年龄_基础FSH_窦卵泡数预测卵巢储备功能的临床研究_李晓晴
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快速、经济、安全、高效地从临床人体血液标本中提取高 产量、高纯度的基因组 DNA，对于遗传性疾病的基因诊断，尤 其是通过母体外周血液诊断胎儿遗传性疾病及其它分子生 物学实验都至关重要［5］。制备理想的 DNA 的提取方法符合 以下标准： ①快速经济； ②有利于环境安全，最好不用有机溶 剂； ③产生高质量 DNA； ④可应用于冷冻标本。从上述结果 分析，经典的酚 / 氯仿法提取 DNA 不仅操作过于繁琐、费时 间，标本需要量大以外所得到的纯度、总量的影响上都存在 欠缺。所以采用全血基因组 DNA 小量快速提取试盒法提取 DNA 操作简单，节时，对于微量标本也能获得所需的 DNA， 同时结果更为稳定。我们提取的 DNA 主要是应用于基因扩 增、酶切分析、基因多态性等方面的研究，都能够到达我们的 实验要求。因此采用全血基因组 DNA 小量快速提取试盒法 提取 DNA 是一种值得推广的抽提 DNA 的好方法。
参考文献
［1］胡婧，袁媛，陈思礼． 全血基因组 DNA 3 种提取方法的比较［J］． 中南民族大学学报（ 自然科学版） ，2008，27（ 2） ∶ 25．
［2］焦鹏叶，文静，常起，等． 从血液中提取 DNA 方法讨论［J］． 实用 医技杂志，2007，14（ 3） ∶ 287 － 289．
［3］萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF． 分子克隆实验指南［M］． 2 版． 北京： 科学出版社，1995．
中国优生与遗传杂志 2013 年第 21 卷第 12 期
·129·
年龄、基础 FSH、窦卵泡数预测卵巢储备功能的临床研究
李晓晴，王 莹 （ 湖北省荆州市中心医院生殖中心，434000）
摘 要： 目的 评价年龄、基础 FSH 和窦卵泡数预测卵巢储备功能的价值。方法 将入选的 158 例患者按卵巢反应性
表 1 两种方法提取基因组 DNA 的纯度、产量、耗时的比较
方法
每个样本 耗时（ h）
纯度
DNA 产量 所需血液 （ mg / L） 量（ μl）
Leabharlann Baidu
经典的酚 /氯仿法
6 － 8 1. 65 ± 0. 12 28. 3 ± 3. 02 200
全血基因组 DNA 小量快速提取试盒法
1 1． 86 ± 0. 15 33． 8 ± 3. 24 100
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
（ 上接第 129 页）
［4］王薇，邵超鹏． 全血 DNA 快速提及其在 HLA 基因型中的应用 ［J］． 深圳医学，1998，11 （ 1） ∶ 5．
［5］Xu Weichen，Zhang Ｒunxu，Bai Yanqu，et al． DNApurification on a lab － on － valve system incorporating are new able micro column with in situ monitoring by laser － induced fluorescence ［J］． Analytical and Bionalytical Chemistry，2007，388 （ 1） ∶ 157 － 163． 收稿日期： 2013 － 08 － 01
取试剂盒抽提 DNA 纯度高、且实验操作时间短，所需血液量 也少； 经典的酚/ 氯仿法抽提 DNA 操作时间长，所需血液量多。 2. 2 凝胶电泳检测结果 用 0． 8% 的琼脂糖凝胶电泳分别检测 两种方法提取的 DNA 模板，在紫外灯可见全血基因组 DNA 小 量快速提取试盒法提取 DNA 电泳带整齐，荧光较强； 用经典的 酚 / 氯仿法提取 DNA 电泳带欠整齐，有拖尾现象，荧光较弱。 3讨论
