动物细胞培养技术实验教程内容
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
动物细胞培养实验2
实验题目：动物细胞培养教师：XXX实验类型：综合学时：26(参考)内容：一、实验目的通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。
初步掌握无菌操作的基本原则，认识无菌操作在细胞培养中的重要性。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外生长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌操作。
三、试剂与器材1.材料出生后2-3天的乳鼠2.试剂平衡盐液－Hank液细胞消化液 0.5%水解乳蛋白-Hank液犊牛血清碳酸氢钠 1万单位/ml青、链霉素 3%谷氨酰胺磷酸盐缓冲液3.实验器材镊子解剖刀剪眼科剪眼科镊纱布块玻璃漏斗量筒记号笔试管试剂瓶三角瓶移液管培养皿培养瓶吸管橡皮头显微镜血细胞计数板计数器酒精灯酒精棉球试管架试管解剖板碘酒棉球口罩二氧化碳培养箱超净工作台灭菌锅倒置显微镜四、实验内容原代培养：取肾→消化分散组织→计数与稀释→分装培养→观察。
传代培养：配置培养液→消化细胞→细胞计数→培养观察。
培养细胞冷冻保存。
五、关键步骤及注意事项1. 注意无菌操作，及时更换培养液。
六、思考题1. 简述细胞传代培养的操作程序注意事项？2. 细胞培养获得成功的关键要素是什么？3. 简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。
动物细胞培养实验方案
动物细胞培养实验方案一、实验目的：1.掌握动物细胞的培养技术；2.了解动物细胞的生长特点和培养条件要求；3.学习观察和分析动物细胞的形态变化和生长状态。
二、实验器材与试剂准备1.器材：细胞培养器皿（如培养皿、蜡烛罩、CO2培养箱等）、离心机、显微镜、细胞计数板、计时器等；2.试剂：细胞培养基、培养液添加剂（如酶、抗生素等）、PBS缓冲液、生长因子、染色剂等。
三、实验步骤1.细胞培养基的配制：按照制定的配方将培养基粉末加入适量的无菌去离子水中，搅拌均匀后，进行高温高压灭菌，冷却后分装至培养器皿中；3.细胞处理和接种：将收集到的组织先用PBS缓冲液洗涤，然后使用细胞裂解酶或胰酶等消化酶消化组织，使细胞分散，处理成单个细胞后，用细胞计数板计数，并将细胞悬液接种到预先准备好的培养器皿中；4.细胞培养条件的控制：将培养器皿置于CO2培养箱中，设定适当的温度（通常为37℃）、湿度和CO2浓度（通常为5%），并保持稳定；5.细胞培养的观察和记录：观察培养皿中细胞的形态变化和生长状态，记录细胞的外观、增殖情况、易于观察的指标等；6.细胞的子培养和冻存：当细胞达到一定密度时，可以进行子培养，即将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中，以促进细胞的增殖和保存细胞生物资料。
此外，也可以将分散的细胞加入由培养液和冻存剂组成的试管中，通过冷冻的方式保存细胞，并用于后续的实验。
四、实验控制与常见问题的解决1.环境控制：细胞培养箱中的温度、湿度和CO2浓度的调整应尽量保持稳定；2.培养基的配制：根据细胞培养物的不同，可以选择不同配方的培养基，确保培养基的质量符合要求；4.洗涤步骤：组织或细胞的洗涤步骤应轻柔，避免对细胞的损伤；5.细胞的接种量：对于粘附性细胞，接种量应适当，以避免细胞过度堆积或过度稀释。
五、实验结果和分析观察培养皿中细胞的生长状态、细胞数量以及形态的变化，记录生长状态、增殖情况和其他可以观察到的指标，并进行数值化分析和统计。
第三章 动物细胞培养基本技术
反应。
• 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，
迫切需要用无血清培养基培养细胞．
无血清培养基
• 研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如
激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 • 由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 • 1975 年，Sato 首次成功地用无血清培养基培养了垂 体细胞株，近 20 多年来已报道了几十种细胞系在无 血清培养基中成功地生长和增殖。
பைடு நூலகம்
培养瓶中继续培养，称为传代培养。
• 原代培养物经首次传代成功即成细胞系，
• 已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细
胞系或无限细胞系
• 细胞系可泛指一般可能传代的细胞。其中不能连续
培养的称为有限细胞系。 • 细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从 原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物 的培养物称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细 胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单
5. 组织培养细胞一代生存期
• 所谓细胞“一代”一词，系指从细胞接种 到分离再培养时的一段时间，这已成为培 养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增 一代非同一含义。如某一细胞系为第153代 细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细 胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞 能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经 过以下三个阶段：
• 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪
• 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
1. 压力蒸汽消毒器
