11第十一章：基因表达和功能研究

基因转录过程：
无论是原核生物还是真核生物，转录过程都包括：模 板识别、转录起始、转录的延伸和终止。 基因转录过程的研究包括以下问题： 一个转录本是否就是一个基因的准确的复制品，或者 它还缺少DNA序列的部分。这些缺少的DNA片段被称为 “内含子”（intron）。Intron的结构和可能的功能是非 常让人感兴趣的。 除了基因内区外，转录的起始点和终止点的精确定位 也很重要。大部分的转录体不仅仅是基因本身的复制品， 而且还有位于基因两端的核苷酸序列的复制，即位于基 因前面和后面的调控序列或信号序列。
要取决于限制性图的详细程度和这些限制性识别位点 是否在合适的位置上。DNA分子上，单一的调控序列 的大小可以小于10bp，因此，单独用凝胶滞留分析， 大多数情况下通常不能准确地确定DNA上调控序列的 位置（如果所在的片段越长，就越不准确）。要在凝 胶滞留分析发现的片段中决定蛋白质结合的序列的位
置，需要一种更准确的方法：使用脱氧核糖核酸酶I
进行缺失分析的关键是找到一种从基因的表达上去 研究调控序列的缺失对基因表达的影响的方法。实 验中常用报告基因来研究调控序列的功能。 a、报告基因：基因的产物或表现型能够明确显示 出调控序列的变化对该基因所引起的影响，这样的 基因称为报告基因。 将报告基因与被研究基因的上游区域连接在一起 （图11-12），用报告基因将原来的基因取代。进 入宿主生物后，这个报告基因因为受同样的调控序 列影响，它的表达形式应该和原来的（被取代）基 因完全相同。
11.2.1 基因的调控序列研究
• 调控序列是位于基因上游的一段DNA，调控蛋白可 通过与该段DNA结合，实现对该基因的调控。 • 依据调控序列与调控蛋白的结合特性，有两种方法 可识别基因上游蛋白结合位点调控序列： 一是根据调控序列结合调控蛋白后具有的较高的分 子量来辨别蛋白质在一个基因上结合的区域； 二是根据它的抗核酸酶的降解特性，来确定调控蛋 白结合的这个区域。 利用调控蛋白及其结合的DNA—分子间可形成复合 体，我们可通过蛋白质—DNA、蛋白质—RNA杂交 技术研究并识别基因的调控序列。
克隆到 M13-载体中，得到其单链分子。
以含有300bp的位于该基因前的前导序列和100bp编码 区的Sau3A-片段为例：将该限制性片段克隆到M13-载体后， 将重组M13-载体与RNA-转录本混合，同转录本互补的一 小段序列会形成双链结构，而M13-载体DNA-分子的其它 部分还是单链的，S1处理时，重组M13-载体中基因与转录 本杂交形成双链的部分会受到这个RNA-转录本的保护。除 了这一段外，整个DNA都被S1酶解；随后，再用碱破坏 DNA-RNA中的RNA后，就只保留下参与转录的一小段 DNA-单链。通过图11-5 可看出，这段保存下来的单链就 是转录起点到右边的Sau3A识别位点之间的距离（因为转 录本中包括这个转录起点）。通过电泳可确定这个单链片 段的大小，并对转录起始位点在DNA序列上定位。
11调控研究 11.3 基因翻译产物的研究
11.1 克隆基因的转录本分析
转录本分析的大部分方法的原理是：以
RNA转录本和含有这个基因的DNA-片段 之间的杂交反应为基础。这些方法包括对 RNA-DNA杂交体的电子显微镜观测法和 单链特异性核酸酶酶解法。
用同样的方法，也可以确定转录末点、基因内含子区 和基因外显子区的位置。 例如，在基因的起始片段之后再取一段，它的长度为 300bp，将它克隆到单链的M13中并与该基因的mRNA杂 交，并用S1酶切。电泳检查剩下的双链片段的长度，如 果它为300bp长，则说明这段中还没有基因内含子区。 如果它的长度为150bp，则说明在该段150bp处开始了基 因内含子区序列（被S1切除了）。类似的操作可以确定 出外显子的数目和位置。 其他研究RNA转录的技术还有RNA印迹法（Northern blotting）、RT-PCR、RACE法、RNA测序等，前面我们已 介绍过。 11.2
放射性标记的DNA
*
*
A
B
C
细胞蛋白质提取物
*
凝胶电泳
*
蛋白质与DNA结合
* *
* *
B
*
DNA-蛋白质结合 物电泳迁移缓慢
*
放射自显影
滞后带表明DNA与蛋 白质结合
凝胶阻滞实验的基本原理图
放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝 胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
凝胶阻滞分析法能以多高的精确度确定这个片段，
（DNase I）的足迹法 (foot-printing)
B、脱氧核糖核酸酶I（DNase I）足迹法 （foot-printing）
DNaseⅠ足迹实验（foot-printing assay）是
一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的
部位及特性的专门的实验技术。足迹实验的一
个明显优点是，可以形象地展示出一种特殊的 蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。
