三代测序技术发展及其他
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引物片段的大小，从而把不同位点的检测结果区分开。
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
3. SNP: SNPlex SNPlex Genotyping System是基于荧光检测方法来进行。
20
源自文库
基于ABI3730xl平台的扩展应用
21
第二代测序平台
454 (GS-FLX) Solexa SOLiD
22
454 (GS-FLX)
➢ 原理： 依赖于核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放。该技术是由
波尔·尼伦和穆斯塔法·罗纳吉于1996年在斯德哥尔摩的 皇家工学院发展出来的。
➢ 454的突破之处： 将试剂和模板统统都吸附在一个个微珠上，然后把
Fragment4
Fragment3
Fragment2
Fragment1
Legend：
Primer Fragment
10
基于ABI3730xl平台的扩展应用
1. Gene Synthesis：
protein/DNA sequence of interest design oligos order oligos Run 1st round PCR (assembly) Run 2nd round PCR (amplification) ligate into vector, transform Pick colony and screen recombinants by colony PCR Sequencing recombinants Plasmid minipreparation ~4 day between PCR amplification and sequencing-confirmed plasmid (at best!!)
11
基于ABI3730xl平台的扩展应用
2. STR: STR/SSR:
是由长度为2-7个碱基的核苷酸序列重复构成的多态 性DNA标记，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度 可变性，因此在同一个基因位点创造了多个不同的等位 基因。微卫星分析通常被用来创建遗传图谱，连锁分析 以及对遗传性状的追踪。
原理：在一端引物上标记特定的荧光,通过PCR产物长度大 小，检测基因型.
5
ddNTPs参与下的DNA复制
Sanger法测序产物的平均 链长取决于ddNTP：dNTP的比例,
比例高时，得到较短的产物； （BigDye， HiDi）
“标记／终止法”测序产物 的平均长度可通过标记反应中
dNTP浓度(高浓度能得到长的 产物)或终止反应的 ddNTP:dNTP来调整。
6
Sanger第二步：荧光检测
12
基于ABI3730xl平台的扩展应用
2. STR:
13
基于ABI3730xl平台的扩展应用
3. SNP: 传统测序法 金标准
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
3. SNP: 传统测序法 金标准
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
3. SNP: SNaPshot 适合5-12个及以上的SNP位点的检测 该检测方法的主要原理为单碱基延伸技术，并且利用
基因分型(Liz120, Liz500, ROX500)
基因测序及分型的运行时间 时间：96样本 ~2h 通量：（94-96）/384*12
读长：700-900bp
9
长片段的测序
Primer Walking：获得未知克隆的序列信息，或者验 证克隆序列的准确性。如果提供参考序列，可以一次 完成长片段克隆的全长测序。
7
Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination
DNA 带负电 DNA在电泳胶中的迁移率 与其片段大小有关
8
关于ABI3730xl
毛细管规格: 96道毛细管 毛细管长度: 50cm 凝胶的规格: POP-7液体分离胶 配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer)
DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于
ddNTPs(一般3-4：1)。
3
Sanger双脱氧终止法
与 PCR反应类似；
反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶, dNTPs, ddNTPs和 测序引物；
反应过程： 变性－复性－延伸－终止
4
Sanger第一步：加入复制终止剂
---LXF 2013.4.10
1
第一代测序技术
原理： 1.Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)
2.MaxamGilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)
2
Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）
ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入
DNA模板直接与一套3个探针组成的系统结合，这3个探针包括2个等 位基因探针ASO和1个位点特异探针LSO。当ASO探针和LSO探针与模板 完全匹配时，连接酶连接两条探针。然后使用生物素标记的PCR引物扩 增该连接产物。生物素标记的扩增产物结合在链霉亲核素包被的杂交板 孔中，通过碱变性的方法使生物素标记的单链PCR产物保留在杂交板中， 然后该单链PCR产物与一套通用Zipchute探针杂交结合。这些探针带有 荧光标记，它们具有特殊的片段与单链PCR 产物的特殊部位互补，还包 含有修饰部分，一条Zipchute 探针对应一个待检测等位基因，然后将杂 交捕获到的Zipchute 探针分离出来，通过毛细管电泳进行检测，最后通 过GeneMapper软件分析来确定SNP基因型。
这些微珠一个个地放到芯片上的小孔中，每孔一个微珠。 保证了反应的独立性，节省试剂耗材。
23
GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段 = 一个 磁珠 = 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。
1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源 的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、 小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC 等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码 RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。短的PCR 产物则可以直接跳到步骤3)。
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3. SNP: SNPlex SNPlex Genotyping System是基于荧光检测方法来进行。
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第二代测序平台
454 (GS-FLX) Solexa SOLiD
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454 (GS-FLX)
➢ 原理： 依赖于核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放。该技术是由
波尔·尼伦和穆斯塔法·罗纳吉于1996年在斯德哥尔摩的 皇家工学院发展出来的。
➢ 454的突破之处： 将试剂和模板统统都吸附在一个个微珠上，然后把
Fragment4
Fragment3
Fragment2
Fragment1
Legend：
Primer Fragment
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
1. Gene Synthesis：
protein/DNA sequence of interest design oligos order oligos Run 1st round PCR (assembly) Run 2nd round PCR (amplification) ligate into vector, transform Pick colony and screen recombinants by colony PCR Sequencing recombinants Plasmid minipreparation ~4 day between PCR amplification and sequencing-confirmed plasmid (at best!!)
