免疫荧光技术的实验方法及其分类模板
免疫荧光技术实验报告
免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术是一种通过将荧光标记的抗体与特定抗原结合来检测和定位生物分子的方法。
本实验旨在探究免疫荧光技术的原理和应用，并通过实验验证其可行性。
一、实验原理免疫荧光技术基于抗原与抗体的特异性结合原理。
在本实验中，我们选择了一种常用的抗原-抗体反应，即兔抗小鼠IgG。
首先，将小鼠IgG注射到兔体内，兔体会产生针对小鼠IgG的抗体。
然后，将这些抗体与荧光染料标记，形成荧光标记的抗体。
当荧光标记的抗体与小鼠IgG结合时，可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
二、实验步骤1. 准备样本：将小鼠IgG溶解在缓冲液中，制备不同浓度的小鼠IgG溶液。
2. 固定标本：将小鼠IgG溶液滴加到载玻片上，使其均匀分布，并用乙醇固定。
3. 孵育抗体：将荧光标记的兔抗小鼠IgG加入载玻片上，与固定的小鼠IgG反应。
4. 清洗样本：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的抗体。
5. 观察结果：在荧光显微镜下观察载玻片上的荧光信号。
三、实验结果在实验中，我们观察到荧光显微镜下载玻片上出现了荧光信号。
荧光的强度与小鼠IgG的浓度成正比，即小鼠IgG浓度越高，荧光信号越强。
这表明荧光标记的抗体与小鼠IgG发生了特异性结合。
四、实验分析免疫荧光技术的原理是利用抗体与抗原的特异性结合来检测和定位生物分子。
在本实验中，我们成功地将荧光标记的抗体与小鼠IgG结合，形成荧光信号。
这表明免疫荧光技术可以用于检测特定抗原，并通过荧光显微镜观察到信号。
免疫荧光技术在生物医学研究中具有广泛的应用。
它可以用于检测病原体、研究细胞蛋白定位、诊断疾病等方面。
例如，在病原体检测中，可以使用荧光标记的抗体来检测病原体的存在和定位，从而提高病原体的检测灵敏度和准确性。
在细胞蛋白定位研究中，免疫荧光技术可以用于观察蛋白在细胞内的分布情况，从而揭示蛋白的功能和相互作用关系。
在疾病诊断中，荧光标记的抗体可以用于检测特定抗原的存在，从而帮助医生进行疾病的早期诊断和治疗。
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。
固定液覆盖细胞，RT 静置15min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。
四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。
4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。
PBS 5min×3次振荡洗涤。
五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。
37℃避光孵育<60min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。
PBS 5min×3次避光振荡洗涤。
七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。
八、镜检，4℃避光保存。
II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。
2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。
3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。
III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。
2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。
4、Hoechst：Hoechst33258即可。
5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法（1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡（2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min（4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。
（6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。
（11）次日取出切片，室温下复温 30min。
（12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。
（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。
（15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
（18）使用荧光显微镜进行观察拍照。
贴壁细胞免疫荧光法（1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min（2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min（3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min（5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（6）1%BSA室温封闭30min（7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类一、免疫标记法及其分类1.荧光免疫法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
免疫实验技术实验报告模板
免疫实验技术实验报告模板一、实验目的1. 掌握免疫实验技术的基本操作流程。
2. 学习如何通过免疫实验技术检测特定抗原或抗体。
3. 理解免疫实验技术在生物医学研究中的应用。
二、实验原理免疫实验技术是一种利用抗原-抗体反应的原理来检测和定量分析生物样本中的特定分子。
通过标记的抗体或抗原与目标分子结合，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光、免疫电泳等方法来检测和分析。