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中国优生与遗传杂志 2013 年第 21 卷第 12 期
1． 4. 2. 1 量取 100μl 新鲜抗凝全血，再加入 100μl 裂解液和 20μl Ｒnase / 蛋白酶 K 液，迅速充分震荡混匀，置于 55℃ 温浴 30 － 45min。期间来回颠倒离心管数次； 1． 4. 2. 2 加入 10μl 3M NaAc（ pH = 4． 8） ，随后加入 1250μl 结 合缓冲液，充分震荡混匀，12000rpm 离心 2 － 3min，将上清用 Tip 直接加入到离心吸附柱中去，放置 1min，12000rpm 离心 30s； 1． 4. 2. 3 倒掉收集管中的废液，再加入 600μl 漂洗缓冲液， 12000rpm 离心 30s； 1． 4. 2． 4 重复步骤（ 1． 4. 2. 3） 1 次至 2 次。最后一次漂洗倒 掉废液后应于 12000rpm 离心 3min 以充分除去漂洗缓冲液； 1． 4. 2. 5 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的 1. 5ml Eppendorf 离心管，并加入 50μl 洗脱缓冲液。放置 1min 后， 于 12000rpm 离心 30s。取出 Eppendorf 离心管，其中便是所 提取基因组 DNA。放置 － 20℃ 保存。 1. 5 紫外分光光度仪检测 采用紫外分光光度仪测定基因 组 DNA 的紫外吸收峰，计算 DNA 的浓度和纯度，以吸收度 （ OD） 值表示。DNA 纯度以 OD260 / OD280 比值为依据，DNA = OD260 × 50 × 稀释倍数。 1. 6 基因组 DNA 电泳鉴定 取 DNA 样品 5μl，加电泳上样 缓冲液 5μl，在 0． 8% 琼脂糖凝胶上，进行平板电泳，用 DNA 作为标准，若 DNA 区带比较集中，泳动速度与 DNA 相同或 稍慢，即可证明 DNA 分子量大于 50kb。 1. 7 统计学处理 采用 SPSS13. 0 统计学软件进行处理，两 种方法均重复 3 次，采用统计学 t 检验，测得计量资料以数据 以均数 ± 标准差（ x ± s） 表示，P ＜ 0. 05 为有显著性差异。 2结果 2. 1 核酸蛋白定量仪检测结果 2 种方法提取 DNA 的纯 度、产量及血液需要量见表 1。全血基因组 DNA 小量快速提
关键词： 卵巢储备功能； 年龄； 基础 FSH； 窦卵泡数
中图分类号： Ｒ321 － 33
文献标识码： A
文章编号： 1006 － 9534 （ 2013） 12 － 0129 － 02
随着社会的发展，婚育年龄的增大，女性不孕的发病率 呈现出不断上升的趋势，而辅助生殖技术现已被广泛应用在 不孕症的治疗中，但其疗效远未达到患者理想的期望值，其 成功与否的关键之一就是准确评估卵巢的储备功能［1，2］。目 前对卵巢储备功能的预测方法尚有较多争议，故本文旨在进 一步研究年龄、基础 FSH 及窦卵泡数在 IVF － ET / ICSI 治疗 中对卵巢储备功能的预测价值。 1 资料与方法 1. 1 研究对象 2010. 11 － 2011. 10 间在本生殖中心接受 IVF － ET / ICSI 助 孕 治 疗 的 不 孕 症 患 者 158 例，平 均 年 龄 （ 28. 78 ± 2. 75） 岁。 1. 2 COS 方案 均采用 GnＲH － a / FSH / HMG / HCG 长方案 超促 排 卵，当 主 导 卵 泡 直 径 达 18mm 时，肌 内 注 射 HCG 10000U，36h 后穿刺取卵。 1. 3 研究指标 1. 3. 1 基础卵泡刺激素（ bFSH） 水平测定 在 IVF － ET / ICSI 前 1 ～ 2 周期采用放射免疫法于月经周期第 1 ～ 3d 测定血 清 bFSH。 1. 3. 2 窦卵泡数测定 所有患者在接受 IVF － ET / ICSI 前 1 ～ 2 周期，于月经周期 d3 采用 Aloka 超声诊断仪行常规阴道 超声检查，计数直径 0. 3 － 1. 0cm 的窦卵泡数。 1． 4 分组方法 按卵巢反应性分为 A 组（ 卵巢低反应组，获 卵数≤4 个） ，B 组（ 卵巢正常反应组，获卵数 ＞ 4 个） 。 1. 5 统计学方法 采用 SPSS 统计软件分析，计量资料比较 采用 t 检验。 2结果
