毛细管电泳分离技术资料
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毛细管电泳分离技术
❖ 概述 ❖ 毛细管电泳基本原理 ❖ 毛细管电泳的分离模式 ❖ 影响毛细管电泳分离效率的因素 ❖ 毛细管电泳技术的应用 ❖ 21世纪毛细管电泳发展趋势
一、概 述
毛细管电泳(capillaryelectrophoresis, CE),又称高效毛细管电泳(HPCE)是 近年来发展最快的分析化学研究领域之一。 是基于两种或多种带电粒子或微粒,它们所 在的介质受到外加直流电场的作用下,其迁 移速率不同而得到分离的一类方法。
细管内径增大受焦耳热影响的制约,因此采用细内 径毛细管柱时,测量灵敏度受到限制。
三、毛细管电泳的分离模式
❖ 毛细管区带电泳(CZE) ❖ 胶束电动毛细管电泳(MECC) ❖ 毛细管凝胶电泳(CGE) ❖ 毛细管等电聚焦(CIEF) ❖ 毛细管等速电泳(CITP) 毛细管离子电泳(CIE) ❖ 毛细管电色谱
介质条件
介质条件除缓冲溶液及pH值等条件外,为了提 高分离的选择性,常常在缓冲液中添加适量的表面 活性剂,或者使用非水溶剂。
基于环糊精(CD)的分子结构具有圆锥形的空腔、 可以形成“包络物”的特性,在胶束电动毛细管色 谱分离法(MECC)中,常在含有十二烷基硫酸钠 (SDS)胶束的电泳缓冲液中,加入一定浓度的环糊 精,使待分离的组分在水相、SDS胶束相和环糊精 中进行分配。由于不同溶质分子或荷电质点的分配 不同,在电泳力和电渗力的驱动下,将以不同的速 度在毛细管中迁移,以获得更好的分离效果。
电渗流的控制
管壁ห้องสมุดไป่ตู้Zeta电位(ζ)是产生电渗流的主要因素。电渗流的 大小,可采用以下措施加以控制:
▲对毛细管内壁进行适当的化学修饰,在管内壁键合上一层 中性材料可减少电渗流,同时也可减少溶质与管壁的相互作 用,减少溶质吸附于管壁上。这对于蛋白质类的生物大分子 的分离尤为重要。 ▲调节缓冲液的pH值及缓冲液的浓度。降低缓冲液的浓度, 可降低电流强度,减少管内壁溶液的温度差。 ▲加入表面活性剂(如环糊精)或手性试剂。 ▲加入适量的有机溶剂也可以降低电渗流。
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
五、毛细管电泳技术的应用
(一)糖类的分离与分析 (二)在天然中草药分析领域中的应用 (三)在基因工程研究方面的应用 (四)单细胞分析 (五)手性分离 (六)小分子离子分析
毛细管电泳技术的特点
类别
特点
速度
快速,可于几分钟内完成复杂成分的分离
分辨率
带展宽有限,分辨率高
灵敏性
检测下限低,灵敏性高
进样体积 进样体积小,毫微升
➢ 被分离试样可以采用流体动力学进样和电动进样 方式由毛细管一端进入。
毛细管电泳的进样技术
毛细管内径小于100μm时,注射器进样比较 困难。
(一)电动进样
(二)流体动力学进样
(一)电动进样
三 步:
❖ 毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中,试 样管中插入电极,
❖ 与检测段的缓冲液间施加进样电压,并维持一定时 间,试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管,
毛细管电泳检测器
❖ 由于样品区带在高压电场作用下,迁移速度 较快,因此,CE要求所用的检测器必须具有 很快的响应速度和很高的灵敏度。 常用的检测器有:
❖ 光学检测器(紫外检测器和荧光检测器) ❖ 电化学检测器 ❖ 质谱检测器 ❖ 核磁共振检测器
紫外检测器
根据比耳定律,光度测量值A与吸收光呈成正比。 一般检测中,检测最大光程是用毛细管内径,而毛
❖ 然后再将试样溶液换成缓冲液,电泳即可进行。改 变进样电压和进样时间,便可改变进样量。
(二)流体动力学进样
流体动力学进样:也称虹吸进样、重力进样和压差 进样。
➢ 将毛细管插入试样溶液容器,通过进样端加压,或 调节进样端试样溶液液面高于出口端缓冲液液面高 度,利用虹吸现象,试样在压力差作用下进入毛细 管进样端,再把进样端放回缓冲液液槽中,进行电 泳。
检测方式 可使用多种检测器
自动化方面 自动化程度高,进样、分析及数据处理自动化
六、21世纪毛细管电泳发展趋势
对于已经发展了近20年的毛细管电泳技术来说, 在新的世纪中,仍然面l临着极大的机遇和挑战。仪 器的发展需要进一步成熟和完善.在重现性、速度 和检测灵敏度等方面还期待着重大突破。多种检测 手段的可供选择,在众多革新应用中。MS会在多 种应用领域中成为更重要和更标准的检测方法。微 全分析(p—TAS)的提出,使得集成毛细管电泳技术 (ICEC)延伸了毛细管电泳的潜力和可行性。随着人 类基因计划的重大进展.基因组学的出现和发展以 及大规模测序的需求,毛细管阵列电泳(cAE)一跃 成为承担这些任务的最佳选择之一。另外,利用离 子液体非水介质的毛细管电泳的研究也正在渐渐崛 起,同样引起了毛细管电泳工作者的极大关注。
