液相色谱柱的使用常识1版

液相色谱柱的使用常识

色谱柱信息 (1)

安装色谱柱 (2)

平衡色谱柱 (2)

平衡色谱柱的意义（反相柱、硅胶柱、极性柱） (2)

平衡色谱柱的方法 (2)

色谱柱的保存 (3)

色谱柱的再生 (4)

色谱柱的维护 (4)

液相色谱工作中和色谱柱有关的故障及解决办法 (5)

色谱柱信息

从色谱柱上的标签可以至少获得以下一些信息：

1）生产商、商品名称、规格、货号（Part No.）、填料类型、批次、柱号。

其中，生产商、商品名称、规格和货号，方便下次采购同样产品，对于药物质检这是常见的需求。

而填料类型、批次和柱号，是发现新柱存在质量问题时联系销售商或生产商时重要和必需的信息之一。原因：批次，往往与填料信息密切相关，填料是一批批生产出来的，重现性上的严重缺陷可能是某个批次填料的整体问题，提供批次信息，可以帮助技术服务人员在第一时间查询全球是否有同样批次的投诉报告；柱号，是这根柱子的“身份证”，换柱和退柱时的必需信息，也是实验室器材管理应当记录存档的必要信息。

2）流向。绝大部分色谱柱都有方向的要求。应当仔细检查，按流向标志将色谱柱接入HPLC 系统。

注意在使用此色谱柱的过程中不要遗失、毁坏或沾污这个标签，以便在使用过程中出现问题时我们可以对该柱子的生产过程进行追溯。为方便管理，还可以自行在柱上贴一些管理标签，如购入时间、负责人员，等。

贴心提示：

①当您接到一根新的色谱柱时，要阅读并保存好使用说明书（使用前应当至少阅读一遍）、

出厂技术证书或分析测试报告（Certificate of Analysis），有时为两份，一份是该批次填料

选择性测试报告，一份是该柱的柱效测试报告。

②您可以为色谱柱建立技术档案，其中包括：厂方提供的技术指标、复核验收指标、使用情况记录、使用过程中难免出现的各种问题及处理方法。便于追踪事故原因。尽可能专柱专用，并固定操作人员。质检部门，还可以根据使用档案估算柱寿命，提前进行申请和购买。

安装色谱柱

液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。

根据标签上的方向将色谱柱连接到泵（箭头指向检测器的方向），请使用PEEK材料的接头，以避免不锈钢接头对柱子的PEEK材料的接口造成磨损。当色谱柱使用一段时间后，应将色谱柱反向冲洗，以洗去柱头的杂质或颗粒。

注意：清洗时断开检测器。

平衡色谱柱

平衡色谱柱的意义（反相柱、硅胶柱、极性柱）

由于色谱柱在储存或运输过程中，保存色谱柱的溶剂有可能挥发而造成固定相部分干掉，这会引起键合相的空间结构发生变化。因此，新的色谱柱在用流动相分析样品之前，请一定要充分平衡色谱柱。

平衡色谱柱的方法

☆反相色谱柱：

在经过出厂测试后是保存在乙腈/水的流动相体系中的，

①在平衡之前，请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶；

②新柱应先以10－20倍柱体积的5％甲醇或纯乙腈作流动相冲洗色谱柱。

③如果您所使用的流动相中含有缓冲盐或离子对试剂，应注意在乙腈冲洗后用高比例水"过渡"。即每天分析开始前必须先用高比例水冲洗30分钟以上（防止盐析出），再用缓冲盐流动相平衡；分析结束后必须先用高比例水冲洗30分钟以上，除去缓冲盐之后再用甲醇冲洗30分钟（保护柱子）。

☆硅胶柱或极性色谱柱

在经过出厂测试后是保存在正己烷的流动相体系中的，相对于反相色谱柱来说，需要更长的时间来平衡。如果极性色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相平衡之前用异丙醇平衡。即每天分析开始前必须先用异丙醇冲洗10-20倍柱体积，再换用流动相平衡；分析结束后必须先用异丙醇冲洗10-20倍柱体积后再用正己烷冲洗30分钟（保护柱子）。

贴心提示：

①在确定分析样品的流动相时，要确保您使用的流动相和保存色谱柱的流动相互溶

②平衡过程中，将流速缓慢地提高，首先用低流速0.2ml/min将色谱柱平衡过夜（注意：断开检测器）；然后，将流速增加到1ml/mol冲洗30分钟，以便将色谱柱的填料充分平衡至最佳状态。可以保证色谱柱的使用寿命，并且保证在以后的使用中，获得分析结果的重现性。

③再用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂的流速如果较低，则需要较长的时间来平衡）

④请注意将预柱和分析柱一起平衡

⑤每天用足够的时间以流动相来平衡色谱柱，您就会在处理问题方面获得最大的"补偿"，而且您的色谱柱的寿命也会变得更长！

色谱柱的保存

A．几天之内的短期放置，应先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗) ，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。

B．如果色谱柱长期不用，应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。

C．色谱柱应贮存在4℃-室温下，如果放置于0℃以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。D．注意溶剂的PH值，一般硅胶基质的色谱柱控制在2～8范围内。

贴心提示：

①首先柱子必须清洗干净后才能贮存，柱子不能贮存在水或水性溶剂中，否则会引起微生物的滋生。

②如果您使用的流动相中含有盐，请首先用高比例水冲洗（3%-5%有机相，1ml/min流速，冲洗30至40分钟），然后再用纯乙腈冲洗30分钟

③一定要将色谱柱的两端封严, 以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，引起柱子结构的几何学改变，这可导致柱效的严重降低。

色谱柱的再生

色谱柱在使用一段时间后柱效会下降，这时可以考虑对色谱柱进行再生。进行色谱柱再生时，应使用一个廉价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。

再生处理包括活化(右→左) 和净化(左→右) 两种。

请根据下表选择您的再生方法：

极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：

正庚烷←→氯仿←→乙酸乙酯←→丙酮←→乙醇←→水** 非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：

水←→乙腈←→氯仿（或异丙醇）←→乙腈←→水

0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱

注意：

*在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。

**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱的维护

1.请使用专用的整体化预柱

2.使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

3．避免流动相组成及极性的剧烈变化

4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理

5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，保存在乙腈中贴心提示：