三、实验材料1. 待测样本：血清、组织匀浆等。
2. 试剂：特异性抗体、酶标记的二抗、底物溶液等。
3. 仪器：酶标仪、离心机、恒温水浴、显微镜等。
四、实验方法1. 样本准备：根据实验要求，将待测样本进行适当的处理和稀释。
2. 抗原-抗体反应：将待测样本与特异性抗体混合，进行孵育，使抗原与抗体结合。
3. 标记与检测：使用酶标记的二抗与一抗结合，通过底物反应产生可检测的信号。
4. 数据记录：记录实验过程中的各个时间点和条件，以及最终的检测结果。
五、实验步骤1. 样本稀释：将待测样本按照实验要求进行稀释。
2. 抗原-抗体孵育：将稀释后的样本与特异性抗体混合，放入恒温水浴中孵育一定时间。
3. 洗涤：使用缓冲液洗涤反应板，去除未结合的抗体。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，再次孵育。
5. 显色反应：加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色变化。
6. 光度测定：使用酶标仪测定各孔的吸光度，记录数据。
六、实验结果1. 数据展示：将测定的吸光度值以图表的形式展示。
2. 结果分析：根据吸光度值的变化，分析样本中目标分子的浓度或存在情况。
七、讨论1. 分析实验结果与预期的关系，讨论可能的原因。
2. 探讨实验条件对结果的影响，如孵育时间、温度等。
3. 提出实验中可能存在的问题及改进建议。
八、结论根据实验结果，得出结论。
说明免疫实验技术在检测特定抗原或抗体方面的有效性和准确性。
九、参考文献[1] 参考文献格式示例。
[2] 参考文献格式示例。
十、附录1. 实验原始记录。
免疫荧光实验报告
免疫荧光实验报告免疫荧光实验报告免疫荧光实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。
本次实验旨在研究细胞膜上的蛋白质表达情况，并通过荧光显微镜观察和分析实验结果。
实验材料和方法本实验使用的材料包括细胞培养物、PBS缓冲液、甲醛、牛血清白蛋白（BSA）、荧光标记的抗体（一抗和二抗）、荧光显微镜等。
实验方法如下：1. 细胞培养：将细胞培养物均匀地分散在培养皿中，添加适量的培养基，并将其放入恒温培养箱中培养。
2. 固定细胞：在培养皿中加入PBS缓冲液，用甲醛进行固定处理，使细胞膜上的蛋白质保持原有的结构。
3. 蛋白质封闭：将BSA溶液滴加在固定后的细胞上，使其与细胞膜结合，防止非特异性结合。
4. 一抗处理：将荧光标记的一抗滴加在细胞上，使其与目标抗原结合。
一抗可以识别特定的蛋白质或抗原。
5. 二抗处理：将荧光标记的二抗滴加在细胞上，使其与一抗结合。
二抗通常与荧光染料结合，用于增强荧光信号。
6. 荧光显微镜观察：将处理后的细胞放置在荧光显微镜下观察，通过荧光显微镜的特定波长激发荧光标记的抗体，并观察荧光信号的分布和强度。
实验结果和分析在荧光显微镜下观察，我们可以清晰地看到细胞膜上的荧光信号。
这些信号代表了目标蛋白质的表达情况和分布。
通过对不同细胞或组织的荧光信号进行定量和比较分析，我们可以得出以下结论：1. 蛋白质的表达量：荧光信号的强度反映了蛋白质在细胞膜上的表达量。
强荧光信号表示高表达，而弱荧光信号则表示低表达。
通过与对照组进行比较，我们可以判断目标蛋白质的表达水平。
2. 蛋白质的分布：荧光信号的分布情况可以告诉我们蛋白质在细胞膜上的位置。
如果荧光信号集中在细胞膜的特定区域，说明该蛋白质在该区域有高表达。
而分散的荧光信号则表示蛋白质在整个细胞膜上均匀分布。
3. 蛋白质的定位：通过与其他标记物的共定位实验，我们可以确定蛋白质在细胞膜上的具体位置。
例如，我们可以使用荧光标记的抗体与细胞核染色剂共同处理，观察荧光信号与细胞核的重叠情况，从而确定蛋白质是否定位在细胞核。
细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)
免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。
zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。
4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。
5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。
6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。
7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。
8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。
免疫荧光 标准方法
免疫荧光标准方法一、样品制备1. 选取适当的组织样品，用冷丙酮固定，并保存在-80°C。
2. 将样品切成5μm厚的切片，放置在载玻片上。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用3%的H2O2在室温下处理切片10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用0.1%的Triton X-100在室温下处理切片10分钟，以增加细胞膜的通透性。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
二、免疫荧光染色1. 用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭切片，室温下放置30分钟。
2. 取出切片，用特异性一抗溶液封闭切片，4°C孵育过夜。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用荧光二抗溶液封闭切片，室温下孵育1小时。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用DAPI染色液染色核，室温下孵育5分钟。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
8. 用抗荧光淬灭封片液封片，避免强光照射。
三、观察和记录1. 用荧光显微镜观察切片，记录荧光信号的位置、强度和分布情况。
2. 对每个样本至少观察三个不同的视野，并记录数据。
四、结果分析1. 根据荧光信号的位置、强度和分布情况进行分析。
