医疗器械的无菌和初始污染菌检验
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3生物负载测定方法A.1概要A.1.1生物负载测定，可使用不同的方法内容。
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程产品初始污染菌1、目的检测清洗包装后的产品初始污染菌是否符合要求2、适用范围适用于需灭菌产品清洗、包装后的检验3、检验依据EN1174-1996医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估GB14233。
2-1993医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:生物试验方法GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准GB7918。
2-1987化妆品微生物标准检测方法:细菌总数测定4、仪器、设备细菌培养箱、洁净工作台、电子天平、PH计、压力蒸汽灭菌器、4。
C冰箱。
酒精灯、3000ml的三角烧瓶，无菌棉签，无菌镊子，试管架，9mm细菌养皿，放大镜。
5、检验方法5(1普通肉汤琼脂培养基的制备5(1(1所用试剂胨10g氯化钠5g琼脂15-20g肉浸液1000ml5(1(2制备取牛肉浸膏3 g加水1000 ml，配成肉浸液。
将胨、氯化钠、琼脂加入肉浸液中，加热溶解，调节PH为7。
2，置入压力蒸汽灭菌器内，灭菌后于超净工作台内装在9 mm的细菌培养皿中(15-20ml/每个平皿)，于4。
C保存备用。
5(2抽样从每个清洗批次的产品中随机抽样。
同一批次产品数<50件，抽取3件;同一批次产品数为50~100件，抽取5件;同一批次产品数>100件，抽取10件。
5(3取样于微生物实验室超净工作台内，将浸有无菌生理盐水的无菌棉签在检品的外表面依次擦拭，然后用无菌镊子将棉签上的棉球取下，放入含有1ml无菌生理盐水试管内振摇数次，静止5分钟，即获得擦拭棉球浸提液;以同样的方法擦拭检品内表面。
获取检品内表面擦拭棉球浸提液。
5(4接种将上述检品内、外表面擦拭棉球浸提液倒入普通肉汤琼脂平板，水平旋摇使之均匀布在培养皿表面，在超净止放置至培养皿表面浸液十后进入下一步操作。
5(5培养接种后的培养皿倒置于细菌培养箱中，以未接种肉汤琼脂培养基为阴性对照，以金黄色葡萄球菌(北京生物制品检定所)作阳对照，37。
C培养48暗时后观察结果。
ISO13485体系初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程1.目的：制订初始污染菌检验规程，对从事检测的操作人员进行培训指导按检测规程操作。
2.范围：本方法适用于一次性使用无菌医疗器械灭菌前染菌量的检测。
3.术语和定义：无4.职责：质量部负责实施。
5.内容：5.1仪器电子天平、电热恒温干燥箱、净化工作台、压力蒸汽灭菌器、电热恒温水浴锅、恒温培养箱、电炉。
5.2器具烧杯、量筒、三角瓶(带硅胶塞)、试管(带硅胶塞)、酒精灯、手术剪刀、培养皿、刻度吸管、薄膜过滤器5.3 培养基、试剂：胰酪大豆胨琼脂培养基、无菌生理盐水5.4 试验前的准备5.4.1胰酪大豆胨琼脂培养基的制备：按产品说明书进行配制、灭菌，供细菌培养记数用。
5.4.2 无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）的制备：a．配制：称取9.0g氯化钠加入蒸馏水溶解使成1000ml。
b. 分装：分装于试管中，装量不得超过试管容量的2/3，盖上硅胶塞，包好。
c．灭菌：121℃20分钟高压灭菌。
5.5 取样方式a）灭菌前随机抽取样品；b）抽取不适于销售的产品，如废料或不合格品（即已经过各关键工序的生产过程阶段（包括清洗和包装过程）的产品）；c）初包装材料可用无菌手续取样随即取10套/件（卷料无菌手续取100cm2）。
注:以上方式可根据产品具体情况择其一操作；5.6 取样频率当月生产各产品至少抽取一批次；每批来料初包装材料最少抽取一次。
5.7 试验步骤5.7.1 消毒：将待检的产品外包装用酒精棉擦拭后，放于经擦拭的垂直式超净工作台面，紫外灯照射0.5小时以上。
5.7.2 供试液的制备：按无菌操作法制备供试液，制备后应在2小时内进行检测；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
5.7.3用无菌注射器吸取10～100ml无菌生理盐水，注入样品管内往返振荡5次；外部用无菌注射器吸取10～100ml无菌生理盐水冲洗管壁；内外壁如此各重复二到三次。
分别将供试液注入无菌容器中，分别检测。
5.7.4 以上制备的供试液直接或稀释后采用薄膜过滤法、平板计数（平皿法）或其他适宜方法进行分析检查。
(019)初始污染菌检验规程
1、目的通过检验产品的初始污染菌，了解产品在生产过程中受微生物的情况，以便更好地提高产品质量。
2、范围本方法适用于本公司生产的一次性使用静脉输液针（简称：输液针）、一次性使用无菌配药注射器带针（简称：配药注射器）、一次性使用无菌注射器带针（简称：注射器）、一次性使用输液器带针（简称：输液器）、一次性使用袋式输液器带针（简称：袋式输液器）及其配件、无菌产品初始包装等的初始污染菌的检验。