• 湿热消毒，用途广
2. 电热干燥箱
• 干热消毒（160 ℃ ，2 小时）。
• 主要用干玻璃器皿消毒
3. 滤器
• 过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成
实验 动物细胞培养基础实验技术
实验动物细胞培养基础实验技术——器械的清洗与消毒实验目的：学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。
实验用品：1．仪器和用品：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、紫外灯、0.22μm/0.45μm微孔滤膜。
2．试剂：75%酒精、5%HCl、1‰新洁尔灭、重铬酸钾。
实验内容：1．准备培养用血清瓶（PBS、培养基，约10套，包括20、50ml）、培养瓶（50个）、玻璃滴管（若干）、离心管（10ml）、EP管若干、不锈钢滤器、胶塞、滴头等。
2．分别包装上述物品，其中血清瓶和瓶盖分别包装，玻璃吸管置于不锈钢筒中、玻璃离心管、 EP管分别置于饭盒中。
3．将上述物品置于高压灭菌锅中进行消毒灭菌。
4．实验室准备。
实验步骤（一）清洗1．玻璃器皿的清洗浸泡刷洗浸酸冲洗（1）. 新购玻璃血清瓶先用洗衣粉洗，再以0.1-0.05 mol/l HCl 浸泡数小时，然后用铬酸浸泡过夜，最后用自来水、一次与二次去离子水洗净后才能开始使用。
（2）. 用过之玻璃血清瓶，用洗衣粉洗净后铬酸浸泡过夜，最后用自来水、用一次与二次去离子水冲洗干净。
此外，玻璃器皿的瓶子的盖子必须也泡铬酸，培养瓶瓶盖可以不用泡铬酸，高温灭菌的时候要拧上瓶盖，留有一定的缝隙，灭菌后盖紧。
瓶盖的上面应当用锡箔纸或者牛皮纸包住，用绳子扎紧2．塑料器皿的清洗自来水充分浸泡冲洗 2%NaOH浸泡过夜蒸馏水漂洗3次 2%-5%盐酸浸泡30min 自来水冲洗晾干紫外线照射30min3．胶塞等橡胶类的清洗自来水冲洗 2%NaOH 煮沸15min 自来水冲洗蒸馏水煮沸10min 自来水冲洗5次以上2%-5%HCl煮沸15min 晾干晾干后高压灭菌4．金属器械的清洗新购置的器械用过的器械（二）包装分为局部包装和全包装。
为了防止消毒灭菌后再次遭受污染。
按照不同类别进行包装。
（三）消毒灭菌主要包括物理法和化学法。
物理法：热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。
动物细胞培养技术实验
实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。
二. 实验内容1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术；2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术；3.细胞污染检测方法与技术；4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。
三．实验用品1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH试纸、酒精棉球等3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。
四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏1. 缓冲液及培养基配制Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。
4℃下保存。
胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。
MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。
动物细胞培养教案教学设计
动物细胞培养教案教学设计一、教学目标1.让学生了解动物细胞培养的基本原理和步骤。
2.培养学生动手操作能力，提高实验技能。
3.引导学生思考动物细胞培养在实际应用中的意义。
二、教学内容1.动物细胞培养的基本原理2.动物细胞培养的步骤3.动物细胞培养的应用三、教学重点与难点1.教学重点：动物细胞培养的基本原理和步骤。
2.教学难点：动物细胞培养的具体操作方法。
四、教学过程（一）导入1.利用多媒体展示一些与动物细胞培养相关的图片，如细胞培养皿、细胞培养液等。
2.邀请学生分享他们对动物细胞培养的了解。
（二）基本原理1.介绍动物细胞培养的基本原理，包括细胞生长、细胞分裂、细胞代谢等。
2.通过图示和案例，让学生了解细胞培养过程中所需的营养物质、生长因子、氧气等。
（三）操作步骤1.介绍动物细胞培养的操作步骤，包括细胞悬液的制备、细胞接种、细胞培养、细胞观察等。
2.利用视频或现场演示，让学生直观地了解每个步骤的具体操作方法。
（四）实验操作1.将学生分组，每组分配一个实验任务，如细胞悬液的制备、细胞接种等。
2.指导学生按照操作步骤进行实验，并及时解答他们在实验过程中遇到的问题。
（五）应用拓展1.介绍动物细胞培养在实际应用中的意义，如疾病治疗、药物研发等。
2.通过案例分析，让学生了解动物细胞培养在科研和生产中的应用。
（六）课堂小结2.鼓励学生在课后进一步了解动物细胞培养的相关知识。
五、教学反思1.学生对动物细胞培养的基本原理和步骤的理解程度。
2.学生在实验操作中的表现，如动手能力、实验技能等。
3.学生对动物细胞培养在实际应用中的认识和理解。
4.教学过程中存在的问题和不足，如何改进教学方法和手段。
通过本次教学，教师应努力提高学生的实验技能和动手能力，激发他们对生物科学的兴趣，为培养创新型人才奠定基础。
【重难点补充】一、教学重点与难点教学重点：动物细胞培养的基本原理和步骤。
教学难点：动物细胞培养的具体操作方法。
（二）基本原理1.教师讲解：同学们，我们知道细胞是生物体基本的结构和功能单位。
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告实验目的本实验的目的是通过培养和观察动物细胞，了解细胞的结构和功能。
实验材料和设备•动物细胞培养基•细胞培养皿•细胞培养罩•无菌移液器•显微镜•离心机实验步骤步骤一：准备工作1.将工作台、实验室器材和手部清洗消毒，确保无菌环境。
2.准备所需的实验材料和设备。
