蛋白质组学 第二章

利用生物信息学，进行数据库搜索 利用生物信息学，
确定蛋白质
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除了上述蛋白质组研究的基本技术外，新的蛋白 除了上述蛋白质组研究的基本技术外， 质组研究技术也不断出现， 质组研究技术也不断出现，如用于定量蛋白质组 学研究的同位素编码亲和标签技术（ICAT） 学研究的同位素编码亲和标签技术（ICAT）和双 色荧光技术等；用于蛋白质色荧光技术等；用于蛋白质-蛋白质相互作用研究 的酵母双杂交技术、 的酵母双杂交技术、蛋白质复合物免疫分离与质 谱鉴定技术以及蛋白质芯片技术等等，我们后面 谱鉴定技术以及蛋白质芯片技术等等， 有时间单独介绍。 有时间单独介绍。
双向电泳图， 摘自于“电泳皇后” Görg 双向电泳图， 摘自于“电泳皇后” Angelika G rg
http://www.wzw.tum.de/proteomik/ (Görg实验室的主页， 有大量2D相关资料）
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蛋白质电泳实验技术
1． 2. 3. 4． 5． 6． 7． 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 载体两性电解质PH PH梯度等电聚焦 载体两性电解质PH梯度等电聚焦 固相PH PH梯度等电聚焦 固相PH梯度等电聚焦 双向电泳 滴定曲线 免疫电泳
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第二节 蛋白质组学的技术支持
蛋白质组学（proteomics）的目的是实现对一 蛋白质组学（proteomics） 个基因组所编码的全部蛋白质及其相互作用的 研究。是采用2 DE、MS和生物信息技术研究蛋 研究。是采用2-DE、MS和生物信息技术研究蛋 白质组的成份与功能。（高通量、高效率） 。（高通量 白质组的成份与功能。（高通量、高效率） 蛋白质组学是在蛋白质水平研究基因的表达。 蛋白质组学是在蛋白质水平研究基因的表达。
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DNA分析（cDNA微阵列）与蛋白质分析（ DNA分析（cDNA微阵列）与蛋白质分析（2－DE与质谱）方法的比较 分析 微阵列 DE与质谱） 与质谱
DNA
检测水平 检测方法 DNA可用PCR扩增技术 DNA可用PCR扩增技术 可用PCR 高度特异 (DNA/RNA )由于与其互 )由于与其互 补序列的杂交能力，使得DNA DNA很容 补序列的杂交能力，使得DNA很容 易固相在靶上并用荧光探针检测 DNA是非常稳定的， DNA是非常稳定的，即使在提高温 是非常稳定的 度的情况下也不会丢失生物活性 重复性好 DNA固相化在表面是成熟的技术 将DNA固相化在表面是成熟的技术 加之DNA固有的稳定性， DNA固有的稳定性 ，加之DNA固有的稳定性，方法的 重复性较好 初始的投入是较大的，短期内得到 初始的投入是较大的， 的数据量相当大。 的数据量相当大。 方法已相当的标准化 已成为高通量的扫描技术
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二维凝胶电泳
（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE) twoelectrophoresis，
由于大型串联质谱的飞速发展， 双向电泳目前已 经逐渐让位给其他的各种非胶系统分析手段，但 是双向电泳在很长一段时间内仍然会是我们在蛋 白质组学领域中不可缺少的一种分析手段。 2-DE 是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的 分离技术。 2-DE是由O’Farrel和Klose于1975年 DE是由O Farrel和Klose于1975年 分别提出的。在2 DE中，蛋白质首先根据等电点 分别提出的。在2-DE中，蛋白质首先根据等电点 的不同在一向等点聚焦电泳中分离，接着被转移 到二向SDS-PAGE胶上，再根据相对分子量的大小 到二向SDS-PAGE胶上，再根据相对分子量的大小 不同被分离。
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2-DE
双向电泳后，每个蛋白质都相应于样品中的每种蛋白质 双向电泳后， 分子，同时获得蛋白质的等电点、 分子，同时获得蛋白质的等电点、分子量和每种蛋白质 的数量信息。 的数量信息。
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2D-PAGE
Proteomics
1.
