TripleTOF高分辨质谱在单克隆抗体药物完整分子量测定及轻重链分析中的应用

应用实例 I ：TripleTOF ®高分辨质谱在单克隆抗体药物完整分子量测定及轻重链

分析中的应用

实验设计

样品制备：将单抗Anti-Actin （mouse IgG2isotype, clone AC 40, Sigma ）溶解于含30%ACN 和0.1%FA 的溶液中，溶液用30KD 超滤膜（Millipore, P/N UFC503096）离心过滤，根据盐及去垢剂含量，重复以上操作3至8次。

单抗样品用DTT 在60ºC 下反应35分钟后切断二硫键，以得到重链及轻链用于LC-MS 分析。

高流速液相色谱方法：在岛津液相色谱系统上利用C8 ZORBAX Poroshell 色谱柱（Agilent, 300SB-C8, 1.0 mm ×75 mm, 5 µm ）对完整抗体、重链、轻链进行快速分析。液相色谱梯度如表1右所示，流动相A ：2%乙腈，0.1%FA ，流动相B ：98%乙腈，0.1%FA 。

低流速液相色谱方法：利用Eksigent ® nanoLC-Ultra ®和cHiPLC ®-nanoflex 纳升液相系统对完整单抗样

品进行分析。富集柱：ChromXP C4-CL 3 µm, 300 Å,0.5 mm ×200 µm ，分析柱：ChromXP C4-CL 3

µm, 15 cm ×75 µm 。梯度如表1左所示，流动相A ：2%乙腈，0.1%FA ，流动相B ：98%乙腈，0.1%FA 。

串联质谱技术在生物制药中的应用

表1. LCMS 液相梯度：右部分-快流速液相色谱梯度表；左部分-纳流液相色谱梯度表。

质谱方法：高流速分析时TripleTOF ® 5600采用Turbo V™离子源，在分析最初的2分钟时间内利用分流阀将液体导入废液，避免盐进入质谱。而低流速分析时TripleTOF ® 5600采用纳升离子源。

数据处理：利用BioAnalyst™中的贝叶斯算法进行去卷积处理以得到蛋白的完整分子量。

抗体药物完整蛋白分析

电喷雾离子源（ESI ）结合飞行时间质谱（TOF ），由于其具有极佳的分辨率及质量测定范围，因此特别适合分析分子量较大的蛋白（~150 kDa ）。TripleTOF ® 5600系统的分析质量上限为40,000 Da ，在此质量范围内能够轻松检测经电喷雾电离后的蛋白多电荷离子。采用TripleTOF ® 5600液质联用系统的一级质谱扫描模式测定单抗样品anti-actin 的完整分子量（图1）。本次测定上样量为10 µg ，采用了一个15分钟，流速为200 µL/min 的快速梯度进行分析。通过高质量的质谱图可以测定蛋白的完整分子量，并提供蛋白中异质糖基化的额外细节信息（图1）。

图1. 单克隆抗体Anti-Actin 一级质谱图及去卷积后谱图anti-actin 精确分子量为148513 Da 。

六碳糖的典型丢失显示该抗体由于具有不同的糖基化糖型而表现出非均一性。

此外，当谱图因为单克隆抗体的多样性（连接上不同种类的修饰）形成极为复杂的多电荷峰时，为了取得高准确度的测定结果，除了高质量的质谱数据之外，还需要一款强大的去卷积软件。BioAnalyst™软件的贝叶斯蛋白分子量重建工具能够在进行贝叶斯蛋白重建计算之前，为高度复杂谱图中的质谱峰进行更准确的峰模拟，以提供更精确的蛋白分子量计算结果。

高灵敏度分析：本文同样考察了TripleTOF® 5600结合快速液相色谱系统时在较小样品上样量情况下的灵敏度。当上样量仅为1 µg时仍能得到质量极佳的质谱数据（图2）。

图2. 单克隆抗体Anti-Actin在两种流速下，三种不同进样量情况时的质谱图即使在低上样量情况下，TripleTOF® 5600系统仍然显示了极佳的灵敏度。（上图）高流速下蛋白IgG上样量为1-10µg时所得质谱图。（下部分）低流速下蛋白IgG上样量为7.5-30 ng时所得质谱图。局部放大图显示了该单克隆抗体的不均一性。

重链及轻链的表征

约20%的人类抗体的糖基化修饰发生在可变区域。LC/MS是用来分析抗体上糖型的准确分子量及生产过程中产生异质性的主要工具。图3（左图）显示，抗体anti-actin经变性并还原后在5 µg上样量的情况下通过C8-RP Poroshell色谱柱分离所得到重链（~50 kDa）及轻链（~25 kDa）的色谱峰。图3和图4分别显示轻链及重链的质谱图及去卷积后精确分子量质谱图。

轻链质谱图显示该部分均一性相对较高（图3中）。轻链部分的多电荷峰分布十分整齐，去卷积后的谱图只有少数几个主峰。与主峰相差17 Da 的峰是由于发生了抗体中常见的焦谷氨酸转化所造成的（图3

右）。图3. LC/MS 轻链LC/MS 表征。上部分显示色谱分离的轻链及重链经质谱检测后的总离子流图。中部为轻链的一级质谱图。下部为去卷积后得到轻链分子量的质谱图，其精确分子量为24143 Da 。与之偏差17 Da 的峰为发生焦谷氨酸转化所造成。

而因为有糖基化修饰的原因，因此重链的质谱图表现出较轻链更明显的不均一性（图4，上图）。重链谱图有非常复杂的多电荷峰，是因为在297号的天冬酰胺上发生了不同的糖基化修饰。去卷积后的图谱证实几个主峰正是因为抗体上连接了不同分子量的多糖而形成。分子量相差约162或203 Da

表明多糖结构上具有不同的糖。

图4. LC/MS 重链LC/MS 表征。上图显示重链的一级质谱图，该图表现出极高的非均一性。

下图为去卷积后得到重链分子量的质谱图，显示了因不同糖型导致的非均一性。

结论

TripleTOF ® 5600质谱系统为抗体类药物分析提供了完美的解决方案。

高质量的质谱数据结合具有精确去卷积算法的BioAnalyst™软件能为抗体类药物的分子量测定，糖基化修饰比例，Ｎ段封闭研究，焦谷氨酸转化等修饰的表征提供准确的结果。

TripleTOF ® 5600系统的高灵敏度能有效降低样品消耗，即使在上样量非常小的情况下仍能获得高质量的质谱数据。

参考文献

1. R. JeVeris, Glycosylation of recombinant antibodytherapeutics, Biotechnol. Prog. 21 (2005) 11–16.

2. L. Huang, S. Biolsi, K.R. Bales, U. Kuchibhotla, Impact ofvariable domain glycosylation on antibody

clearance: AnLC/MS characterization, Anal. Biochem. 349 (2006) 197–207.

串联质谱技术在生物制药中的应用