步骤二：细胞培养基的制备1.将细胞培养基倒入细胞培养皿中，每个培养皿倒入适量的培养基。
2.用无菌移液器将细胞培养基均匀涂布在培养皿内表面。
3.将培养皿放入细胞培养罩中，用透明膜封闭。
步骤三：细胞的收获1.从实验动物体内提取所需的组织样本，保持组织样本的完整性和无菌状态。
2.将组织样本置于离心管中，加入少量的预先准备好的细胞培养基。
3.使用无菌移液器将组织样本与细胞培养基充分混合。
4.将混合液转移到培养皿中，确保液体均匀覆盖培养皿表面。
步骤四：细胞培养1.将培养皿放入孵化器中，设置合适的温度和湿度，提供细胞生长所需的最佳环境条件。
2.定期观察培养皿内细胞的生长情况，记录细胞的数量和形态变化。
步骤五：细胞观察1.从培养皿中取出一小部分细胞，放入显微镜载玻片上。
2.将载玻片放入显微镜下，使用适当的倍率观察细胞的形态特征和细胞器的结构。
3.记录细胞的形态特征、大小和细胞器的分布情况。
实验结果和讨论通过以上步骤，我们成功地进行了动物细胞的培养实验，并观察到了细胞的生长和形态变化。
在显微镜下观察到的细胞形态特征和细胞器的结构，可以帮助我们更好地理解细胞的组成和功能。
细胞培养是生物学研究中常用的技术手段，通过培养和观察细胞，我们可以深入了解细胞的生命活动和疾病发生机制。
在实验过程中，我们需要保持无菌操作，以确保细胞的纯度和生长条件的良好。
细胞培养实验的结果和观察对于生物医学研究和药物开发具有重要意义。
通过改变培养条件和添加适当的药物，我们可以研究细胞的响应和代谢途径，为新药物的筛选和评估提供重要依据。
结论通过本次实验，我们成功地培养和观察了动物细胞。
《动物细胞培养》实验内容
《细胞工程实验技术》（动物细胞培养部分）目录实验一实验器材的清洗、包装和消毒 (2)实验二常用的仪器设备介绍 (3)实验三常用动物细胞培养用液的配制 (4)实验四组织块原代培养、传代培养及生物学检测 (6)实验五心肌细胞的原代培养、传代培养及培养细胞的常规检查 (8)实验一实验器材的清洗、包装和消毒一、实验目的1、掌握细胞培养常用实验器材的清洗要领、清洗步骤和注意事项。
2、掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求。
3、掌握正压滤器的安装、使用和拆除方法及操作注意事项。
二、实验用品以组为单位包装物品1、量筒（100mL、500mL）2、大、小烧杯3个3、1000mL容量瓶×14、移液管1mL×3(灭菌)5、（100mL、250mL、500mL）盐水瓶、（500mL）广口瓶×各4(灭菌)6、眼科剪刀、眼科镊子各2把(灭菌)7、细胞培养瓶×3(灭菌)其它：饭盒、青霉素瓶、牛皮纸、离心管、滴管、注射器、磁棒、绳、标签纸等杂干。
三、实验内容（一）清洗1、要领：浸泡、刷洗、酸泡。
2、步骤：洗衣粉浸泡12h→刷洗→流水震荡冲洗15~20遍→漓水→蒸馏水洗荡2次→37℃烘干→待包装。
3、注意事项：(1)使用后的器材要立即投入水中。
(2)器皿内要充满液体，不得有气泡。
(3)器材要用流水震荡干净。
（二）包装1、大的器材如：量筒、广口瓶、培养皿、吸管等要包装。
2、小的器材如：注射器、剪刀、镊子放入饭盒。
3、注意事项：(1)包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材使用端。
(2)封闭器材使用端，标记器材手持端。
(3)小包装(4)玻璃管道口加棉花。
（三）湿热消毒：高压灭菌锅消毒四、作业1、清洗的要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？2、器材包装有何要求？3、实验二常用的仪器设备介绍一、实验目的了解动物细胞培养中常用仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法二、实验用品1）超净工作台2）自动双重纯水蒸馏器3）高压蒸气灭菌器4）过滤器5）电热恒温干燥箱6）二氧化碳培养箱7）冰箱8）倒置显微镜三、实验内容1、了解超净工作台的工作原理2、自动双重纯水蒸馏器结构、使用注意事项。
动物细胞培养实验报告
一、实验目的1. 掌握动物细胞培养的基本原理和方法。
2. 熟悉动物细胞培养过程中常用的仪器和试剂。
3. 通过动物细胞培养实验，了解细胞生长、增殖、分化的过程。
二、实验原理动物细胞培养是指将动物组织或器官中的细胞取出，在体外模拟体内环境，使其在适当的营养和条件下生长、增殖、分化。
动物细胞培养是生物学、医学、药理学等领域的重要研究手段。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、DMEM培养基、青霉素、链霉素、胰蛋白酶。
2. 仪器：超净工作台、细胞培养箱、移液器、培养皿、显微镜等。
四、实验方法1. 细胞复苏：将冻存的细胞取出，用无菌生理盐水洗涤，加入适量DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中复苏。
2. 细胞传代：将复苏后的细胞用胰蛋白酶消化，加入适量的DMEM培养基终止消化，用移液器吹打细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
3. 细胞观察：在显微镜下观察细胞的生长状态，记录细胞生长、增殖、分化的过程。
4. 细胞传代：待细胞铺满培养皿底部时，用胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液。
将单细胞悬液接种于新的培养皿中，重复上述步骤。
五、实验结果1. 细胞复苏：复苏后的细胞在显微镜下观察到细胞呈圆形，细胞质清晰，细胞核明显。
2. 细胞生长：细胞接种后，在培养箱中培养，细胞逐渐铺满培养皿底部。
细胞生长过程中，细胞体积逐渐增大，细胞核逐渐增多。
3. 细胞增殖：细胞生长过程中，细胞数量逐渐增多，细胞铺满培养皿底部的时间逐渐缩短。
4. 细胞分化：在培养过程中，部分细胞发生分化，形成不同形态的细胞。
如神经细胞、肌肉细胞等。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中，温度、CO2浓度、培养基成分等条件对细胞生长、增殖、分化具有重要影响。
实验中应严格控制这些条件，以确保细胞正常生长。
2. 细胞传代过程中，应注意防止污染。
操作应在超净工作台中进行，使用无菌器材，避免细菌、真菌等微生物污染。
