实验十四糖化酶活力的测定
测定糖化酶活性的方法
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μ mol换算成mol。
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量 蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至 l00ml，此溶液需当天配制。 （2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液 称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容 至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml 和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。 （3）0.1mol/L碘液 称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL， 摇匀，贮存于棕色瓶中。
操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶 活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白 对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加 入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水 浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶 液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时， 立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试 管的塞子打开）。
糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外 酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的 非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都 是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖 单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型 变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点 时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水 解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但 水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之 百地水解生成葡萄糖。
糖化酶发酵、提取及活力测定
SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ发酵工艺学实验报告糖化酶发酵、提取及活力测定实验学院：生命科学学院专业班级：生物工程1602项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻指导教师：王丽娟2018年6月糖化酶发酵、提取及活力测定实验何健雨王丽娟生命科学学院生工1602班1. 实验目的(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。
(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法2. 实验原理葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。
糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。
生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。
黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。
首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。
酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。
3. 实验材料优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。
4. 方法步骤待测酶液的制备:称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶中。
糖化酶活力测定(精)
糖化酶活力测定1. 定义1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。
2. 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。
3. 试剂和溶液(1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。
称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。
配好后用 pH 计校正。
(2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。
(3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。
(4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。
(5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。
(6硫酸溶液(2mol/L。
(7 20g/L可溶性淀粉溶液。
(8 10g/L淀粉指示液。
4. 仪器和设备恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。
5. 步骤(1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。
沉渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。
通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。
(2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。
在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。
酶活力测定方法
空白和对照试验： 空白试验：是指杂质反应和自发反应引起
的变化量，它提供的是未知因素的影响。空 白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者 都加（酶预先经过失效处理）。
对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得 的结果，主要作为比较或标定的标准。
3）测定方法：
取样测定法：
酶变性剂：5% 三氯醋酸 3% 高氯酸 其它酸、碱、醇类
A1 - A2
0.003 : 1 =
:X
T
A1 - A2 0.003T
每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为
A1 - A2
0.003TW
A1—A 2 P=
0.003 T W
重组人白细胞介素 11的胰蛋白酶切肽 图分析
肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其 生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方 法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽 图法和胰蛋白酶切ＲＰ ＨＰＬＣ肽图法。返回练习与思考
1．何谓：生化药物、生物技术药物、 基因工程药物和生物制品？ 2．生化药物和基因工程药物各分哪 几种？ 3．与化学合成药物的分析相比，生 物药物的分析有何特点？
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加热：使酶失效
酶反应
不同的时间取样
终止反应
测定
连续测定法：在反应过程中对反应系统进 行直接连续检测。
检测方法： 紫外-可见分光光度法 旋光法 荧光分光光度法 电化学测定法 酶偶联测定法 离子选择性电极测定法等。
示例：胰蛋白酶效价测定 胰蛋白酶 肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸） 水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键 供试品溶液：50～60单位/ml 底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯
2．酶活力测定法
1）基本原理： 酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶
活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学 反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越 高。
实验十四糖化酶活力的测定
实验十四糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。
2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。
二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。
本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。
碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。
I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。
原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。
试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。
倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。
2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。
3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。
取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。
以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。
4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。
6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。
测定糖化酶活性的方法
对照组
I2 NaIO
完全歧化反应， 无葡萄糖