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
2. STR: STR/SSR:
是由长度为2-7个碱基的核苷酸序列重复构成的多态 性DNA标记，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度 可变性，因此在同一个基因位点创造了多个不同的等位 基因。微卫星分析通常被用来创建遗传图谱，连锁分析 以及对遗传性状的追踪。
原理：在一端引物上标记特定的荧光,通过PCR产物长度大 小，检测基因型.
5
ddNTPs参与下的DNA复制
Sanger法测序产物的平均 链长取决于ddNTP：dNTP的比例,
比例高时，得到较短的产物； （BigDye， HiDi）
“标记／终止法”测序产物 的平均长度可通过标记反应中
dNTP浓度(高浓度能得到长的 产物)或终止反应的 ddNTP:dNTP来调整。
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Sanger第二步：荧光检测
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
2. STR:
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
3. SNP: 传统测序法 金标准
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
3. SNP: 传统测序法 金标准
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基于ABI3730xl平台的扩展应用
3. SNP: SNaPshot 适合5-12个及以上的SNP位点的检测 该检测方法的主要原理为单碱基延伸技术，并且利用
基因分型(Liz120, Liz500, ROX500)
基因测序及分型的运行时间 时间：96样本 ~2h 通量：（94-96）/384*12
读长：700-900bp
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长片段的测序
Primer Walking：获得未知克隆的序列信息，或者验 证克隆序列的准确性。如果提供参考序列，可以一次 完成长片段克隆的全长测序。
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Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination
DNA 带负电 DNA在电泳胶中的迁移率 与其片段大小有关
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关于ABI3730xl
毛细管规格: 96道毛细管 毛细管长度: 50cm 凝胶的规格: POP-7液体分离胶 配套的试剂: 基因测序(BigDye3.1v和5×Sequence buffer)
DNA中，其后就不能再继续连接。 反应体系中dNTPs的浓度远高于
ddNTPs(一般3-4：1)。
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Sanger双脱氧终止法
与 PCR反应类似；
反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶, dNTPs, ddNTPs和 测序引物；
反应过程： 变性－复性－延伸－终止
4
Sanger第一步：加入复制终止剂
---LXF 2013.4.10
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第一代测序技术
原理： 1.Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)
2.MaxamGilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)
2
Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）
ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入
DNA模板直接与一套3个探针组成的系统结合，这3个探针包括2个等 位基因探针ASO和1个位点特异探针LSO。当ASO探针和LSO探针与模板 完全匹配时，连接酶连接两条探针。然后使用生物素标记的PCR引物扩 增该连接产物。生物素标记的扩增产物结合在链霉亲核素包被的杂交板 孔中，通过碱变性的方法使生物素标记的单链PCR产物保留在杂交板中， 然后该单链PCR产物与一套通用Zipchute探针杂交结合。这些探针带有 荧光标记，它们具有特殊的片段与单链PCR 产物的特殊部位互补，还包 含有修饰部分，一条Zipchute 探针对应一个待检测等位基因，然后将杂 交捕获到的Zipchute 探针分离出来，通过毛细管电泳进行检测，最后通 过GeneMapper软件分析来确定SNP基因型。
这些微珠一个个地放到芯片上的小孔中，每孔一个微珠。 保证了反应的独立性，节省试剂耗材。
23
GS FLX系统的流程概括起来，就是“一个片段 = 一个 磁珠 = 一条读长（One fragment = One bead = One read）”。
1）样品输入并片段化：GS FLX系统支持各种不同来源 的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、 小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC 等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码 RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。短的PCR 产物则可以直接跳到步骤3)。