3. 细胞培养实验过程中，应定期观察细胞生长状态，及时调整实验条件，以保证细胞正常生长。
动物细胞培养技术小鼠脾脏细胞
姓名：XX 系年级：2013级XX班学号：201300XXXXXXX实验题目:动物细胞培养同组者: XXXXX动物细胞培养技术【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数，计算细胞存活率；【实验原理】（一）. 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是指从动物体内取出组织或细胞，在体外模拟动物体内的生理坏境，在无菌，适当温度和一定的营养条件下，使之生存，生长和繁殖，并维持其结构和功能的方法。
细胞培养的意义:⑴.具有其他生物技术无可比拟的优点；⑵.培养条件易改变和控制，便于单因子分析；⑶.便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；⑷.在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用细胞培养的局限性：（1）.在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；(2).观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；(3).细胞培养得到的产物少。
培养细胞的生存条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
细胞培养的方法：1. 原代培养：直接从生物体内获取细胞，组织或器官，进行体外培养直至第一次传代为止。
2. 传代培养：当培养的细胞增殖达到一定密度之后，则需要再做培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比例转移到另一个容器中的扩大培养。
原代细胞培养的方法有：单层细胞培养法和组织块培养法细胞传代培养包括：贴附生长细胞的传代：洗细胞——酶消化——接种——观察悬浮生长细胞的传代：A.直接传代 B.离心传代单层培养细胞的生长过程分为：游离期，吸附期，繁殖期，维持期，衰退期培养细胞的形态分型：A. 贴附型 B.悬浮型（二）. 细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
动物细胞培养实验讲义
———————动物细胞培养 实验讲义——————— 实验一动物细胞培养的培养基配制灭菌与仪器操作培训一、实验目的1、掌握动物细胞培养相关设备、器材的使用方法。
2、掌握各类器皿、工具的清洗、包装、灭菌方法3、掌握各类培养基及试剂溶液的配制、灭菌方法二、实验原理离体条件下的细胞对任何有害物质均十分敏感，极少的残留物都可能对细胞产生毒副作用，因此，新的或重新使用的器皿都必须认真清洗，以达到不含任何残留物的要求。
而玻璃、橡胶、塑料、布类、纸类等不同类型的材料应采用不同的清洗和消毒、灭菌方法。
细胞培养失败的一个常见原因是微生物污染，有时是操作过中不规范造成的，有时则是相关用品本身有污染造成的，因此在培养细胞前各种用品均需要进行严格消毒或灭菌。
培养液是进行细胞体外培养最基本、最主要的条件之一，掌握常见培养液的成分、性质与配制方法是细胞培养操作者应具有的基本知识和能力。
三、实验内容1、设备（1）CO2培养箱CO2培养箱要提前消毒，有些自己带有高温干热灭菌功能，大部分则宜用“纯水擦洗――95%酒精擦洗——紫外照射杀菌”的消毒方法。
初次开启仪器时要提前一天矫正CO2的浓度值。
然后设定好温度等参数。
关于钢瓶的压力阀门控制：钢瓶上的阀门松紧程度不是十分重要，关键靠供气阀门控制压力在0.1（越拧紧压力越高，所以可先把供气阀门打到松弛状态，然后再开钢瓶阀门）（2）倒置显微镜打开电源开关，确保光路杆调至“观察”状态，选择所需放大倍数的物镜，调节至适当亮度。
将培养瓶放在载物台上，转动粗微调调节。
如需拍照，则在电脑中打开软件，并将光路杆调至“拍照”状态。
注意不要随便误打开荧光灯，以免浪费其寿命。
一旦打开荧光光源后，至少要15分钟后才能关闭，关闭后至少要5分钟才能再次开启。
（3）其他：高压蒸汽灭菌锅、电热鼓风干燥箱等。
2、器具（1）玻璃类细胞培养瓶（有的是塑料的）、吸管、三角烧瓶、玻璃平皿、普通玻璃瓶方法：玻璃类一般是清水浸泡、洗衣粉液刷洗、浸酸过夜、自来水冲洗、然后依次用去离子水、一蒸水、三蒸水分别润洗5～6次。
09动物细胞培养实验
实验一清洗与灭菌（4学时）一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒, 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作, 了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步, 是组织培养中工作量最大, 也是最基本的步骤。
体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。
细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。
清洗后的玻璃器皿, 不仅要求干净透明, 无油迹, 而且不能残留任何物质。
如有毒的化学物质, 哪怕残留0. 1个, 也可能影响细胞生长。
灭菌手段的选择十分重要, 对不同的物品需采用不同的灭菌方法。
假如选用的方法不对, 即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。
以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品1. 材料: 无臭氧型紫外灯, 微孔滤膜(直径25): 孔径为0. 22μm, 微孔滤膜(直径90): 孔径为0. 22 μm, 过滤器(直径25)。
2．药品：70％或75％酒精, 0．1％新洁尔灭, 煤酚皂溶液(来苏儿水), 0．5％过氧乙酸, 乳酸, 37％甲醛, 高锰酸钾, NaOH, 盐酸, 重铬酸钾, 浓硫酸(工业)。
3．仪器：超净台, 干燥箱, 高压蒸气灭菌锅, 过滤器, 过滤泵。