四、影响毛细管电泳分离效率的因素
从毛细管电泳的效能(塔板数、塔板高度)及分辨率 的关系式可以看出,影响毛细管电泳与分离效率的因素很 多,下面就几个主要方面加以简要分析: ★ 峰拓宽 ★ 电渗流的控制 ★ 介质条件
峰拓宽
用σ2表示峰宽总方差,如半峰宽仅由溶质的扩散所引 的,则σ2=2DL。因此任何影响扩散系数D的因素,都会 影响峰宽。但实际上,其它因素如进样、焦耳热产生的温 度分布、电渗等都会对带宽产生明显的影响。进样会产生 自然宽度,它与进样“塞”的长度及初始形状有关,为了 减少进样增宽,导入的样品“塞”应为矩形,进样长度一 般小于毛细管分离长度的1%;电流通过毛细管内缓冲溶 液时,产生焦耳热,使温度发生变化,将引起溶液粘度的 变化及电泳、电渗性能的变化。引起温度变化的原因是电 流强度,电流增大时,管内溶液温度升高,管中心与管壁 的温差ΔT可达几十度,在毛细管内形成径向的温度梯度, 溶质在电场中的迁移速度也在管径内形成梯度,严重影响 分离效果。为了消除其影响,须将I控制在200μA以下,使 用薄壁及内径小的毛细管,并在恒温下进行电泳。
毛细管电泳装置
❖ 直流高压电源、毛细管、进样装置、检测 器和记录仪等
➢ 高压电源可对毛细管施加5~50 kV电压,操作电 压一般控制在5~30 kV范围。
➢ CE通常使用内径10~100 μm、长12~120 cm (内 涂聚酰亚胺) 弹性融凝石英毛细管,毛细管的两 端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中,毛细管 内也充满同样的缓冲溶液。
二、毛细管电泳基本原理
CE是以高压电场为驱动力。以毛细管为分离通 道,依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差 异,而实现分离的一类液相分离技术。
仪器装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器 和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮 瓶,在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以 不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电 泳。
❖ 概述 ❖ 毛细管电泳基本原理 ❖ 毛细管电泳的分离模式 ❖ 影响毛细管电泳分离效率的因素 ❖ 毛细管电泳技术的应用 ❖ 21世纪毛细管电泳发展趋势
一、概 述
毛细管电泳(capillaryelectrophoresis, CE),又称高效毛细管电泳(HPCE)是 近年来发展最快的分析化学研究领域之一。 是基于两种或多种带电粒子或微粒,它们所 在的介质受到外加直流电场的作用下,其迁 移速率不同而得到分离的一类方法。
细管内径增大受焦耳热影响的制约,因此采用细内 径毛细管柱时,测量灵敏度受到限制。
三、毛细管电泳的分离模式
❖ 毛细管区带电泳(CZE) ❖ 胶束电动毛细管电泳(MECC) ❖ 毛细管凝胶电泳(CGE) ❖ 毛细管等电聚焦(CIEF) ❖ 毛细管等速电泳(CITP) 毛细管离子电泳(CIE) ❖ 毛细管电色谱
介质条件
介质条件除缓冲溶液及pH值等条件外,为了提 高分离的选择性,常常在缓冲液中添加适量的表面 活性剂,或者使用非水溶剂。
基于环糊精(CD)的分子结构具有圆锥形的空腔、 可以形成“包络物”的特性,在胶束电动毛细管色 谱分离法(MECC)中,常在含有十二烷基硫酸钠 (SDS)胶束的电泳缓冲液中,加入一定浓度的环糊 精,使待分离的组分在水相、SDS胶束相和环糊精 中进行分配。由于不同溶质分子或荷电质点的分配 不同,在电泳力和电渗力的驱动下,将以不同的速 度在毛细管中迁移,以获得更好的分离效果。
电渗流的控制
管壁ห้องสมุดไป่ตู้Zeta电位(ζ)是产生电渗流的主要因素。电渗流的 大小,可采用以下措施加以控制:
▲对毛细管内壁进行适当的化学修饰,在管内壁键合上一层 中性材料可减少电渗流,同时也可减少溶质与管壁的相互作 用,减少溶质吸附于管壁上。这对于蛋白质类的生物大分子 的分离尤为重要。 ▲调节缓冲液的pH值及缓冲液的浓度。降低缓冲液的浓度, 可降低电流强度,减少管内壁溶液的温度差。 ▲加入表面活性剂(如环糊精)或手性试剂。 ▲加入适量的有机溶剂也可以降低电渗流。