3、依据GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准中华人民共和国药典2010版第二部GB 8368 一次性使用输液器GB/T 19973.1-2005 （ISO 11737-1:1995）医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分:产品上微生物总数的估计GB 15980 一次性使用医疗用品卫生标准4、要求灭菌产品管道类内腔污染菌数：应≤10cfu/件次，外部应≤100cfu/件次；非管道类应≤100cfu/件次；敷料类应≤100cfu/g；消毒产品应≤1000cfu/件次或重量（g），具体见表1。
5 检验方法5.1卵磷脂、吐温80－营养琼脂培养基的配制：成份：蛋白胨 20 g牛肉膏药 3 g氯化钠 5 g琼脂 15 g卵磷脂肪 1 g吐温80 7 g蒸馏水 1000 g制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。
加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为7.1～7.4加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
5.2 样品采样数量：各类产品每批随机抽取10件样品。
5.3 供试液制备5.3.1.供试品是敷料、可以破坏性类可用无菌手续称取10g,放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。
作为1：10的供试液。
5.3.2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。
作为1：10的供试液。
5.3.3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为100cm2，加入灭菌生理盐水100ml。
初始污染菌检验规程
A.3.1接触板
A.3.1.1接触板或玻璃片可用于将凝固的培养基放在样品表面上，使存活微生物能附着在培养基表面，然后再培养接触板或玻璃片，至形成可以计数的菌落。
A.3.1.2该系统的优点在于易于使用，结果与凝固的培养基的接触表面直接相关。
A.3.1.3表面上天然集聚的细胞群、菌落在琼脂介面散布、琼脂干燥、可能存在的厌氧菌等都是潜在的不利因素。
A.2.1.6有些处理方法可能会分解待测产品(例如碎解、袋蠕动和涡旋)。分解的材料会给微生物计数造成困难，这时则需要进行其他处理，如将分解的材料从洗提液中分离出来。应注意保证所得到的计数具有代表性。
A.2.1.7应尽力尽快将试验样品移至试验室。如果必须要推迟转送，试验样品的保存条件应能避免微生物的丢失或改变。应规定贮存的最长时间。干燥可能是微生物数量减少的重要原因，所以在选择贮存条件和贮存时间时应加以考虑
A.4.2.2通常需要一真空或正压(有些情况下)源。应注意避免负压过大，这会引起滤膜变形或损坏。
A.4.2.3进行培养时，滤膜可以放在琼脂表面或放在浸泡了营养媒介的吸水纱布垫上。滤膜表面上形成的菌落可以计数，也可从滤器上分离出来进行定性。A.4.2.4膜过滤尤其适用于微生物浓度较低的悬液。
A.4.2.5从洗提液中取出微生物时，当怀疑液体基质中含有杀灭或抑制微生物时，膜过滤特别适用，先将洗提液中的微生物过滤出来，并可在培养前对滤膜上的微生物进行冲洗。但是有些类型的膜滤器可以吸收或释放抑制微生物生长的物质，所以只使用那些适于给微生物计数的滤膜是很重要的。滤膜和洗提液应相容。
0,1%蛋白胨peptone通用
林格氏溶液
Balgon Ringer1/4强度溶解藻酸钙棉拭
Dissolution of BalBium alginate swaAs
医疗器械无菌和初始污染菌检
≤200 ≤20
不得检出不得检出
不得检出不得检出
≤100 不得检出
尿布等 普通级 消毒级
— ≤10 000
≤200 ≤20
不得检出不得检出
不得检出不得检出
≤100 不得检出
注：致病性化脓菌指绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌与溶血性链球菌。
初始污染菌的检验
03
02
当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。
超净工作台
恒温培养箱（至少2台）
压力蒸汽灭菌器
电热干燥箱
集菌仪
电子天平
光学显微镜
环境及人员要求
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
需氧菌生长
厌氧菌生长
培养基:
改良马丁培养基： 23℃ ~ 28℃培养14天
培养基:
培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。
01
02