四、实验步骤(一)清洗1. 新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗, 再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2. 使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水, 避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿, 自来水清洗数遍, 倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10. 15次去除残余酸液, 蒸馏水涮洗3次, 倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3. 胶塞的处理(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0. 2％NaOH煮沸lO-20 min。
第四章 动物细胞培养的基本技术和方法
境
二、细胞传代方法
1.贴壁细胞的消化法传代：
（1）吸弃或者倒掉瓶内陈旧的培养液
（2）于培养瓶内加入适量消化液 （3）消化2-5min，在显微镜下观察细胞状态，发现细胞质回缩，细胞间隙 增大后，应即刻停止消化 （4）吸除或者倒掉消化液 （5）吸管吸取新鲜培养液，按照顺序吹打瓶壁细胞，注意动作要轻柔 （6）计数后，按要求的接种量接种在新的培养基内
结果分析：
（1）作图法 （2）公式法
三、细胞培养的污染检测及排除
培养细胞的污染包括：微生物、化学物质、细胞交叉
1.微生物污染
污染途径：空气、器材、操作、血清、组织样本 污染对细胞的影响：抑制细胞生长，产生有毒物质，促使细胞死亡 微生物污染的检测与排除： （1）真菌污染 培养液中有白色或者浅黄色的漂浮物，细胞间有丝状菌丝体，可以采用霉菌素或者酮康唑对细 胞进行处理 （2）细菌污染 培养液短期颜色变黄、变浑浊，使用5-10倍抗生素剂量冲击法 （3）支原体感染 相差显微镜检测；荧光染色法；电镜检查；DNA分子杂交检查
2.悬浮细胞的传代方法：
（1）直接传代法 （2）离心传代法
三、细胞系的维持
细胞系的维持是通过换液、传代、再换液、再传代和细胞冻存实现的 注意事项： （1）做好细胞系的档案记录工作
（2）遵从细胞生长规律
（3）防止细胞间的交叉污冻存、复苏和运输技术
一、细胞的冻存
第四节 动物细胞传代培养技术
一、原代培养的首次传代
传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程 首次传代注意事项： （1）待细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面后再传代 （2）传代时候不同细胞需要消化的时间不同，要根据需要具体观察，
及时进行处理
（3）首次传代时，细胞接数量要多一些，促使细胞尽快适应生长环
动物细胞培养技术实验教程内容
实验1 细胞培养概述（一）细胞培养室的设置和无菌操作【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。
一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。
三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。
【实验目的】①了解培养室的设置和设备。
②学习无菌概念和无菌操作要领。
【操作步骤】1．实验室设置（1）配液室（2）准备室（3）培养室培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点：①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。
②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，③门一般用拉门，以防止空气流动。
④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。
2．实验室常用设备（1）准备室的设备①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。
②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。
③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。
④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。
不同物品其有效灭菌压力和时间不同。
⑤储品柜1：放置未消毒物品。
⑥储品柜2：放置已消毒物品。
准备室注意事项：①预防蒸馏器被烤干。
②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。
④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。
（2）配液室的设备①天平（扭力天平和电子天平）：称量用②pH计。
③磁力搅拌器。
（3）细胞培养室的设备①超净工作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。
根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。
《动物细胞培养》实验内容(1).doc
《细胞工程实验技术》（动物细胞培养部分）目录实验一实验器材的清洗、包装和消毒 (2)实验二常用的仪器设备介绍 (3)实验三常用动物细胞培养用液的配制 (4)实验四组织块原代培养、传代培养及生物学检测 (6)实验五心肌细胞的原代培养、传代培养及培养细胞的常规检查 (8)实验一实验器材的清洗、包装和消毒一、实验目的1、掌握细胞培养常用实验器材的清洗要领、清洗步骤和注意事项。
2、掌握细胞培养常用器材的包装要领和要求。
3、掌握正压滤器的安装、使用和拆除方法及操作注意事项。
二、实验用品以组为单位包装物品1、量筒（100mL、500mL）2、大、小烧杯3个3、1000mL容量瓶×14、移液管1mL×3(灭菌)5、（100mL、250mL、500mL）盐水瓶、（500mL）广口瓶×各4(灭菌)6、眼科剪刀、眼科镊子各2把(灭菌)7、细胞培养瓶×3(灭菌)其它：饭盒、青霉素瓶、牛皮纸、离心管、滴管、注射器、磁棒、绳、标签纸等杂干。
三、实验内容（一）清洗1、要领：浸泡、刷洗、酸泡。