对大多数基因，RNA在转录之后并没有完成表达， 还必须被翻译成多肽（蛋白质）分子。而对于另一些基 因如编码转移-RNA（tRNA）和核糖体-RNA（rRNA） 的基因，转录本本身（或经过编辑修饰后）就是有功能 的分子，到这一步此类基因就实现了表达。 基因表达和功能的研究，其主要目标是：基因的转 录、翻译过程及转录、翻译的调控。
通过电镜观察DNA-RNA杂交链上形成的环的数
量、长短和在基因上的相对位置，可直接反映相应 基因中内含子的数目、长短和相对位置。 对这个基因进行序列分析可获得基因内含子的 更准确的资料。如果已经有了该基因的cDNA-克隆， 测序分析后，可以用它的序列与基因序列进行比较， 准确地定位内含子的位置和长度。[请思考：只有基 因序列，能否准确确定基因内含子位置和长度？]
11.2.2 调控序列的功能鉴别— 缺失分析法（deletion analysis）
凝胶滞留、足迹分析及修饰干扰实验 能标定基因的上游调控序列，但不能提 供单个序列的功能信息。
缺失分析方法不但可以确定调控序列
的位置（精确度和凝胶滞留相同），而 且它还可以研究调控片段的功能。
缺失分析法的基础是基于：调控序列上的缺失会引 起这个基因在表达调控方面的变化（图11-16）。 例如： 一个抑制基因表达的调控序列的缺失应该导致这个 基因的强烈表达； 组织专一性的调控序列，它的一个缺失将引起目的 基因不只是在特异的组织中表达，而且在其它的组 织里也被表达（组织表达专一性丧失）。
A、凝胶阻滞实验（Gel retardation assay）
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift
assay），是在20世纪80年代初期出现的用于在体外
研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技 术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离 纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的 降低。
调控表达的：只有当细胞需要这种基因产物时， 它们才被启动。 对于高等生物而言，基因的表达具有时空特 性：不同的组织、细胞的基因表达存在差异；即 使同一组织在不同的生长发育时期和生长发育状 态下，其基因的表达也存在不同。
低等生物中，以大肠杆菌的色氨酸生物合成酶的基 因表达为例：当色氨酸在细胞中大量存在时，该基因就 被关闭；而当色氨酸浓度降低时就重新被激活。 在高等生物中，基因调控就更复杂，高等生物拥有 更多的调控基因。 在基因的上游区域（即编码序列开始前）通常具有 一个或几个调控序列（图11-9），调控蛋白（由调控基 因编码）可附着于这些序列上，可调控该基因的表达 （开启和关闭）。 调控蛋白既可以抑制也可以增强基因的表达： 调控蛋白的抑制作用可使基因表达减弱或停止； 调控蛋白的促进作用能使基因的表达被激活或增强。
基因和它的转录本之间杂交可直接用于基因内含
子的研究：
成熟的转录本RNA是不含内含子的，如果要
研究的基因有内含子，那么，该基因在长度上要
大于它的转录本。基因上内含子由于不能和转录
本杂交，就会形成一个“环”，这种环可在电子
显微镜下很容易观察到。它们在电子显微镜下显
示出一种特别的图像（图11-3）。
环（Loop）
C、修饰干扰实验
前面已提到过，调控序列通常只有几个碱基对，而 用DNase I 足迹法检测时，由于同DNA 结合的蛋白质 分子较大，可以保护数以十计的碱基对不受DNase I的
降解，因此DNase I足迹法也不能很精确定位调控序列
（尽管比凝胶阻滞法精确），只能用于定位调控序列所
在的区域。修饰干扰实验可用于分析真正和蛋白结合的
11.1.1 电子显微镜观测法
为了能使用电子显微镜很好地观察DNA，首先
要用一种物质处理，以增加DNA-分子的直径。
通常，是将 DNA-分子和一种蛋白质（例如细 胞色素-c）混合。蛋白质和多聚核苷酸结合， 使多聚核苷酸表面具有一层厚的外罩。这样被 覆盖的分子再用醋酸双氧铀（Uranylacetate） 或其它的电子密度大的物质“染色”，能使 DNA-分子在电镜下较明显地显示出来（图112）。
核苷酸位点。
修饰干扰实验的操作类似足迹法，该方法的核心是： DNA序列中的核苷酸被修饰后蛋白质则不能同该DNA片 段结合。首先标记经过限制性酶切的DNA片段的一端， 然后用化学试剂来修饰特定的核苷酸：常用的是用硫酸 二甲酯在鸟嘌呤核苷酸上添加甲基基团（图11-15）。 并且这种修饰是在限制性条件下完成以确保最终每个 DNA片段上只有一个核苷酸被修饰。在完成修饰操作后， 再将DNA片段和蛋白质混合，当调控序列中的鸟嘌呤被 甲基化修饰后蛋白质则不能同该DNA片段结合,通过电 泳可分离出此条带。进一步利用能修饰A、T、C等不同 核苷酸的其它化学试剂,重复类似鸟嘌呤核苷酸分析过程， 可最终逐一确定调控序列中核苷酸的精确组成。
基本原理:
一段DNA ， 当它和一个调 控蛋白结合后， 调控序列范围 内被保护起来， 而不会被核酸 内切酶如 DNase I分解 （图11-12）。