灵敏度检查所用菌种 （药典2010版规定） 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌 白色念珠菌 黑曲霉
待琼脂凝固后翻转平皿置35 ℃±2 ℃培养48h后，计算平板上的菌落数。
取上清液共接种5个平皿，每个平皿中加入1mL供试液
稀释度 5
医疗器械的无菌和初始污染菌检验相关标准
医疗器械产品委托灭菌方式要求
医疗器械产品委托灭菌方式要求根据我市医疗器械生产企业和产品实际情况，无菌或消毒级产品通常采用环氧乙烷（EO）灭菌或钴60（Co60）辐照灭菌，且大多数产品采用委托灭菌的方式。
对于采用EO灭菌的，全部灭菌过程包含的活动主要有：1.灭菌验证、灭菌确认；2.初始污染菌检测；3.灭菌；4.无菌检测；5.产品解析；6.EO残留量检测；7.热原检测（如有）；8.产品的交付与接收。
对于采用Co60灭菌的，全部灭菌过程包含的活动主要有：1.灭菌验证、灭菌确认；2.初始污染菌检测；3.灭菌；4.无菌检测；5.热原检测（如有）；6.产品的交付与接收。
产品委托灭菌方式大体归纳为以下几种情况：1.委托方自己进行产品初始污染菌检测、无菌检测、EO残留量检测（如有）、热原检测（如有），仅将产品灭菌、产品解析（如有）工作进行委托。
这种情况下，委托方签订的是一份委托灭菌协议。
2.委托方将产品灭菌、产品解析（如有）、初始污染菌检测、无菌检测、EO残留量检测（如有）等工作全部委托一家企业完成。
这种情况下，委托方签订的也是一份委托灭菌协议，但其中会包括委托产品检测的内容。
3.委托方将产品灭菌、产品解析（如有）工作委托一家企业完成，将产品初始污染菌检测、无菌检测、EO残留量检测（如有）等工作委托另一家企业完成。
这种情况下，委托方签订的是一份委托灭菌协议和一份委托产品检测的协议。
在以上几种主要情况之外，还存在委托方将产品灭菌、无菌检测、EO残留量检测（如有）分别委托给不同的企业的情况；也存在对于同一个注册产品，既采用EO灭菌也采用Co60辐照灭菌，从而同时签订两份委托灭菌协议的情况。
为了更好地控制产品灭菌过程，提高产品委托灭菌的保证水平，规范企业委托灭菌的行为，针对以上的灭菌方式和过程，现特提出以下要求。
一、对委托双方基本要求的审查（一）双方均应是能够承担独立法律责任的法人主体；（二）委托方作为产品上市的法律责任主体，应充分了解产品灭菌所带来的风险，应充分掌握产品灭菌的适宜方法和控制过程，应充分掌握相关检测项目的检测方法和技术要求；（三）双方应签订委托灭菌或委托检测协议（合同）；（四）对于委托灭菌的1.委托方应在充分考虑产品本身、产品包装物等因素的情况下，选择适宜的灭菌方法；应制订对受托灭菌企业资质和能力进行评审的文件，并保有相关记录；2. 委托方应与受托方共同对委托灭菌产品的灭菌过程进行确认，并保有相关记录；需要时，应对灭菌过程进行再确认，并保有相关记录；3.受托方应具备所承担委托灭菌产品的能力，并保有相关灭菌记录；通常情况下受托方应将相关灭菌记录复印件交与委托方留存。
医疗器械产品和原材料初始污染菌计数法验证方案
质量管理验证文件产品和原材料初始污染菌计数法验证方案编制：审核：批准：发布日期：年月日2222222222有限公司目录1基本情况2验证目的3验证方案编制依据4验证小组5验证方案6验证记录和报告附件：验证相关表单一览表1 / 171 基本情况初始污染菌数量表示医疗器械产品最终灭菌前的生物负载，用以检验医疗器械产品生产过程初始污染菌控制效果以及最终产品组成部分的相关外购件（如：初包装等）微生物总数，证明灭菌前产品微生物水平是否在确认的保证产品无菌的环氧乙烷灭菌工艺可控制接受范围内，保证医疗器械产品的热原和细菌内毒素生物指标满足产品技术要求，所以确定医疗器械产品初始污染菌洗脱培养计数检验方法的适宜性和准确性尤为重要。
基于YY/T 0287-2017《医疗器械质量管理体系用于法规的要求》“6.4.2污染控制”、“7.5.2产品的清洁”对医疗器械生产、储存、灭菌前过程产品清洁或污染控制要求，以及《医疗器械生产质量管理规范附录无菌医疗器械》第“2.5.3”和“2.7.4”条规定的医疗器械和原材料初始污染菌控制要求，必须对医疗器械产品原材料、待灭菌产品的初始污染菌进行检验和管控，为保证一次性使用输液器（带针）、一次性使用袋式输液器（带针）、一次性使用精密过滤输液器（带针）、一次性使用自动截流输液器（带针）、一次性使用无菌注射器（带针）、一次性使用无菌溶药注射器（带针）、一次性使用静脉输液针、一次性使用无菌注射针、一次性使用静脉采血针、一次性使用无菌阴道扩张器、一次性使用预引式气管导管异型套件、三腔胃管产品及产品原材料（包含产品初包装、橡胶活塞、注射针、输液针、针管、精密药液过滤器、乳胶帽、硅胶垫）的初始污染菌洗脱检验方法的正确适宜性和微生物培养计数准确性，确定用于补偿无法从医疗器械产品和原材料中完全采集培养计数微生物数值的修正系数，现制定产品和原材料初始污染菌计数法验证方案。