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
五、毛细管电泳技术的应用
(一)糖类的分离与分析 (二)在天然中草药分析领域中的应用 (三)在基因工程研究方面的应用 (四)单细胞分析 (五)手性分离 (六)小分子离子分析
毛细管电泳技术的特点
类别
特点
速度
快速,可于几分钟内完成复杂成分的分离
分辨率
带展宽有限,分辨率高
灵敏性
检测下限低,灵敏性高
进样体积 进样体积小,毫微升
➢ 被分离试样可以采用流体动力学进样和电动进样 方式由毛细管一端进入。
毛细管电泳的进样技术
毛细管内径小于100μm时,注射器进样比较 困难。
(一)电动进样
(二)流体动力学进样
(一)电动进样
三 步:
❖ 毛细管的进样端插入装有试样溶液的试样管中,试 样管中插入电极,
❖ 与检测段的缓冲液间施加进样电压,并维持一定时 间,试样溶液在电泳和电渗流作用下进入毛细管,
毛细管电泳检测器
❖ 由于样品区带在高压电场作用下,迁移速度 较快,因此,CE要求所用的检测器必须具有 很快的响应速度和很高的灵敏度。 常用的检测器有:
❖ 光学检测器(紫外检测器和荧光检测器) ❖ 电化学检测器 ❖ 质谱检测器 ❖ 核磁共振检测器
紫外检测器
根据比耳定律,光度测量值A与吸收光呈成正比。 一般检测中,检测最大光程是用毛细管内径,而毛
❖ 然后再将试样溶液换成缓冲液,电泳即可进行。改 变进样电压和进样时间,便可改变进样量。
(二)流体动力学进样
流体动力学进样:也称虹吸进样、重力进样和压差 进样。
➢ 将毛细管插入试样溶液容器,通过进样端加压,或 调节进样端试样溶液液面高于出口端缓冲液液面高 度,利用虹吸现象,试样在压力差作用下进入毛细 管进样端,再把进样端放回缓冲液液槽中,进行电 泳。
检测方式 可使用多种检测器
自动化方面 自动化程度高,进样、分析及数据处理自动化
六、21世纪毛细管电泳发展趋势
对于已经发展了近20年的毛细管电泳技术来说, 在新的世纪中,仍然面l临着极大的机遇和挑战。仪 器的发展需要进一步成熟和完善.在重现性、速度 和检测灵敏度等方面还期待着重大突破。多种检测 手段的可供选择,在众多革新应用中。MS会在多 种应用领域中成为更重要和更标准的检测方法。微 全分析(p—TAS)的提出,使得集成毛细管电泳技术 (ICEC)延伸了毛细管电泳的潜力和可行性。随着人 类基因计划的重大进展.基因组学的出现和发展以 及大规模测序的需求,毛细管阵列电泳(cAE)一跃 成为承担这些任务的最佳选择之一。另外,利用离 子液体非水介质的毛细管电泳的研究也正在渐渐崛 起,同样引起了毛细管电泳工作者的极大关注。
四、影响毛细管电泳分离效率的因素
从毛细管电泳的效能(塔板数、塔板高度)及分辨率 的关系式可以看出,影响毛细管电泳与分离效率的因素很 多,下面就几个主要方面加以简要分析: ★ 峰拓宽 ★ 电渗流的控制 ★ 介质条件
峰拓宽
用σ2表示峰宽总方差,如半峰宽仅由溶质的扩散所引 的,则σ2=2DL。因此任何影响扩散系数D的因素,都会 影响峰宽。但实际上,其它因素如进样、焦耳热产生的温 度分布、电渗等都会对带宽产生明显的影响。进样会产生 自然宽度,它与进样“塞”的长度及初始形状有关,为了 减少进样增宽,导入的样品“塞”应为矩形,进样长度一 般小于毛细管分离长度的1%;电流通过毛细管内缓冲溶 液时,产生焦耳热,使温度发生变化,将引起溶液粘度的 变化及电泳、电渗性能的变化。引起温度变化的原因是电 流强度,电流增大时,管内溶液温度升高,管中心与管壁 的温差ΔT可达几十度,在毛细管内形成径向的温度梯度, 溶质在电场中的迁移速度也在管径内形成梯度,严重影响 分离效果。为了消除其影响,须将I控制在200μA以下,使 用薄壁及内径小的毛细管,并在恒温下进行电泳。
毛细管电泳装置
❖ 直流高压电源、毛细管、进样装置、检测 器和记录仪等
➢ 高压电源可对毛细管施加5~50 kV电压,操作电 压一般控制在5~30 kV范围。
➢ CE通常使用内径10~100 μm、长12~120 cm (内 涂聚酰亚胺) 弹性融凝石英毛细管,毛细管的两 端分别浸泡在含有缓冲溶液的贮液槽中,毛细管 内也充满同样的缓冲溶液。
二、毛细管电泳基本原理
CE是以高压电场为驱动力。以毛细管为分离通 道,依据样品中各组成之间淌度和分配行为上的差 异,而实现分离的一类液相分离技术。
仪器装置包括高压电源、毛细管、柱上检测器 和供毛细管两端插入又和电源相连的两个缓冲液贮 瓶,在电解质溶液中,带电粒子在电场作用下,以 不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象称电 泳。