2、步骤：洗衣粉浸泡12h→刷洗→流水震荡冲洗15~20遍→漓水→蒸馏水洗荡2次→37℃烘干→待包装。
3、注意事项：(1)使用后的器材要立即投入水中。
(2)器皿内要充满液体，不得有气泡。
(3)器材要用流水震荡干净。
（二）包装1、大的器材如：量筒、广口瓶、培养皿、吸管等要包装。
2、小的器材如：注射器、剪刀、镊子放入饭盒。
3、注意事项：(1)包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材使用端。
(2)封闭器材使用端，标记器材手持端。
(3)小包装(4)玻璃管道口加棉花。
（三）湿热消毒：高压灭菌锅消毒四、作业1、清洗的要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？2、器材包装有何要求？3、实验二常用的仪器设备介绍一、实验目的了解动物细胞培养中常用仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法二、实验用品1）超净工作台2）自动双重纯水蒸馏器3）高压蒸气灭菌器4）过滤器5）电热恒温干燥箱6）二氧化碳培养箱7）冰箱8）倒置显微镜三、实验内容1、了解超净工作台的工作原理2、自动双重纯水蒸馏器结构、使用注意事项。
动物细胞培养实验设计
动物细胞培养实验设计1.实验目的本实验旨在研究动物细胞在体外培养条件下的生长情况，并探究培养基、培养温度和培养时间对细胞增殖和存活率的影响。
2.实验材料-细胞培养物（如人体肺癌细胞株A549）-培养基（如DMEM）-胎牛血清（FBS）-无菌PBS缓冲液-1%无菌青霉素/链霉素混合液-0.25%胰酶/EDTA溶液-无菌培养皿-离心管-显微镜-倒置显微镜-培养箱3.实验步骤3.1细胞传代-使用0.25%胰酶/EDTA溶液处理细胞培养物，使其分离成单个细胞。
-计算损失率和细胞数，根据所需的细胞数目进行传代。
3.2细胞计数-取适量的细胞悬液，并使用显微镜在计数室或倒置显微镜下进行细胞计数。
确保计数的精度和准确性。
3.3细胞培养基配制-使用DMEM培养基作为培养基，添加适量的胎牛血清（一般为10%）和1%无菌青霉素/链霉素混合液，制成DMEM完全培养基。
-为对照组，不添加药物或其他试剂。
3.4细胞处理-将细胞悬液均匀分配到不同的无菌培养皿中。
-添加适量的DMEM完全培养基，使细胞完全覆盖。
-将培养皿置于培养箱中，设置适当的培养温度（一般为37°C）。
3.5细胞观察和评价-在不同的培养时间点（如24小时、48小时和72小时），取出培养皿中的细胞悬液。
-使用显微镜观察细胞形态，评估细胞生长和形态变化。
3.6细胞增殖分析-使用显微镜或自动细胞计数器计算细胞数目。
-根据细胞数目的变化，计算细胞增殖速率和倍增时间。
3.7细胞存活率分析-使用PBS缓冲液将细胞悬液洗涤一次，去除培养基。
- 使用0.4%尝试性胺蓝（Trypan Blue）染色液染色，染色时间不超过3分钟。
-使用显微镜观察和计数染色细胞和非染色细胞的数目，计算细胞存活率。
4.数据分析根据实验结果，绘制细胞增殖曲线图和细胞存活率曲线图。
使用适当的统计方法分析数据，比较不同培养条件下的细胞增殖和存活率差异。
5.结论根据实验结果，得出不同培养条件对细胞增殖和存活率的影响结论。
动物细胞培养技术
动物细胞培养技术[适用对象] 环境科学专业[实验学时] 4学时一、实验目的掌握小白鼠细胞的培养技术，掌握显微镜直接计数法统计已知体积的培养基中的细胞数目。
二、预习与参考参考实验指导书，结合实验特色查阅相关文献资料进行实验设计。
三、实验内容1.取5个月龄的小白鼠一只，以最快的速度把小白鼠处死，处死之后应尽快对组织进行提取。
2.将小白鼠细胞放入培养基中培养，然后放入恒温培养箱培养。
3.拿出培养皿使用直接计数法统计已知体积的培养基中的细胞数目。
四、主要设备功能和材料清单恒温培养箱。
培养皿。
小白鼠。
五、实验要求正确使用显微镜，掌握培养计数法统计细胞数目。
六、实验报告要求1、根据实验要求，在实验时间内到实验室进行实验时，一边测量，一边记录实验数据。
报告要求准确、美观。
2、在实验中，如果发生实验测量数据与事先的计算数值不符，甚至相差过大，此时应该找出原因，不能不了了之。
同时要把通过实验所测量的数据与计算值加以比较，如果误差一般5％以下。
3、在报告的最后要完成指导书上要求解答的思考题。
七、思考题1.比较平板计数法与显微镜计数法的不同？2.培养基在培养箱中培养需要注意哪些事项？八、实验成绩评定办法本门实验课程考核成绩占课程总成绩的30％，考核分实验预习、实验过程操作、实验报告和实验技能等四个方面，其成绩计算为预习实验（包括资料搜集）占10%、实验过程操作（包括实验流程、调试过程）占25％、实验报告（包括原理描述、数据记录、实验结果和效果）占25％、实验技能考核（包括解决问题的能力）或考试占40％。
凡考核不及格者，应参加补考或重修。
动物细胞工程实验
《动物细胞工程》综合设计实验一、实验目的1 了解动物细胞培养基本设备、器材、实验室设计及实验规则。
2 掌握动物细胞培养常用液体配制方法。
3 掌握细胞传代技术。
4 学习动物细胞形态观察及活性测得方法。
二、实验内容（见下具体实验）三实验报告：1完成细胞培养常用培养液配制2 完成细胞传代操作，并写出细胞传代步骤和注意事项。
3用柱状图表示MTT法测定黄花蒿植物浸出液对细胞的IC50 。
4 计数活细胞百分率。
实验1 动物细胞培养液的配制（参考细胞工程试验教程P 100）需要配制的动物细胞培养液包括：一、无血清培养基的配制二、D-hanks细胞平衡液的配制三、细胞消化液的配制四、双抗溶液的配制无血清培养基的配制（各组配制100ml）无血清培养基(RPMI-1640): 是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。
大量组分：按照以上配方，称取所需量加入1000ml去离子水即可。
20种氨基酸混合溶液：已配备用，取量为1ml加入1000培养液即可。
维生素溶液：已配制成母液，各种微生物母液取量1ml加入1000培养液即可。
D-Hanks 细胞平衡液的配制（每组配制100ml）D-Hanks 溶液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液。
主要用于配制配制培养液，稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞，组织培养液。