2 验证目的将确定数量微生物接种到经灭菌处理的原材料、医疗器械产品外表面和（或）内腔，形成人工生物负载，依据原材料和医疗器械产品的结构特点，在袋蠕动、震摇、冲洗、搅拌、碎裂等微生物采集方法中，选择能充分收集原材料和医疗器械产品外表面和（或）内腔微生物，且对原材料和医疗器械产品不产生降解、溶出等分解化学反应的适宜的采集方法，对接种于原材料、医疗器械产品外表面和（或）内腔的微生物进行采集，通过采集液薄膜过滤，对滤膜进行培养，点计原材料、医疗器械产品外表面和（或）内腔收集的微生物数量，同时分别对原材料、医疗器械产品的微生物采集、微生物培养、微生物计数法完整检验方法的适宜性和准确性进行验证，汇总验证过程记录数据计算并确定原材料、医疗器械产品外表面和（或）内腔初始污染菌回收修正系数，为制定原材料、医疗器械产品初始污染菌采集培养计数方法提供正确依据。
3、医疗器械的无菌和初始污染菌检验
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC（B） 10 104］
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis )
［CMCC（B） 63 501］
生孢梭菌 (Clostridiumsporogenes)
[CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candidaalbicans)
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术的培训。还应该具有高度的责任心 和严谨细致的工作作风。
无菌检查法 环境要求
无菌检查法 环境要求
隔离系统
无菌检查法 环境要求
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。
TSA琼脂平皿 在30℃~ 35℃培 养48h证明无菌
取3只放无菌操作 台或超净工作台平 均位置打开上盖， 暴露30min后盖好
平板划线法-曲线法：将挑取有样品的接种环在平 板培养基上作连续划线。
培养基的适用性检查
血琼脂平板上的金黄色葡萄球菌 （大的金黄色菌落） 在划线过程中，细胞逐渐分散，培养后可形成单个菌落。
培养基的适用性检查
定期移植法:亦称传代培养保藏法，指将菌种接种于适 宜的斜面培养基上，最适条件下培养，完成培养于(4～6)℃ 进行保存并间隔一定时间进行移植培养的一种短期菌种保藏 方法。
无菌检查法 试验前准备
配制培养基所需器具:
无菌检查法 试验前准备
常用器具与稀释液:
无菌检查法 试验前准备
培养基:
无菌检查法
硫乙醇酸盐流体培养基:
在供试品接种前, 培 养基氧化层的高度不得超 过培养基深度的1/5，否则 ,须经100℃水浴加热至粉 红色消失（不超过20分钟 ）迅速冷却,只限加热一次 ，并应防止被污染。其装 量与容器高度的比例应符 合培养结束后培养基氧化 层（粉红色）不超过培养 基深度的 1/2。30℃ ~ 35℃培养14天。
1、医疗器械无菌和初始污染菌检验
无菌检查法 培养及观察
上述含培养基的容器按规定的温度 培养14天。培养期间应逐日观察并记录 是否有菌生长。如在加入供试品后或在 培养过程中，培养基出现浑浊，培养14 天后，不能从外观上判断有无微生物生 长，可取该培养液适量转种至同种新鲜 培养基中，细菌培养2天、真菌培养3天， 观察接种的同种新鲜培养基是否再出现 浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检， 判断是否有菌。
改良马丁培养基4支：分 别接种小于100cfu的白念、 黑曲霉各2支，其中1管接 入每支培养基规定的供试 品接种量，另1管作为对 照，培养5天。
白色念珠菌
黑曲霉
方法验证试验：结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验 菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检 验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计 ，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查 。如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓 慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验 条件下有抑菌作用，可采用增加冲洗量，或增加 培养基的用量，或使用中和剂或更换滤膜品种等 方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法 验证。 方法验证试验也可与供试品的无菌检查同时进 行。
无菌检查法 环境要求
无菌检查法 环境要求
隔离系统
无菌检查法 环境要求
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。 TSA琼脂平皿 在30℃~ 35℃培 养48h证明无菌 取3只放无菌操作 台或超净工作台平 均位臵打开上盖， 暴露30min后盖好 3只培养皿上 生长的菌落 数平均应不 超过1个
供试品的无菌检查