2. 可使用图像分析软件进行定量分析。
3. 根据分析结果进行数据处理和统计。
五、标准化1. 采用阳性对照和阴性对照作为内标。
2. 阳性对照应呈现强烈的荧光信号，阴性对照应无荧光信号。
3. 对所有样本进行标准化处理，以保证结果的可靠性。
六、质量控制1. 实验过程中应避免交叉污染和样品间的干扰。
2. 对实验数据进行及时记录和分析，确保数据的准确性和完整性。
免疫荧光测试项目
免疫荧光检查可分直接法、间接法、夹心法和补体法。
1. 直接法将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10分钟后弃去，使标本保持一定湿度。
（2）滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30分钟）。
（3）取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序经过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3～5 分钟，不时振荡。
（4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
（5）立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度来判断免疫复合物的多少，常用半定量法，（-）阴性，无荧光；（±）高倍镜下似乎可见；（+）低倍镜下似乎可见，高倍镜下明显可见；（++）低倍镜下明显可见，高倍镜下清晰可见；（+++）低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；（++++）低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。
2. 间接法如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。
如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10分钟后弃去，使标本片保持一定湿度。
（2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30分钟。
（3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5分钟，不时振荡。
免疫荧光、SDS-PAGE、Western-blot实验技术
小心仔细。
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10-43
12
12-60
10
20-80
8
30-90
操作步骤：采用垂直式电泳槽装置
配制分离胶(12%)（1.0mM的玻璃板）
ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED
3.3ml 4.0ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 4.0μlห้องสมุดไป่ตู้
三、Western blotting
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的 方法，称为Southern印迹法。
间接法
1.固定 2.通透（选做） 3.封闭（选做） 4.一抗孵育 5.荧光二抗孵育 每步都需要PBS或PBST洗涤3次，每次5分钟。
补体法
利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分 子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯 基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋 白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同 密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用 考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。 因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表
免疫荧光方法
免疫荧光(Iｍmunoflｕoresｃeｎcｅ, IF)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术、它就是根据抗原抗体反应得原理,先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。
利用荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织,从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。
免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片)就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。
这一步关键得就是玻片(Ｓｌiｄes or Cｏverslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴、固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法,合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得、免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ＥLＩＳA或 Wｅsｔeｒn Ｂｌot)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键。
最后需要注意得就是,标记好荧光得细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在４℃或－20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果、由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照、总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。