卵巢内存留卵泡的数量和质量，反映女性的生育能力。Menken［3］等研究发现，35 岁以上女性生育潜能明显下降，主要与 卵子质量异 常 和 卵 巢 内 可 募 集 的 卵 泡 数 减 少 有 关，在 接 受 IVF 或 ICSI 治疗中，发生卵巢低反应及周期取消的机会明显 增加。邓波等［4］研究发现，女性生育潜能在 35 岁前无显著 性改变，而在 35 岁以后出现明显的下降： 窦卵泡数明显下 降，卵泡刺激素用药量及刺激时间和周期取消率明显上升。 并且卵巢反应不良组患者的年龄与反应正常组间存在显著 性差异。本研究结果也显示，卵巢低反应组与正常反应组间 年龄存在显著性差异，说明年龄可用于预测卵巢的反应性。 3. 2 基础 FSH 对卵巢储备功能的预测价值 基础 FSH 是 指在自然周期早卵泡期即月经周期第 3 天测定的 FSH 基础 值，由于其反映了 INHB、E2 负反馈的强度，因此可以提示卵 巢储备功能。基础 FSH 水平升高是卵巢不排卵、卵巢储备能 力下降的早期信号。赵旭等［5］将 IVF － ET 的患者根据获卵 数分为卵巢 低 反 应 组 和 正 常 反 应 组，单 因 素 分 析 和 多 因 素 Logistic 回归分析均显示，随着年龄增长，bFSH 水平升高，卵 巢低反应增加，而 bE2 水平与卵巢反应性无关。陈静等［6］发 现，正常妇女的 FSH 值明显小于卵巢功能下降患者，在年龄 ≥35 岁者中，FSH 的增高非常显著，相应阶段的卵泡数目也 显著减少，表明 FSH 对于卵巢储备功能有较好的预测价值。 本研究结果 也 显 示，卵 巢 低 反 应 组 与 正 常 反 应 组 之 间 基 础 FSH 有显著性差异，说明基础 FSH 值可预测卵巢反应性。 3. 3 窦卵泡数对卵巢储备功能的预测价值 近年来许多研 究报道了卵巢的超声研究指标对卵巢低反应性的预测价值， 认为基础窦卵泡计数是其中一个较好的超声预测指标，在辅 助生殖中对卵巢低反应具有预测价值。Bancsi 等［7］ 研究月 经第 3 天窦卵泡数≤4 个或卵巢体积≤3cm3 或二者并存时， IVF 周期取消率上升，取卵数、妊娠率明显下降，认为 AFC 是 预测卵巢低反应性的 最 佳 指 标。 符 淳 等［8］ 研 究 发 现 卵 巢 反 应正常者的窦卵泡数目明显多于卵巢反应差者，卵巢反应差 者临床妊娠率低，用两种促卵泡发育药物的机率卵巢反应差 者明显多于卵巢反应正常者。比较两者的 95% 的可信区间， 不难发现在本中心治疗的患者中，月经第 3 天双侧卵巢的窦 卵泡数 9 个以下者往往提示卵巢反应较差。从本研究结果 中可见，卵巢低反应组窦卵泡数平均为（ 8． 82 ± 2. 25） 个，正常 反应组窦卵泡数平均为（ 11. 25 ± 2. 68） 个，两组之间相比，差
以获卵数判断卵巢反应性，低反应与正常反应周期间年 龄、基础 FSH 及窦卵泡数方面比较，均有显著性差异 （ P ＜ 0. 05） 。见表 1。
表 1 不同获卵数的 IVF － ET / ICSI 周期的各参数情况
分组 例数 A 组 36 B 组 122
t P
年龄（ 岁） 29. 26 ± 3. 24 28. 15 ± 2. 56
分为 A 组 （ 卵巢低反应组，获卵数≤4 个） ，B 组 （ 卵巢正常反应组，获卵数 ＞ 4 个） ，比较两组之间年龄、基础 FSH 和窦
卵泡数。结果 年龄、基础 FSH 和窦卵泡数各指标两组之间差异均有统计学意义 （ P ＜ 0. 05） 。结论 年龄、基础 FSH 和