阴性对照（目的是验证试验是否存在污染） ：供试品 无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作 为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。 阳性对照（目的是验证试验可靠性，防止假阴性）： 应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑菌作用供 试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对照试 验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu ，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的 样品量。阳性对照管培养48 ~ 72小时应生长良好。
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3 生物负载测定方法A.1 概要A.1.1 生物负载测定，可使用不同的方法内容。
初始污染菌检验操作规程
初始污染菌检验操作规程方法：每个培养皿上菌落数超过300个，以最近的一个稀释级计数。
每个培养皿上菌落数在30-300个之间，以最近的两个稀释级计数，如最近的两个稀释级计数相差大于10倍，则应重新进行稀释。
4.6.3结果判定：若每个培养皿上菌落数均小于规定标准，则样品合格；若有一定数量的培养皿上菌落数超过规定标准，则进行进一步检验。
若进一步检验结果仍然超过规定标准，则样品不合格。
初始污染菌检验操作规程目的：本规程的目的是为了测定样品细菌总数，以判断样品细菌污染的程度，并评估生产单位的卫生状况，为下一步的灭菌提供参考依据。
适用范围：本规程适用于所有需要消毒灭菌前的产品和洁净车间。
作业条件：1.无菌检测需要在洁净度为100级单向流空气区域内进行，严格遵守无菌操作，避免污染。
2.超净台及工作台面必须进行洁净度验证。
作业方法与步骤：1.制作营养琼脂培养基，并按要求培养16-18小时后，检查无菌生长方可使用。
2.进行无菌室洁净度验证。
3.进行产品采集与样品处理，制备供试液。
4.进行供试液的10倍递减稀释。
5.进行接种检验。
6.进行培养。
结果与判定：1.计数方法：每个培养皿上菌落数超过300个，以最近的一个稀释级计数。
每个培养皿上菌落数在30-300个之间，以最近的两个稀释级计数，如最近的两个稀释级计数相差大于10倍，则应重新进行稀释。
2.结果判定：若每个培养皿上菌落数均小于规定标准，则样品合格；若有一定数量的培养皿上菌落数超过规定标准，则进行进一步检验。
若进一步检验结果仍然超过规定标准，则样品不合格。
菌落计数是食品微生物学检验中常用的方法之一。
在进行菌落计数时，需要注意以下基本规则。
首先，不宜采用菌落层片状生长的平板。
其次，计数符合要求的平板上的菌落，按照公式计算结果。
具体而言，菌数除以每件次（或g）的重量，等于件次或重量（g）。
选取平均菌落数在30～300之间的稀释级作为报告菌落数测定范围。
如果只有一个稀释级平均菌落数在30～300之间，则将该稀释级的菌落数乘以稀释倍数进行报告。
产品初始污染菌数检验方法
文件编号
版号
A.0
产品初始污染菌数检验方法
页次
生效日期
2020/01/02
1．目的
制订产品初始污染菌数检验方法，对从事测试的工作人员进行培训指导，规范检验方法及操作。
2．适用范围:
本方法适用于一次性使用无菌医疗器械灭菌前染菌量的检测。
3．职责
质检部对本检验方法实施负责。
4．程序
4.1仪器
分析天平、干燥箱、净化工作台、压力蒸汽消毒器、电热恒温水浴锅、生化低温培养箱
6.5手提式压力蒸汽消毒器操作规程
6.6净化工作台操作规程
7.参考文件
7.1《一次性使用医疗用品卫生标准》GB 15979-2002
编制：
日期：
审核：
日期：
批准：
日期：
菌落总数≤100cfu/g。
4.6.2阴性对照试验平板有菌生长，供试品的检验无效。
5．相关记录及保存：
5.1产品初始污染菌数检验记录QP27-QR-17
5.2质检部保管5年。
6.相关操作规程
6.1电子分析天平操作规程
6.2电热鼓风干燥箱操作规程
6.3电热恒温水浴锅操作规程
6.4生化低温培养箱操作规程
4.5.4.2结果报告
菌落呈片状生长的平板不宜采用；计数符合要求的平板上的菌落，按式(B1)计算结果：
式中：X1――细菌菌落总数，cfu/g或cfu/mL；
A――5块营养琼脂培养基平板上的细菌菌落总数；
K――稀释度。
当菌落数在100以内，按实有数报告，大于100时采用二位有效数字。
如果样品菌落总≥20数进行复检和结果报告。
有限公司
文件编号
版号
A.0
(环境管理)初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3 生物负载测定方法A.1 概要A.1.1 生物负载测定，可使用不同的方法内容。
医疗器械无菌和初始污染菌检验(精选)PPT文档29页
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
