健）的 n电子
当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态( 反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为：
n →π＊ < π→π＊ < n →σ＊ < σ→σ＊
1、原理与概述
⑴
σ →σ
＊跃迁
所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外 光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子 吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ< 200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到 )。如甲烷的λmax为125nm,乙烷λmax为 135nm。
1、原理与概述
1.2. 物质对光的选择性吸收及吸收曲线
M + h 基态 E1 M* 激发态 E2 M + 热 M + 荧光或磷光
（△E）
E = E2 - E1 = h ：量子化 ；选择 性吸收 吸收曲线与最大吸收波长 max 用不同波长的单色光照射，测吸光度
1、原理与概述
吸收曲线的讨论：
1、原理与概述
助色团： 有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR 、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有 生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当 它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭 作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向 长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的 基团称为助色团。
1、原理与概述
⑵
n→σ＊跃迁
所需能量较大。吸收波长为150～250nm ，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观 察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O 、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ*跃迁。 如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*跃迁
的λmax分别为173nm、183nm和227nm。
⑶ π→π＊跃迁
所需能量较小，吸收波长处于远紫外区 的近紫外端或近紫外区，摩尔吸光系数
掩蔽剂不与待测组分反应；
掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产 物不干扰待测组分的测定。
3、测量条件的选择
3.4、测定条件的选择
1.选择适当的入射波长 一般应该选择λ max为入射光波长。但如 果λ max处有共存组分干扰时，则应考虑选择 灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。
3、测量条件的选择
2.选择合适的参比溶液
3、测量条件的选择
2.反应体系的酸度
在相同实验条件下，分别测定不同pH值条 件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度 较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。 3.显色时间与温度 实验确定 4.溶剂 一般尽量采用水相测定
3、测量条件的选择
3.3、共存离子干扰的消除
1.加入掩蔽剂：
选择掩蔽剂的原则是：
（5） 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行仪 器自动控制和结果处理。
2、紫外－可见分光光度计
2.2、分光光度计的类型
（1)单光束：简单，价廉，适于在给定波长处 测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱 扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。 （2)双光束：自动记录，快速全波段扫描。可 消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的 影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格 较高。
L·mol－1 ·cm
－1（溶剂环己烷)。
1、原理与概述
1.4 生色团与助色团
生色团： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和 n→π＊跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物 分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱 和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁 键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮 基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。
４、应用实例
4.2、水质分析：如 1、水中硫化物的测定 样品经酸化，硫化物转化成硫化氢，用氮气将硫化氢吹出， 转移到盛乙酸锌－乙酸钠溶液的吸收显色管中，与N，N－ 二甲基对苯二胺和硫酸铁铵反应生成蓝色的络合物亚甲基蓝， 在665nm波长处测定。 2、水中磷酸盐的测定 在中性条件下用过硫酸钾（或硝酸—高氯酸）使试样消解，将 所含磷全部氧化为正磷酸盐。在酸性介质中，正磷酸盐与钼 酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血 酸还原，生成蓝色的络合物。在700nm处测量。
可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500 nm。
紫外区：氢、氘灯。发射185～400 nm的连续光谱。
2、紫外－可见分光光度计
（2）单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波 长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
2、紫外－可见分光光度计
第二节 紫外—可见分光光度计
2.1、基本组成 2.2、分光光度计的类型
2、紫外－可见分光光度计
仪器
可见分光光度计
2、紫外－可见分光光度计
紫外-可见分光光度计
2、紫外－可见分光光度计
光源 单色器 样品室 检测器 显示
2.1 仪器组成
（1） 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足 够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得
单色光聚焦至出射狭缝； ⑤出射狭缝。
2、紫外－可见分光光度计