窦卵泡数对于卵巢的储备功能有较好的预测价值。
2. 15 ＜ 0. 05
bFSH（ mIU / ml） 8. 53 ± 4. 05 6. 65 ± 3. 55 2. 70 ＜ 0. 01
窦卵泡数（ 个） 8． 82 ± 2. 25 11. 25 ± 2. 68 4. 95 ＜ 0. 01
3讨论 3. 1 年龄对卵巢储备功能的预测价值 卵巢储备功能是指
参考文献
［1］胡婧，袁媛，陈思礼． 全血基因组 DNA 3 种提取方法的比较［J］． 中南民族大学学报（ 自然科学版） ，2008，27（ 2） ∶ 25．
［2］焦鹏叶，文静，常起，等． 从血液中提取 DNA 方法讨论［J］． 实用 医技杂志，2007，14（ 3） ∶ 287 － 289．
［3］萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF． 分子克隆实验指南［M］． 2 版． 北京： 科学出版社，1995．
中国优生与遗传杂志 2013 年第 21 卷第 12 期
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年龄、基础 FSH、窦卵泡数预测卵巢储备功能的临床研究
李晓晴，王 莹 （ 湖北省荆州市中心医院生殖中心，434000）
摘 要： 目的 评价年龄、基础 FSH 和窦卵泡数预测卵巢储备功能的价值。方法 将入选的 158 例患者按卵巢反应性
表 1 两种方法提取基因组 DNA 的纯度、产量、耗时的比较
方法
每个样本 耗时（ h）
纯度
DNA 产量 所需血液 （ mg / L） 量（ μl）
Leabharlann Baidu
经典的酚 /氯仿法
6 － 8 1. 65 ± 0. 12 28. 3 ± 3. 02 200
全血基因组 DNA 小量快速提取试盒法
1 1． 86 ± 0. 15 33． 8 ± 3. 24 100
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
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［4］王薇，邵超鹏． 全血 DNA 快速提及其在 HLA 基因型中的应用 ［J］． 深圳医学，1998，11 （ 1） ∶ 5．
［5］Xu Weichen，Zhang Ｒunxu，Bai Yanqu，et al． DNApurification on a lab － on － valve system incorporating are new able micro column with in situ monitoring by laser － induced fluorescence ［J］． Analytical and Bionalytical Chemistry，2007，388 （ 1） ∶ 157 － 163． 收稿日期： 2013 － 08 － 01
取试剂盒抽提 DNA 纯度高、且实验操作时间短，所需血液量 也少； 经典的酚/ 氯仿法抽提 DNA 操作时间长，所需血液量多。 2. 2 凝胶电泳检测结果 用 0． 8% 的琼脂糖凝胶电泳分别检测 两种方法提取的 DNA 模板，在紫外灯可见全血基因组 DNA 小 量快速提取试盒法提取 DNA 电泳带整齐，荧光较强； 用经典的 酚 / 氯仿法提取 DNA 电泳带欠整齐，有拖尾现象，荧光较弱。 3讨论
（ 下转第 60 页）
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中国优生与遗传杂志 2013 年第 21 卷第 12 期