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27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
选）
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71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
初始污染菌实验方法验证
初始污染菌实验方法验证在生命科学领域，微生物污染在实验中是一个非常普遍的问题。
不仅会影响实验结果的准确性和可靠性，还会影响重要的生产过程。
因此，为了保证实验的成功，必须开发出一种可靠的方法来验证实验室中的物品是否存在微生物污染。
本文将介绍一种简单的方法来验证初始污染菌。
必备材料•无菌纯水•Tryptic Soy Broth（TSB）•青霉素和链霉素组合液•离心管•移液器•微量移液器步骤步骤一：制备TSB培养基取适量的TSB培养基，按照说明书的指示加入适量的无菌纯水，在无菌条件下进行混合并调整pH值至7.2-7.4。
步骤二：检查无菌水和青霉素和链霉素组合液的无菌性取适量的无菌纯水和青霉素和链霉素组合液，并在15ml的离心管中进行热处理。
在121℃下进行30分钟烘烤。
热处理之后，检查管子是否依然无菌。
步骤三：制备初始污染菌样品选取一种已知的细菌菌株，并放入无菌纯水的250ml Erlenmeyer三角瓶中，密封好瓶口，并在温育箱中以37℃的恒温培养24小时，制备出初始污染菌样品。
步骤四：制备验证菌液取一定量的TSB培养基，加入青霉素和链霉素组合液（最终浓度为10ug/ml），并进行热处理，待培养基冷却后，取一定量的初始污染菌样品用微量移液器加入到青霉素和链霉素培养基中，制备出验证菌液。
步骤五：分配验证菌液将验证菌液分别加入到无菌纯水的离心管中，接种量为1ml、0.1ml、0.01ml、0.001ml、0.0001ml等不同容量，序列号编好，每种容量配制三个重复。
这些离心管可在30℃下进行24小时的培养，检查有无微生物的生长。
步骤六：观察结果观察离心管培养基中有无微生物的生长。
如果所有序列号中均无微生物的生长，即可认为实验室物品无微生物污染，反之则有微生物污染。
初始污染菌实验方法验证可以有效地检查实验室物品中的微生物污染情况。
它易于操作，实验过程简单明了，并且针对不同容量的接种进行了细致的设计，以检查有无微生物生长。
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培养基的适用性检查
灵敏度检查： 菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5
代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并 采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性 。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)［CMCC（B） 26 003］
培养基的适用性检查
菌液制备：接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜 面培养基上，（23～28）℃培养（5～7）天，加入 （3～5）mL含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠 溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜的方法吸出孢子悬液至 无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌 氯化钠溶液制成每1mL 含孢子数小于100cfu的孢子悬液 。
抑细菌/抑霉菌试验：用选定的微生物来演示某些物 质的存在能够抑制这些微生物的繁殖。
培养基: 是人工配制的生物营养物质，即用人工的方 法将多种物质按各种微生物生长繁殖的需要配成的一种 混合营养物。
促生长试验：用于证明生长培养基能够支持微生物 生长的技术操作。
假阴性：实际阳性的无菌试验结果被变成了阴性。
方法验证试验
• 无菌检验有两种方法：直接接种法、薄膜过滤法 • 直接接种法:将供试品或其有代表性的各部分直接
投放入培养基内培养。 • 薄膜过滤法:含抗菌、抑菌成分的供试品会抑制某
些微生物的生长繁殖,所以用常规方法检查会出现 假阴性的结果, 但并不等于产品中没有微生物甚至 是致病性微生物。所以采用薄膜过滤法来去除供 试品中可溶的抑菌性成分,把细菌等微生物截留在 滤膜上,然后再经过处理培养使所含微生物生长繁 殖, 从而使微生物检出。
试验前准备
需氧菌 生长
厌氧菌 生长
无菌检查法 试验前准备
100℃水浴 加热
无菌检查法 试验前准备
培养基:
无菌检查法 试验前准备
• 改良马丁培养基： 23℃ ~ 28℃培养14天
无菌检查法 试验前准备
培养基:
培养基的适用性检查
• 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良 马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及 灵敏度检查的要求。