1. 2D-PAGE to separate proteins 2. Image analysis to determine the volume of protein spots 3. Mass spectrometry (MS) to characterise protein spots 4. Database searches to identify proteins
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二维凝胶电泳 （two-dimensional gel electrophoresis，2-DE) twoelectrophoresis， 色谱色谱-质谱技术 二维色谱－串联质谱技术（ 二维色谱－串联质谱技术（2D-HPLC-MS) HPLC同位素标记（ICAT） 亲和色谱同位素标记（ICAT）-亲和色谱-质谱技术 一维电泳（色谱）一维电泳（色谱）-质谱技术 蛋白质复合物变性、降解后，直接加到强离子交换柱上， 梯度洗脱进入反向液相色谱上，再洗脱进入MS系统进行 梯度洗脱进入反向液相色谱上，再洗脱进入MS系统进行 肽段分析。
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传统的蛋白质组学分析
蛋白质样品用2 DE分离 蛋白质样品用2-DE分离 Edman降解 Edman降解…… 降解…… 从凝胶上切下蛋白质点， 从凝胶上切下蛋白质点，并酶解蛋白质 单个蛋白质点的多肽混合物 借助基质的激光解吸和离子化质谱 MALDI（MALDI-TOF MS) 多肽质谱指纹 fingerprint） （peptide mass fingerprint） 电喷离子化质谱 (EST(EST-MS/MS) ESI-MS序列标记 ESI-MS序列标记 tag） （sequence tag）
二、蛋白质的鉴定技术
对二维电泳或二维色谱分离的蛋白质，如何进行 快速、灵敏、准确的识别和鉴定，是蛋白质组研 究面临的又一重大挑战。传统的蛋白质化学方法， 如Edman降解或氨基酸组成分析技术已经难以满足 Edman降解或氨基酸组成分析技术已经难以满足 蛋白质组研究的需要，已经发展了一百多年的质 谱技术，由于其具有的高灵敏度、高准确度、易 于自动化等特点，已经成为蛋白质组研究的关键 技术之一。
第二章 蛋白质组的研究方法
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第一节 概述
1．蛋白质组的研究来自百度文库基因组的研究复杂。 蛋白质组的研究比基因组的研究复杂。
同一性与多样性 有限与无限 静态与动态 时间与空间 孤立行为和相互作用 单一手段和多种技术 互补与互助
分子的稳定性
重复性
消耗 专业化 时间/ 时间/自动化
翻译后修饰 动态范围
无法研究 5个数量级
研究蛋白本身 7－12个数量级 12个数量级
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尽管核酸的研究技术取得了突飞猛进的发展， 尽管核酸的研究技术取得了突飞猛进的发展，但是蛋白质 的研究技术也并未停滞不前。 的研究技术也并未停滞不前。 1975年的双向电泳技术(2-DE)可同时分离数千种蛋白 年的双向电泳技术(2 可同时分离数千种蛋白， 1975年的双向电泳技术(2-DE)可同时分离数千种蛋白，20 世纪80年代固相化PH 80年代固相化PH梯度凝胶的引进使得双向电泳的重复 世纪80年代固相化PH梯度凝胶的引进使得双向电泳的重复 性和加样量得到巨大的改善，从而为蛋白质组的研究起到 性和加样量得到巨大的改善， 巨大的推动作用，从而使今天的蛋白质组研究得以实施。 巨大的推动作用，从而使今天的蛋白质组研究得以实施。 以计算机技术为基础的多种图像分析与大规模数据处理软 件的问世，使得科学家们处理数据的心应手。80年代后期 件的问世，使得科学家们处理数据的心应手。80年代后期 出现的质谱技术， 出现的质谱技术，可精确测定生物大分子的相对分子质量 和多肽序列。回想起十年以前， 和多肽序列。回想起十年以前，一个蛋白质化学家一年鉴 定两三个蛋白，而现在， 定两三个蛋白，而现在，蛋白质研究技术加上基因组提供 的信息使得一个科学家一个星期可以鉴定几百个蛋白。 的信息使得一个科学家一个星期可以鉴定几百个蛋白。 双向电泳技术、 双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以 及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。 及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
Protein
蛋白无法扩增 非特异 （protein)可以用非特异 protein)可以用非特异 的蛋白染色或较特异的方法如抗体 进行检测） 进行检测） 蛋白质在变性的情况下会丧失其 天然功能， 天然功能，因此要格外小心以保持 其天然构象 重复性不好 由于蛋白的稳定性不好， 由于蛋白的稳定性不好，方法的重 复性不太好需要格外注意 目前的蛋白分析方法依靠昂贵仪器 设备（质谱仪和电泳设备） 设备（ 质谱仪和电泳设备） 比较困难，大部分工作需受过训练 比较困难， 的实验室人员来操作 目前还不能达到
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2．从技术手段上讲
我们无法采用在基因组研究中所普遍采用的PCR 我们无法采用在基因组研究中所普遍采用的 PCR 技术 PCR技术 来对痕量蛋白进行扩增。 来对痕量蛋白进行扩增。 蛋白质组也没有一种测序技术与基因组研究中起关键 作用的自动化的DNA测序技术相媲美。 DNA测序技术相媲美 作用的自动化的DNA测序技术相媲美。 Chip的发展使我们对基因的研究可以高通量 的发展使我们对基因的研究可以高通量， Chip的发展使我们对基因的研究可以高通量，而对蛋 白质组的研究离高通量还有很大差距。 白质组的研究离高通量还有很大差距。
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一、大规模蛋白质的分离技术
人类基因组中约含有3 万个编码基因， 人类基因组中约含有3-4万个编码基因，其表 达的蛋白质可能有十几万，甚至更多。 达的蛋白质可能有十几万，甚至更多。如何 实现对细胞、 实现对细胞、组织或体液所含有的成千上万 个蛋白质的有效分离， 个蛋白质的有效分离，是蛋白质组研究所解 决的首要问题。 决的首要问题。理想的蛋白质分离方法首先 要具备超高分辨率， 要具备超高分辨率，能够将成千上万个蛋白 质包括它们的修饰物同时分离并与后续的鉴 定技术有效衔接。 定技术有效衔接。