1． 4. 2. 1 量取 100μl 新鲜抗凝全血，再加入 100μl 裂解液和 20μl Ｒnase / 蛋白酶 K 液，迅速充分震荡混匀，置于 55℃ 温浴 30 － 45min。期间来回颠倒离心管数次； 1． 4. 2. 2 加入 10μl 3M NaAc（ pH = 4． 8） ，随后加入 1250μl 结 合缓冲液，充分震荡混匀，12000rpm 离心 2 － 3min，将上清用 Tip 直接加入到离心吸附柱中去，放置 1min，12000rpm 离心 30s； 1． 4. 2. 3 倒掉收集管中的废液，再加入 600μl 漂洗缓冲液， 12000rpm 离心 30s； 1． 4. 2． 4 重复步骤（ 1． 4. 2. 3） 1 次至 2 次。最后一次漂洗倒 掉废液后应于 12000rpm 离心 3min 以充分除去漂洗缓冲液； 1． 4. 2. 5 小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的 1. 5ml Eppendorf 离心管，并加入 50μl 洗脱缓冲液。放置 1min 后， 于 12000rpm 离心 30s。取出 Eppendorf 离心管，其中便是所 提取基因组 DNA。放置 － 20℃ 保存。 1. 5 紫外分光光度仪检测 采用紫外分光光度仪测定基因 组 DNA 的紫外吸收峰，计算 DNA 的浓度和纯度，以吸收度 （ OD） 值表示。DNA 纯度以 OD260 / OD280 比值为依据，DNA = OD260 × 50 × 稀释倍数。 1. 6 基因组 DNA 电泳鉴定 取 DNA 样品 5μl，加电泳上样 缓冲液 5μl，在 0． 8% 琼脂糖凝胶上，进行平板电泳，用 DNA 作为标准，若 DNA 区带比较集中，泳动速度与 DNA 相同或 稍慢，即可证明 DNA 分子量大于 50kb。 1. 7 统计学处理 采用 SPSS13. 0 统计学软件进行处理，两 种方法均重复 3 次，采用统计学 t 检验，测得计量资料以数据 以均数 ± 标准差（ x ± s） 表示，P ＜ 0. 05 为有显著性差异。 2结果 2. 1 核酸蛋白定量仪检测结果 2 种方法提取 DNA 的纯 度、产量及血液需要量见表 1。全血基因组 DNA 小量快速提
关键词： 卵巢储备功能； 年龄； 基础 FSH； 窦卵泡数
中图分类号： Ｒ321 － 33
文献标识码： A
文章编号： 1006 － 9534 （ 2013） 12 － 0129 － 02
随着社会的发展，婚育年龄的增大，女性不孕的发病率 呈现出不断上升的趋势，而辅助生殖技术现已被广泛应用在 不孕症的治疗中，但其疗效远未达到患者理想的期望值，其 成功与否的关键之一就是准确评估卵巢的储备功能［1，2］。目 前对卵巢储备功能的预测方法尚有较多争议，故本文旨在进 一步研究年龄、基础 FSH 及窦卵泡数在 IVF － ET / ICSI 治疗 中对卵巢储备功能的预测价值。 1 资料与方法 1. 1 研究对象 2010. 11 － 2011. 10 间在本生殖中心接受 IVF － ET / ICSI 助 孕 治 疗 的 不 孕 症 患 者 158 例，平 均 年 龄 （ 28. 78 ± 2. 75） 岁。 1. 2 COS 方案 均采用 GnＲH － a / FSH / HMG / HCG 长方案 超促 排 卵，当 主 导 卵 泡 直 径 达 18mm 时，肌 内 注 射 HCG 10000U，36h 后穿刺取卵。 1. 3 研究指标 1. 3. 1 基础卵泡刺激素（ bFSH） 水平测定 在 IVF － ET / ICSI 前 1 ～ 2 周期采用放射免疫法于月经周期第 1 ～ 3d 测定血 清 bFSH。 1. 3. 2 窦卵泡数测定 所有患者在接受 IVF － ET / ICSI 前 1 ～ 2 周期，于月经周期 d3 采用 Aloka 超声诊断仪行常规阴道 超声检查，计数直径 0. 3 － 1. 0cm 的窦卵泡数。 1． 4 分组方法 按卵巢反应性分为 A 组（ 卵巢低反应组，获 卵数≤4 个） ，B 组（ 卵巢正常反应组，获卵数 ＞ 4 个） 。 1. 5 统计学方法 采用 SPSS 统计软件分析，计量资料比较 采用 t 检验。 2结果