基本实验步骤:(1) 细胞准备。
免疫荧光方法
免疫荧光方法免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
免疫荧光技术
免疫荧光技术
1. 常规做法：
1.从-20或-70℃冰箱中取出切片，回温（室温放置直至切片上无水汽），在切片的四周涂上指甲油，晾干。
2.洗片：0.1M PBS洗2次，每次5min。
3.穿透：0.1%或0.1%TritonX-100，0.1M PBS 洗30min。
4.封闭：10%胎牛血清,0.1%TritonX-100,0.1M PBS封闭液，室温封闭1-2小时
5.抗体稀释液稀释一抗，用量视切片的大小而定，每张切片50-200µl，抗体充分搅匀后，加在切片（放在湿盒上）上，4℃16-24小时。
6.将湿盒从冰箱中拿出，切片放入装有0.1 M PBS的盒子中洗6次，每次10min，换液时注意勿对着切片冲。
7.用抗体稀释液稀释荧光第二抗体。
抗体稀释后需充分混匀，用吸水纸吸干指甲油及其外周的水，将荧光第二抗体加入，室温孵育2~6小时。
此整个荧光抗体稀释和加的过程中注意避光！
8.将湿盒从温箱中取出，切片放入装有0.1 M PBS的盒子中洗6次，每次5min，换液时注意勿对着切片冲。
其中第三次可洗DAPI(1：1000)衬染细胞核。
9.甘油封片剂封片
10.切片可当时观察，或放在4℃冰箱中保存。
注意：1.免疫荧光技术的整个过程不能干片。
2.二抗的过程均需要避光操作。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。
2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。
6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。
10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。
11.次日取出切片，室温下复温30分钟。
12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。
14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。
贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。
2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.使用1% BSA室温封闭30分钟。
7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光技术完整版本
3 荧光抗体的鉴定：
4 ⑴ 抗体含量测定：双扩法
5
6 ⑵ 结合比率(F/P)测定：
7
分光光度法，并按下式计算：
8
FITC:
0.35×A495)
F/P=2.87×A495/(A280-
9
A280
RB和TRITC:
F/P= A515 /
10 *
F/P值高则抗体分子结合的荧光素
多。
11 *
固定标本染精品课色件 以F/P=1.5左右为宜
镜判 定结果的检测方法。
⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测
定 荧光强度而精推品课算件 被测物浓度的检测
3 荧光的产生：
4
物质吸收外界能量而进入
激发状态，在回复基态时多余的能量以电
磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为
荧光。
5
这种物质，称为荧光素
6
致荧光
由光激发所引起的荧光，为光
7
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
精品课件
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
固定剂
蛋白质 或4℃30min
95%乙醇
室温3~10min
Ig类 同上
甲醇
酶类 同上
丙酮
激素
CCl4
同上
类脂质
10%福尔马林
室温3~10min
多糖(细菌) 4℃30min
10%福尔马林
室温3~10min或
精品课件丙酮、甲醇
㈡试验类型 1 直接法 2 间接法 3 补体结合法 4 双标记法
精品课件
抗原
免疫荧光抗体检测技术
实验七免疫荧光抗体检测技术一、目的要求通过本实验，了解和掌握直接免疫荧光和间接免疫荧光染色的原理和方法，并能应用于疾病的诊断和抗原抗体的分析。
二、实验原理用化学或物理的方法将荧光素标记到抗体或抗原上，这种标记荧光素的抗体或抗原仍然能与相应抗原或抗体发生特异性结合。
通过已知的荧光抗体或抗原，检测样本中相应的抗原或抗体，从而进行疾病的诊断和对抗原抗体的分析。
间接免疫荧光试验三、实验材料感染鸡马立克病病毒（MDV）的细胞培养物，抗MDV特异性单克隆抗体BA4;丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液，盖玻片，FITC标记的抗小鼠IgG荧光抗体，0.01mol/L PBS(pH 7.2)，蒸馏水，载玻片（洁净无油）；1000ml 烧杯，磁棒，磁力搅拌器，200μL移液器，吸水纸，镊子等。
四、实验方法1.细胞片的制备与固定将消毒并处理过的盖玻片放于细胞培养瓶（皿）中，按常规操作，制备鸡胚成纤维细胞，并培养于细胞培养瓶（皿）中，待细胞生长成单层后，接种CVI988/Rispens疫苗株。
48—72h后，直接收获盖片，用PBS洗涤1次，再以-20℃预冷的丙酮-乙醇（6:4，V/V）固定液固定5min，空气干燥，置密封容器于-20℃保存备用。
如用96孔或24孔细胞培养板培养的细胞，可弃去培养液，用PBS洗涤1次，然后固定，固定方法同上。
2.抗体染色⑴将接种并固定的MDV病毒的盖玻片，用PBS洗涤1次，置架上。
取未接种MD病毒的盖玻片，同上用PBS洗涤1次，置架上，作为阴性对照。
盖玻片上滴加10μL—20μL工作浓度的单克隆抗体，96孔细胞培养板加入50μL/孔工作浓度的单克隆抗体。
37℃水浴孵育30—45min。
⑵盖玻片在PBS（Ph7.4,0.01mol/L）中用磁力搅拌器洗涤5—10min，如用96孔细胞培养板检测，则加入PBS 200μL/孔，洗涤3—4次。
⑶取出盖片置架上，滴加工作浓度的荧光抗体（FITC标记的抗小鼠IgG的抗体）。
免疫荧光检测