真菌：为多细胞或单细胞微生物，其细胞分化完善， 有细胞核和各种细胞器，故易在体外生长繁殖，直径一
般为10μm ~ 100μm。
医疗器械无菌检验所需设备
超净工作台
医疗器械无菌检验所需设备
恒温培养箱（至少2台）
医疗器械无菌检验所需设备
压力蒸汽灭菌器
医疗器械无菌检验所需设备
电热干燥箱
医疗器械无菌检验所需设备
集菌仪
医疗器械无菌检验所需设备
生物安全柜:（从试 验安全性考虑，建 议阳性对照试验使 用生物安全柜）
医疗器械无菌检验所需设备
电子天平
医疗器械无菌检验所需设备
光学显微镜
医疗器械无菌检验所需设备
过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子）
环境及人员要求
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁 净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行 ，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物 污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期 按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和 沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度 验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
改良马丁培养基4支：分 别接种小于100cfu的白 念、黑曲霉各2支，其中1 管接入每支培养基规定的 供试品接种量，另1管作 为对照，培养5天。
方法验证试验：结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验 菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验 条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照 此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。如含 供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生 长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑 菌作用，可采用增加冲洗量，或增加培养基的用量 ，或使用中和剂或更换滤膜品种等方法，消除供试 品的抑菌作用，并重新进行方法验证。
方法验证试验
• 当建立产品的无菌检查法时，应进行方 法的验证，以证明所采用的方法适合于该产 品的无菌检查。若产品的组分或原检验条件 发生改变时，检查方法应重新验证。
• 验证时，按“供试品的无菌检查”的规 定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐 一进行验证。
方法验证试验
菌种及菌液制备 ：除大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黄色葡萄球 菌 、 枯草芽孢杆菌 、 生孢梭菌、 白色念珠菌、 黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液 制备同金黄色葡萄球菌。
方法验证所用菌种 （药典2010版规定）
金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
白色念珠菌 黑曲霉
方法验证试验：直接接种法
分别接种各 菌种新鲜培 养物至相应 培养基中培 养，将培养 物用0.9%无 菌氯化钠溶 液制成菌悬 液（浓度小
于 100cfu/mL）
硫乙醇酸盐流体培养基8 支：分别接种小于100cfu 的金葡、大肠、枯草、生 孢各2支，其中1管接入每 支培养基规定的供试品接 种量，另1管作为对照， 培养3天。
方法验证试验与灵敏度检验所有菌种区别：大肠 埃希菌代替铜绿假单胞菌。
方法验证试验：薄膜过滤法
• 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过 滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小 于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙 醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基中，或将培 养基加至滤筒内。另取一装有同体积培养基的容 器，加入等量试验菌，作为对照。按规定温度培 养3天~ 5天。各试验菌同法操作。
铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) ［CMCC（B） 10 104］
枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis )
［CMCC（B） 63 501］
生孢梭菌 (Clostridiumsporogenes)
[CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candidaalbicans)
无菌技术:是指在微生物试验工作中，控制或防止各类 微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其 中包括无菌环境设施、无菌试验器材以及无菌操作。
无菌操作:是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或 无菌器械进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰 的一种常规操作方法。
培养条件：用于促进微生物发育、生长和繁殖的生长 培养基和培养方式的组合。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过 无菌技术的培训。还应该具有高度的责任心和严 谨细致的工作作风。
无菌检查法 环境要求
无菌检查法 环境要求
隔离系统
无菌检查法 环境要求
无菌室在消毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。
TSA琼脂平皿 在30℃~ 35℃ 培养48h证明无
菌
取3只放无菌操作 台或超净工作台平 均位置打开上盖， 暴露30min后盖好
规定。
白色念珠菌 黑曲霉
100cfu的白念、 黑曲霉各2支， 另1支不接种做
空白对照，培养
5天
培养基的适用性检查
对起始样品进行连续10倍稀释，将高稀释倍数的样品与冷却 至适当温度的溶化琼脂培养基倒入无菌平皿后混合均匀，培养后 获得单菌落。培养基表面菌落为圆形，而培养基内部菌落呈豆状 或透镜状。
培养基的适用性检查
假阳性：实际阴性的无菌试验结果被变成了阳性。
需氧菌：在代谢中，有氧条件下才能生存的微生物。
厌氧菌：在代谢中，没有氧的条件下才能生存的微生物。
无菌保证水平（SAL）:灭菌后产品上存在单个活微生物的 概率。
细菌：为单细胞微生物,其细胞分化不完善，无完整
细胞核及核膜、核仁，直径一般为1μm ~ 10μm。
生孢梭菌
种新鲜培养物 至相应培养基 中培养，将培 养物用0.9%无 菌氯化钠溶液
制成菌悬液 （浓度小于 100cfu/mL）
金葡、铜绿、枯 草、生孢各2支， 另一支不接种做 空白对照，培养 3天
改良马丁培养基 （9mL） 5支： 分别接种小于
逐日观察结果：
空白对照管应 无菌生长，若 加菌的培养基 管均生长良好， 则灵敏度符合
菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在 （2～8）℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在
（2～8）℃，在验证过的贮存期内使用 。
培养基的适用性检查
平板划线法-斜线法：用接种环以无菌操作挑取菌悬液一 环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线（3-4）条， 再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后 通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二 次平行划线部分作第三次平行划线和第四次平行划线。
[CMCC(F) 98 001]
黑曲霉
(Aspergillus niger )
[CMCC(F) 98 003]
培养基的适用性检查
菌液制备： 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽
孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养 琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫 乙醇酸盐流体培养基中，30℃～35℃培养18小时 ～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良 马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，（23～ 28）℃培养（24～48）小时，上述培养物用0.9% 无菌氯化钠溶液制成每1mL 含菌数小于100cfu（ 菌落形成单位）的菌悬液。
操作步骤： 斜面制备
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
接种
培养 保藏
❖接 种
培养基应符合无菌性检查及灵敏度检查的要求。检查可在供试品的无菌检查前
或与供试品的无菌检查同时进行。
灵敏度检查所用菌种
硫乙醇酸盐流体 培养基（12mL）