卵巢内存留卵泡的数量和质量，反映女性的生育能力。Menken［3］等研究发现，35 岁以上女性生育潜能明显下降，主要与 卵子质量异 常 和 卵 巢 内 可 募 集 的 卵 泡 数 减 少 有 关，在 接 受 IVF 或 ICSI 治疗中，发生卵巢低反应及周期取消的机会明显 增加。邓波等［4］研究发现，女性生育潜能在 35 岁前无显著 性改变，而在 35 岁以后出现明显的下降： 窦卵泡数明显下 降，卵泡刺激素用药量及刺激时间和周期取消率明显上升。 并且卵巢反应不良组患者的年龄与反应正常组间存在显著 性差异。本研究结果也显示，卵巢低反应组与正常反应组间 年龄存在显著性差异，说明年龄可用于预测卵巢的反应性。 3. 2 基础 FSH 对卵巢储备功能的预测价值 基础 FSH 是 指在自然周期早卵泡期即月经周期第 3 天测定的 FSH 基础 值，由于其反映了 INHB、E2 负反馈的强度，因此可以提示卵 巢储备功能。基础 FSH 水平升高是卵巢不排卵、卵巢储备能 力下降的早期信号。赵旭等［5］将 IVF － ET 的患者根据获卵 数分为卵巢 低 反 应 组 和 正 常 反 应 组，单 因 素 分 析 和 多 因 素 Logistic 回归分析均显示，随着年龄增长，bFSH 水平升高，卵 巢低反应增加，而 bE2 水平与卵巢反应性无关。陈静等［6］发 现，正常妇女的 FSH 值明显小于卵巢功能下降患者，在年龄 ≥35 岁者中，FSH 的增高非常显著，相应阶段的卵泡数目也 显著减少，表明 FSH 对于卵巢储备功能有较好的预测价值。 本研究结果 也 显 示，卵 巢 低 反 应 组 与 正 常 反 应 组 之 间 基 础 FSH 有显著性差异，说明基础 FSH 值可预测卵巢反应性。 3. 3 窦卵泡数对卵巢储备功能的预测价值 近年来许多研 究报道了卵巢的超声研究指标对卵巢低反应性的预测价值， 认为基础窦卵泡计数是其中一个较好的超声预测指标，在辅 助生殖中对卵巢低反应具有预测价值。Bancsi 等［7］ 研究月 经第 3 天窦卵泡数≤4 个或卵巢体积≤3cm3 或二者并存时， IVF 周期取消率上升，取卵数、妊娠率明显下降，认为 AFC 是 预测卵巢低反应性的 最 佳 指 标。 符 淳 等［8］ 研 究 发 现 卵 巢 反 应正常者的窦卵泡数目明显多于卵巢反应差者，卵巢反应差 者临床妊娠率低，用两种促卵泡发育药物的机率卵巢反应差 者明显多于卵巢反应正常者。比较两者的 95% 的可信区间， 不难发现在本中心治疗的患者中，月经第 3 天双侧卵巢的窦 卵泡数 9 个以下者往往提示卵巢反应较差。从本研究结果 中可见，卵巢低反应组窦卵泡数平均为（ 8． 82 ± 2. 25） 个，正常 反应组窦卵泡数平均为（ 11. 25 ± 2. 68） 个，两组之间相比，差
以获卵数判断卵巢反应性，低反应与正常反应周期间年 龄、基础 FSH 及窦卵泡数方面比较，均有显著性差异 （ P ＜ 0. 05） 。见表 1。
表 1 不同获卵数的 IVF － ET / ICSI 周期的各参数情况
分组 例数 A 组 36 B 组 122
t P
年龄（ 岁） 29. 26 ± 3. 24 28. 15 ± 2. 56
分为 A 组 （ 卵巢低反应组，获卵数≤4 个） ，B 组 （ 卵巢正常反应组，获卵数 ＞ 4 个） ，比较两组之间年龄、基础 FSH 和窦
卵泡数。结果 年龄、基础 FSH 和窦卵泡数各指标两组之间差异均有统计学意义 （ P ＜ 0. 05） 。结论 年龄、基础 FSH 和
窦卵泡数对于卵巢的储备功能有较好的预测价值。
2. 15 ＜ 0. 05
bFSH（ mIU / ml） 8. 53 ± 4. 05 6. 65 ± 3. 55 2. 70 ＜ 0. 01
窦卵泡数（ 个） 8． 82 ± 2. 25 11. 25 ± 2. 68 4. 95 ＜ 0. 01
3讨论 3. 1 年龄对卵巢储备功能的预测价值 卵巢储备功能是指