NaCl 160gMgSO4·7H2O 2gKCl 8gMg Cl2·6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水细胞消化液的配制（各组配制10ml）0.25%胰蛋白酶细胞消化液：称量胰蛋白酶0.25g和EDTA-Na 0.02g 溶于100ml的D-Hanks 溶液，磁力搅拌溶解后，0.22um细菌过滤器过滤除菌。
-20℃保存备用。
双抗溶液配制（已配，备用）（1）氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
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实验1 细胞培养概述（一）细胞培养室的设置和无菌操作【实验原理】细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。
一般标准的细胞培养室应包括配液室、准备室和培养室。
三室既相互连接又相对独立，各自完成培养过程中的不同操作。
【实验目的】①了解培养室的设置和设备。
②学习无菌概念和无菌操作要领。
【操作步骤】1．实验室设置（1）配液室（2）准备室（3）培养室培养室内要完全密闭，保持恒定的温度，在设计上要注意以下几点：①培养室的位置最好设在阴面，阳光不能直接照射的地方，防止室内温度增高。
②天花板的高度不要超过2米，以保证紫外灯的有效杀菌效应，③门一般用拉门，以防止空气流动。
④天花板、地板和四周墙壁要光滑无死角，要镶瓷砖或涂油漆，这样设计，一是便于清洗和消毒，另外也不易在墙角堆积灰尘。
2．实验室常用设备（1）准备室的设备①双蒸馏水蒸馏器：制备双蒸水。
②酸缸：盛洗液，浸泡玻璃器具。
③干燥箱：洗涤完的玻璃器皿用干燥箱烘干。
④高压锅：玻璃器皿、解剖用具、部分液体、塑料器具等灭菌。
不同物品其有效灭菌压力和时间不同。
⑤储品柜1：放置未消毒物品。
⑥储品柜2：放置已消毒物品。
准备室注意事项：①预防蒸馏器被烤干。
②勿将酸液溅到衣物或地面。
③勿将高压锅排气阀和安全阀堵塞。
④已消毒物品应与未消毒物品分柜存放。
（2）配液室的设备①天平（扭力天平和电子天平）：称量用②pH计。
③磁力搅拌器。
（3）细胞培养室的设备①超净工作台：超净工作台的种类很多，有单面单人、单面双人、双面双人或双面四人等，其工作原理是利用鼓风机，使通过高效滤气的空气，徐徐通过台面，这样使工作环境中具无菌而均匀的空气。
根据层流方式的不同，超净工作台主要分为水平层流式和垂直层流式两种，基本原理大致相同，都是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器，由此送出的洁净气流从一定的均匀的断面风速通过无菌，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。
但两种净化台的气流方向不同。
使用超净工作台应注意的几点问题：A．净化工作台最好安装在无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内，以免尘土过多易使滤器阻塞，降低净化效果，缩短使用寿命。
B．新安装的或长期未使用的工用台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。
C．每次使用工作台时，应先用75%酒精擦洗台面，并提前以30~50min紫外线灭菌灯处理净化工作区内积累的微生物。
在关闭紫外灯后应启动送风机使之运转两分钟后再进行培养操作。
D．净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰。
E．一般情况下，高效过滤器三年更换一次。
更换高效滤器应请专业人员操作，以保持密封良好。
要定期将粗过滤器中的过布（无纺布）拆下清洗，时间应根据环境洁净程度而定，通常间隔3~6个月进行一次。
F．每次使用净化台要及时清除工作台面上的物品，并用洒精擦洗台面使之始终保持洁净。
②4℃冰箱和低温冰箱：③CO2培养箱：A．一定浓度的CO2对细胞生长，尤其是原代培养和单细胞培养有促进作用（5%）。
B．一定浓度的CO2可维持培养液恒定的pH。
适用于开放培养，培养箱封口后，可在一般恒温培养箱内培养，但是采用培养皿或多孔板培养时，则需要高湿度和高CO2含量的空气。
C．它增加了湿度，箱体内装有水浴，可以保证培养箱内的湿度。
D．培养箱内装有紫外灯。
E．通过气体流量计可以调节CO2和空气的比例。
F．在水中可加入防腐剂（二氧乙酸）。
可防止因CO2培养箱中湿度较高，易长霉菌。
④离心机：⑤CO2钢瓶：⑥液氮罐：⑦储品柜：用来存放杂物⑧紫外灯：⑨空气净化系统⑩倒置显微镜3．无菌操作（1）无菌室的灭菌：①紫外灯无人时就要打开；②进无菌室要穿无菌服、戴帽子和口罩；③每周清洗消毒一次；④所用物品要以外科手术方式严格消毒；⑤室内台面要要保持洁净，做完实验后，用75％酒精或千分之三新洁尔灭棉球擦拭超净工作台的台内、边台的台面、倒置显微镜的载物台等；⑥所用物品要一次性准备好；⑦瓶口要用酒精火焰消毒；⑧尽量减少出入。
（2）实验人员的无菌准备：①肥皂洗手②穿好隔离衣③酒精棉球擦手【实验报告】画出一个标准细胞培养室的草图，标明各室的必须设备。
【思考题】1．观看演示填写出无菌操作的要领。
2．在无菌室工作时应注意的事项是什么？3．实验过程中如何才能在头脑中形成良好的无菌概念？（二）器械的清洗与消毒【实验原理】在组织培养过程中，离体细胞对任何毒性物质都十分敏感。
毒性物质包括解体的微生物及细胞残余物以及非营养的化学物质，因此对新采用和重新使用的培养皿等培养用品都要严格清洗和消毒。
【实验目的】学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。
【仪器、材料及试剂】1．仪器：超净工作台，干燥箱，高压锅，过滤器。
2．材料：0.22μm微孔滤膜。
3．试剂：75%酒精，0.1%新洁尔灭，高锰酸钾，重铬酸钾，浓硫酸。
【操作步骤】1．清洗（1）玻璃器皿的清洗步骤：按浸泡→刷洗→浸酸→冲洗等四步程序进行。
①浸泡：新购进的玻璃器皿常带有灰尘，呈弱碱性，或带有铅、碑等有害物质，故先用自来水浸泡过夜、水洗，然后再用2%~5%盐酸浸泡过夜或煮沸30min，水洗。
要领：培养用后的玻璃器皿要立即泡入清水中，使下道刷洗工作能顺利进行。