免疫荧光SOP一．总纲（一）技术原理免疫荧光技术（immunofluorescence，IF）。
基本原理是抗原与抗体特异性结合，具体为带荧光标记的抗体在组织细胞上与抗原特异性结合，在荧光显微镜下，对抗原进行定性、定位和定量检测的技术。
（二）研究进展二．实验操作免疫荧光基本操作流程如下：（一）切片脱蜡水化脱蜡水化的目的是将石蜡包裹住的抗原暴露于与抗体结合的水环境中，便于两者结合。
若脱蜡和水化不全，则易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。
1.实验操作如下：（1）烤片：将石蜡切片置于烤箱中烤片60min；（2）脱蜡：入二甲苯5min×3；（3）水合：100%乙醇，5min×2；95%乙醇5min；70%乙醇5min；ddH2O浸洗5min×2。
2.技术要点：（1）注意无水乙醇和二甲苯的新旧程度，若出现雾状，则需及时更换；（2）60℃烘箱烤片时间勿过久（二）抗原修复与封闭液封闭由于固定液和石蜡导致组织蛋白的氨基酸残基在分子内或分子间形成醛基，或发生蛋白交联，导致蛋白质三级结构或四级结构改变，出现空间位阻，从而封闭抗原决定簇，阻碍抗体与抗原的结合。
因此，需要进行抗原修复暴露抗原。
修复方法有很多种，常见的为高温高压修复法。
封闭目的为细胞表面（特别是淋巴造血组织、淋巴细胞、单核细胞等）存在Fc受体，可与抗体（Ig）结合，形成非特异性染色。
主要是与二抗的非特异性结合。
可用5%二抗来源动物种属的正常血清或5%BSA，可避免抗体蛋白吸附于组织切片中高电荷的胶原和结缔组织成分上，用于封闭组织切片的蛋白疏水基团。
1.实验操作如下：抗原修复以高温高压修复为例。
实验材料：柠檬酸盐组织抗原修复液（福州迈新），EDTA高温抗原修复（福州迈新），电压力锅（美的MY-12CH402A）A.柠檬酸盐高压抗原修复：（1）将商品化的柠檬酸盐缓冲液按说明书进行稀释，并调节pH至6.0；（2）将装有抗原修复液的修复盒置于已装有自来水的高压锅中，大火加热至沸腾；（3）将水化后的切片置于修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热中喷气，此时开始计时5min，压力锅断开电源，开气阀开盖；（4）取出修复盒自然冷却至室温。
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免疫荧光技术的实验方法及其分类
一、免疫标记法及其分类
1.荧光免疫法
原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮, 检测产物发出的荧光, 荧光强度与Mb浓度呈正比, 可在
8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好, 线性范围宽, 具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例, 首先将特异性抗体与固相载体连接, 形成固相抗体。
除去未结合抗体, 然后加受检标本, 使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物, 接着加入荧光标记的抗体, 使之与抗原特异性结合, 形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度, 即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大, 时间分辨荧光免
疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕, 作为标记物, 加入正常液后激发测定, 能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原, 竞争性地与抗体结合, 形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物, 并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后经过离心沉淀等方法, 将抗原—抗体复合物与游离抗原分离, 分别测定其放射性强度与标准曲线比较, 即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强, 可准确定量到
ng/ml水平。
但早期的方法操作麻烦, 耗时长, 且有放射性污染。
近年来, 随着单克隆抗体的应用, RIA的灵敏度又有了较大提高, 且操作大为简化, 并已有商品试剂盒供应, 使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)
ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立, 该法的最低检测限为10μg/L, 线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高, 特异性强, 精密度好, 操作简单, 适用于多份标本的检测, 不需特殊仪器设备等优点, 易于推广普及。
但不适合急诊的快速检测。
以双抗法为例。
首先包被抗原, 然后加入一抗, 使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。
接着加入酶标二抗, 形成抗原—抗体—抗体复合物。
最后加入底物, 由酶催化底物生成产物。
经过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。
4.偶联生物素—亲和素系统的酶免法
利用了一个亲和素分子能够与4个生物素分子结合的特性, 使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。
5.时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析(Time resolved Fluor immunoassay, TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术, 它用镧系元素标记抗原或抗体, 根据镧系元素螯合物的发光特点, 用时间分辨技术测量荧光, 同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨, 可有效地排除非特
异荧光的干扰, 极大地提高了分析灵敏度。
6.解离增强镧系元素荧光免疫分析
解离增强镧系元素荧光免疫分析(Dissociation Enhanced。