紫外可见分光光度法

T = I t / I0
吸光度A与透光度T的关系:
A ＝ －lg T
1、原理与概述
1.6.2.摩尔吸光系数ε 的讨论
吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数； 不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和 波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关 可作为定性鉴定的参数； 同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在 最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示 。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反 映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。
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——紫外可见分光光度法
2008年10月
目
录：
1. 原理与概述 2. 紫外可见分光光度计 2.1 紫外可见分光光度计的结构 2.2 紫外可见分光光度计的类型 3、分析条件的选择 4、应用实例
1、原理与概述
1.1、吸收光谱的分类
在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建 立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有: 红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围 2.51000 m ,主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围 200400 nm，可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围 400780 nm ，主要用于有色物质的定量分析。
①同一种物质对不同波长 光的吸光度不同。吸光度最 大处对应的波长称为最大吸 收波长λmax
②不同浓度的同一种物质， 其吸收曲线形状相似λmax不 变。而对于不同物质，它们 的吸收曲线形状和λmax则不 同。
1、原理与概述
③吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为 物质定性分析的依据之一。 ④不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸 光度 A 有差异，在λmax处吸光度A 的差异最 大。此特性可作为物质定量分析的依据。
εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于
强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均
可发生该类跃迁。如乙烯π→π*跃迁的 λmax为162nm，εmax为1×104L·mol-1·cm
－1。
⑷ n→π＊跃迁 需能量最低，吸收波长λ>200nm。丙 酮n→π＊跃迁的λmax为275nm εmax为22
2 Mn2＋ ＋5 S2O82-＋8 H2O =2 MnO4＋ + 10SO42-＋ 16H+
将Mn2＋ 氧化成紫红色的MnO4＋后，在 525 nm处进行测定
3、测量条件的选择
3.配位显色反应
当金属离子与有机显色剂形成 配合物时，通常会发生电荷转移跃 迁，产生很强的紫外—可见吸收光 谱。
3、测量条件的选择
④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得
单色光聚焦至出射狭缝； ⑤出射狭缝。
2、紫外－可见分光光度计
（3）样品室
样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应 的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在 紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。
2、紫外－可见分光光度计
（4） 检测器
利用光电效应将透过吸收池的光 信号变成可测的电信号，常用的有光 电池、光电管或光电倍增管。

2、紫外－可见分光光度计
第二节 紫外—可见分光光度计
2.1、基本组成 2.2、分光光度计的类型
2、紫外－可见分光光度计
仪器
可见分光光度计
2、紫外－可见分光光度计
紫外-可见分光光度计
2、紫外－可见分光光度计
光源 单色器 样品室 检测器 显示
2.1 仪器组成
（1） 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足 够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
3、测量条件的选择
3.1、显色反应的选择 1.选择显色反应时，应考虑的因素： 灵敏度高、选择性高、生成物稳定、 显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有
色物最大吸收波长之差：“对比度”，要 求△ > 60nm。
3、测量条件的选择
2.氧化还原显色反应
某些元素的氧化态,如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ ）在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧 化还原反应对待测离子进行显色后测定。 例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直 接进行光度测定
4.显色剂
无机显色剂： 硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多 偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成 配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳 定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度 大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。
3、测量条件的选择 3.2、显色反应条件的选择
1.显色剂用量 吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图 所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。
（5） 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行仪 器自动控制和结果处理。
2、紫外－可见分光光度计
2.2、分光光度计的类型
（1)单光束：简单，价廉，适于在给定波长处 测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱 扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。 （2)双光束：自动记录，快速全波段扫描。可 消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的 影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格 较高。
1.5.金属配合物的紫外—可见吸收光谱
金属离子与配位体反应生成配合物的颜色 一般不同于游离金属离子(水合离子)和配位 体本身的颜色。
• 例：Fe3＋与SCN－形成血红色配合物， 在490nm处有强吸收峰。其实质是发生 了如下反应：
[Fe3＋ SCN－ ] ＋hν= [Fe SCN ]2＋
1、原理与概述 1.6 定量依据
1、原理与概述
1.2. 物质对光的选择性吸收及吸收曲线
M + h 基态 E1 M* 激发态 E2 M + 热 M + 荧光或磷光
（△E）
E = E2 - E1 = h ：量子化 ；选择 性吸收 吸收曲线与最大吸收波长 max 用不同波长的单色光照射，测吸光度
1、原理与概述
吸收曲线的讨论：
⑤在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所
以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入
射光波长的重要依据。
1、原理与概述 1.3紫外可见吸收光谱原理
有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃 迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。
在化合物的分子中有形成单键 的σ电子：形成双键或三键的