用后的玻璃器皿常带有大量的蛋白质附着，干涸后不易刷洗掉，用后要立即用清水浸泡。
②刷洗：用软毛刷、优质洗涤剂，刷去器皿上的杂质，冲洗晾干。
要领：浸泡后的玻璃器皿用毛刷沾洗涤剂去器皿上的杂质、刷洗次太多，会损害器皿的表面光洁度，洗涤剂有使pH上升的趋势，所以易选用软毛刷和优质洗涤剂。
禁止用去污粉。
因其中含有砂粒。
会严重破坏玻璃器皿的光洁度。
特别注意刷洗瓶角部位。
酸浸之前要把洗涤剂冲干净。
③浸酸：将器皿浸泡于清洁液24h，如急用也不得少于4h。
清洁液由重铬酸钾、浓硫酸及蒸馏水配制而成，具有很强的氧化作用，去污能力很强。
经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的末刷洗掉的微量杂质可被完全清除。
④冲洗：先用自来水充分冲洗，吸管等冲流10min，瓶皿需每瓶灌满、倒掉，反复10次以上。
然后再经蒸馏水漂洗3次,不留死角。
晾干或烘干备用。
对已用过的器皿，凡污染者必先经煮沸30min或放3%盐酸中浸泡过夜，未污染者可不需灭菌处理，但仍要刷洗、清洁液浸酸过夜，冲洗等。
【附】清洁液的配制和使用注意事项1.清洁液(配方见表2-1)配方成分弱酸次强液强液重铬酸钾（g）清水（ml）浓硫酸（ml）硫酸浓度（v/v）501000908%100100016014%6020080080%①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。
②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。
③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险(绝不可将重错酸饵液倒入浓硫酸中)。
④清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。
由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。
2．矽酸钠洗液贮存液(×100)砂酸纳80克加偏磷酸钠9克加热溶在1000ml水中。
使用时用水稀释100倍，将器皿放入煮沸20min，冷却后冲洗，再用2%HCl浸泡2h后，自来水冲洗。
矽酸钠洗液较清洁液安全，但价格较贵。
（2）塑料器皿清洗自来水充分浸泡→冲洗→2%NaOH浸泡过夜→自来水冲洗→2%~5%盐酸浸泡30min→自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次→晾干→紫外线照射30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min)。
凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa(121.3℃)高压灭菌。
（3）胶塞等橡胶类处理新购置者先经自来水冲洗→2%NaOH煮沸15min→自来水冲洗→2%~5%HCl煮沸15min→自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→蒸馏水煮沸10min，倒掉沸水让余热烘干瓶塞等。
或蒸馏水冲洗晾干，整齐摆放于小型金属盒内经101.3kPa高压灭菌。
（4）金属器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。
用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。
使用前以蒸馏水煮沸10min，或包装好以101.3kPa 高压15min。
（5）除菌滤器的处理用过的滤器将滤膜去除，用三蒸水充分洗净残余液体，置干燥箱中烘干备用。
2．包装包装的目的是防止消毒灭菌后再次遭受污染，所以经清洗烤干或晾干的器材，应严格包装后再行消毒灭菌处理。
包装材料常用包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、玻璃或金属制吸管筒、纸绳等。
包装分为局部包装和全包装两类，前者用于较大瓶皿，一般用硫酸纸和牛皮纸将瓶口包扎好；后者适于较小培养瓶皿、吸管、注射器、金属器械和胶塞等，以下为常用瓶皿、吸管、无菌衣帽等的包装方法，其它物品可参照处理。
①瓶类：硫酸纸罩以瓶口,外罩二层牛皮纸用绳扎紧。
②小瓶皿、胶塞、刀剪等器械可装人饭盒，饭盒再以牛皮纸包好，绳扎好。
③吸管、滴管口用脱脂棉塞上(不要太紧或太松)装人消毒筒内，滤器、滤瓶、橡皮管等都要用牛皮纸包好瓶口等，外罩一层牛皮纸包好，再用包布包好。
④无菌衣、帽、口罩，均以牛皮纸或包布包好，绳扎好。
3．消毒灭菌严格的消毒灭菌对保证细胞培养的成功是极为重要的，其方法分为物理法和化学法两类。
前者包括干热、湿热、滤过、紫外线及射线等，后者主要指使用化学消毒剂等。
①热灭菌：玻璃器皿，160~170℃，90~120min或180℃45~60min。
②蒸气灭菌：用于玻璃器皿、滤器橡胶塞、解剖用具、耐热塑料器具、受热不变性的溶液等，不同物品其有效灭菌压力和时间不同，如培养用液、橡胶制品、塑料器皿等用68kPa(115℃)高压灭菌10min；布类、玻璃制品、金属器械等用103kPa(121.3℃)高压灭菌15~20min。
③滤过除菌：适于含有不耐热成分的培养基和试剂的除菌，用孔径为0.22μm微孔滤膜可除去细菌和霉菌等，用此滤膜过滤两次，可使支原体达到某种程度的去除，但不能除去病毒。
④紫外线：紫外线的波长为200~300nm，最强是在254 nm，6~15平方米最少一只紫外灯，高度要在2.5m 以下，湿度45%~60%，杆菌效果好，球菌次之，霉菌、酵母菌最差，实验前应不低于30分钟的照射时间。
⑤熏蒸消毒：当遇有细胞培养出现多次污染，或实验室两个月一次的常规消毒，均可用高锰酸钾5~7.5g，加甲醛（40%）10~15ml，混合放入一开放容器内，立即可见白色甲醛烟雾，消毒房间需封闭24h，至少4h 以上。
⑥煮沸消毒：紧密情况时使用，金属器械和胶蹇在水中煮20~30分钟，趁热倾去水分即可使用。
⑦化学消毒：化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制进行消毒灭菌的方法。
实验室桌面、用具及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒杀菌。