1、原理与概述
助色团： 有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR 、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有 生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但当 它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭 作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向 长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的 基团称为助色团。
1、原理与概述
４、应用实例
4.2、水质分析：如 1、水中硫化物的测定 样品经酸化，硫化物转化成硫化氢，用氮气将硫化氢吹出， 转移到盛乙酸锌－乙酸钠溶液的吸收显色管中，与N，N－ 二甲基对苯二胺和硫酸铁铵反应生成蓝色的络合物亚甲基蓝， 在665nm波长处测定。 2、水中磷酸盐的测定 在中性条件下用过硫酸钾（或硝酸—高氯酸）使试样消解，将 所含磷全部氧化为正磷酸盐。在酸性介质中，正磷酸盐与钼 酸铵反应，在锑盐存在下生成磷钼杂多酸后，立即被抗坏血 酸还原，生成蓝色的络合物。在700nm处测量。
3、测量条件的选择
2.反应体系的酸度
在相同实验条件下，分别测定不同pH值条 件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度 较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。 3.显色时间与温度 实验确定 4.溶剂 一般尽量采用水相测定
3、测量条件的选择
3.3、共存离子干扰的消除
1.加入掩蔽剂：
选择掩蔽剂的原则是：
可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500 nm。
紫外区：氢、氘灯。发射185～400 nm的连续光谱。
2、紫外－可见分光光度计
（2）单色器
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波 长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
2、紫外－可见分光光度计
2、紫外－可见分光光度计
(3)双波长：将不同波长的两束单色光 (λ1、λ2) 快速交替通过同一吸收池 而后到达检测器。产生交流信号。无 需参比池。△=1～2nm。两波长同时
扫描即可获得导数光谱。
3、测量条件的选择
第三节 显色与测量条件的选择
3.1、显色反应的选择 3.2、显色反应条件的选择 3.3、共存离子干扰的消除 3.4、测定条件的选择 3.5、提高光度测定灵敏度和选择性的途径
为什么需要使用参比溶液？
测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强
度。
参比溶液的选择一般遵循以下原则：
⑴若仅待测组分与显色剂反应产物在测定 波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯 溶剂（水)作参比溶液；
3、测量条件的选择 ⑵若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸 收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加 试样溶液)作参比溶液； ⑶若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等 无吸收，则可用“试样空白” ( 不加显色剂 ) 作 参比溶液； ⑷若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸 收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分 掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。
掩蔽剂不与待测组分反应；
掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产 物不干扰待测组分的测定。
3、测量条件的选择
3.4、测定条件的选择
1.选择适当的入射波长 一般应该选择λ max为入射光波长。但如 果λ max处有共存组分干扰时，则应考虑选择 灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。
3、测量条件的选择
2.选择合适的参比溶液
3、测量条件的选择
3.控制适宜的吸光度（读数范围）
不同的透光度读数，产生的误差大小不同： 用仪器测定时应尽量使溶液透光度值在T%=20～65％ (吸光度A=0.70～0.20)。
４、应用实例
第四节 应用实例
４.1、有Βιβλιοθήκη Baidu合物紫外光谱解析
了解共轭程度、空间效应、氢键等；可对饱和与 不饱和化合物、异构体及构象进行判别。 紫外—可见吸收光谱中有机物发色体系信息分析 的一般规律是： ⑴若在200～750nm波长范围内无吸收峰，则可能 是直链烷烃、环烷烃、饱和脂肪族化合物或仅含一个 双键的烯烃等。
π电子、未共用的（非健）的 n电子
当外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态( 反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为：
n →π＊ < π→π＊ < n →σ＊ < σ→σ＊
1、原理与概述
⑴
σ →σ
＊跃迁
所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外 光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子 吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ< 200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到 )。如甲烷的λmax为125nm,乙烷λmax为 135nm。
1.6.1 朗伯—比耳定律： A＝lg（I0/It)= εb c
式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；
b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；
c：溶液的摩尔浓度，单位mol· L－１；
ε ：摩尔吸光系数，单位L· mol－１· cm－１；
1、原理与概述
透光度(透光率)T
透过度T : 描述入射光透过溶液的程度:
４、应用实例 ⑵若在270～350nm波长范围内有低强度吸收峰 (ε ＝10～100L·mol-1·cm-1),（n→π 跃迁），则 可能含有一个简单非共轭且含有n电子的生色团，如 羰基。 ⑶若在2５0～300nm波长范围内有中等强度的吸
收峰则可能含苯环。
４、应用实例
⑷ 若在210～250nm波长范围内有强吸收峰，则 可能含有2个共轭双键；若在260～300nm波长范围内 有强吸收峰，则说明该有机物含有3个或3个以上共 轭双键。 ⑸ 若该有机物的吸收峰延伸至可见光区，则该有机 物可能是长链共轭或稠环化合物。
⑵
n→σ＊跃迁
所需能量较大。吸收波长为150～250nm ，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观 察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O 、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ*跃迁。 如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*跃迁
的λmax分别为173nm、183nm和227nm。
⑶ π→π＊跃迁
所需能量较小，吸收波长处于远紫外区 的近紫外端或近紫外区，摩尔吸光系数
L·mol－1 ·cm
－1（溶剂环己烷)。
1、原理与概述
1.4 生色团与助色团
生色团： 最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和 n→π＊跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物 分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱 和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁 键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮 基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。