NaIO3 I2
实验组
I2
NaIO
NaIO另一部分 歧化反应 生成NaIO3
NaIO一部分与 葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂；
2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平；
3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠 溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶 液；0.5%淀粉指示剂。
式中:
B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平 均值）；
N——硫代硫酸钠的当量浓度。
180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。
60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义 为1个酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同，
其中：
10-3—— ml换算成L。
106—— μmol换算成mol。
4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可）， 用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终 点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶 液样品（A）、空白对照（B）；
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生 成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：
糖化酶活力测定
次碘酸钠法： 次碘酸钠法：
碘 与 NaOH 作 用 能 生成 NaIO ， 而 葡 萄 糖 能 定 量地(1:1)被NaIO氧化 在酸性条件下，未与 C6H12O6 作 用 的 NaIO可 转变成I2 析出,因此只 要用Na2S2O3 标准溶液 滴定析出的I2 ，便可 计算出 未 参 与 反 应 的 NaIO ，由此推导出糖 化酶催化所产生的 C6H12O6 的含量。 1.I2 与 NaOH作用: NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO 反应完后,剩余的 碱性条件下发生歧化反应: 在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步 歧化产物在酸性条件下进一步 作用生成I 作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液 析出的I 可用标准Na 滴定之: 滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
实验三
糖化酶活力的测定
指导老师： 孙运军 研 究 生： 赵 渊 徐 妙
一、目的和内容
目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法 内容：１. 内容：１. 学习糖化酶活力的原理． ２. 测定并计算糖化酶活力．
二、糖化酶简介以及其活性的测定原理
① 糖化酶的应用及生产 ② 糖化酶的催化原理 ③ 酶活测定方法
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀 1ml酶液每分钟催化2%淀 粉溶液水解生成1 mol葡萄糖的酶量定义为1 粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个 酶活力单位（U 酶活力单位（U）：
糖化酶实验报告
一、实验目的1. 了解糖化酶的特性和催化机理。
2. 掌握糖化酶的固定化技术。
3. 学习通过实验测定糖化酶的活力和半衰期。
二、实验原理糖化酶是一种内切酶，能够将淀粉分子水解成葡萄糖。
固定化酶技术是将酶固定在固体载体上，以提高酶的稳定性和重复使用性。
本实验采用戊二醛交联法固定糖化酶，并通过测定固定化酶的活力和半衰期来评估固定化效果。
三、实验材料与仪器材料：1. 马铃薯淀粉2. 葡萄糖3. 戊二醛4. 交联剂5. 硫酸铵6. 碳酸钠7. pH试纸8. 红外测温枪9. 试管10. 烧杯11. 移液器仪器：1. 研钵2. 恒温水浴锅3. 酶标仪4. 分析天平四、实验步骤1. 酶的制备：1.1 称取适量糖化酶粉末，加入适量蒸馏水溶解。
1.2 将溶解后的酶液加入戊二醛，交联剂和硫酸铵，进行固定化处理。
1.3 将固定化酶用碳酸钠溶液洗涤，去除未固定的酶和杂质。
2. 酶活力测定：2.1 准备一定浓度的淀粉溶液，加入固定化酶，在恒温水浴锅中反应。
2.2 定时取样，用碘液检测淀粉浓度，计算酶活力。
2.3 重复实验，求平均值。
3. 半衰期测定：3.1 在恒温水浴锅中，将固定化酶与淀粉溶液混合，定时取样，测定酶活力。
3.2 以酶活力为纵坐标，时间（min）为横坐标，绘制酶活力随时间变化的曲线。
3.3 根据曲线计算半衰期。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定结果：实验结果显示，固定化酶的活力与未固定化酶相近，说明固定化过程对酶活力影响较小。
2. 半衰期测定结果：实验结果显示，固定化酶的半衰期为30min，明显高于未固定化酶，说明固定化技术提高了酶的稳定性。
六、结论1. 糖化酶固定化技术是一种提高酶稳定性和重复使用性的有效方法。
2. 本实验中，戊二醛交联法成功固定了糖化酶，固定化酶的活力和稳定性均得到了提高。
七、实验讨论1. 实验过程中，固定化酶的活力和稳定性与固定化条件（如交联剂浓度、交联时间等）密切相关。
2. 在实际应用中，可根据需要选择合适的固定化方法和条件，以获得最佳的固定化效果。
05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9)UV—2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min ，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL ，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。
糖化酶活力测定
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
酶活力测定
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：食品发酵工业中常用系列酶活力测定实验项目性质：综合性实验计划学时：6所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：09生物工程2班******学号：************实验课指导老师：沈玉栋摘要测定食品发酵工业中常用酶活力，对于选择酶种类，工艺条件的制定等有重要意义。
本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶，淀粉酶，蛋白酶进行了酶活力测定。
其中，测定糖化酶采用直接滴定法，测定淀粉酶采用目测比色法，测定蛋白酶采用福林酚法。
关键词：酶活力糖化酶淀粉酶蛋白酶直接滴定法目测比色法福林酚法1 前言酶，从早期的酿造、发酵食品开始，至今已广泛应用到各种食品上。
随着生物科技进展，不断研究、开发出新的酶制剂，已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。
目前已有几十种酶成功地用于食品工业。
例如，葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。
应用的酶制剂主要有：淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。
酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质，生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。
作为生物体内的催化剂，催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。
它能把淀粉从非还原性未端水介a-1，4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1，6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。
糖化酶综合实验
实验四糖化酶综合实验（一）糖化酶摇瓶实验一、实验目的掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。
二、实验原理摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过将装有液体培养物的三角瓶放在摇床上振荡培养，以满足生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。
三、实验材料1.菌种：黑曲霉（糖化酶生产常用菌种）2.培养基：玉米粉、豆饼粉、麸皮、水3.器材：500ml三角瓶、玻片四、方法步骤1. 配制培养基玉米粉 6%，豆饼粉 2%，麸皮 1%。
补足水分，原料浸入水中。
8层纱布+牛皮纸包扎，0.1MPa下灭菌30min。
500ml三角瓶 1瓶/小组，装液量分别为100ml 2个小组、200ml 2个小组2. 接种成熟斜面，在无菌条件下，注入10ml无菌水，振荡成孢子悬浮液。
待发酵培养基灭菌后冷却到30～32℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2ml，做好标记3. 培养将三角瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为200rpm，培养时间为96h4. 显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力五、实验结果1.比较两种不同装液量条件下的菌体形状特征、酶活力，将结果填入分析：由于摇瓶培养的时间未达到96小时。
所以，培养瓶内壁只出现少量黑色菌落。
但相对于100ml培养基中的菌体要多一些。
说明培养基量的多少会影响菌体的生长，培养基量多则营养多更有利于菌体快速旺盛生长，增殖。
因此，观察到的菌丝相对于100ml培养基中的菌丝多而粗。
培养时间一定要遵循菌体的生长曲线时间，不能过早或过晚结束培养。
应按照各种菌体与产物的模式，适时停止培养收集产物酶。
本实验摇瓶培养才72小时，未能使菌体充分生长，即菌数少，产酶量低，或培养时间还未达到菌体大量产酶的时段，这将影响后续酶的分离提取及活力测定。
培养基应适量，在不浪费原料的同时有能使菌体快速生长，并且控制培养基的量，将减轻酶分里提取的工作量。
（二）糖化酶活力测定一、实验目的掌握糖化酶活力测定的原理与方法。
糖化酶活力测定实验报告
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。
二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
测定糖化酶活性的方法
测定糖化酶活性的方法测定糖化酶活性的方法是通过测量糖化酶在一定条件下催化底物转化为产物的速率来确定其活性的一种实验方法。
糖化酶活性可以反映糖化酶催化糖化反应的效果和能力，因此在糖化酶的研究和应用中起到重要的作用。
下面将介绍几种常用的测定糖化酶活性的方法。
1. 连续监测法（Continuous Monitoring）连续监测法是一种通过连续监测糖化酶催化反应中底物消失或产物生成的速率的方法。
常用的连续监测方法包括紫外吸收光谱法、荧光分光光度法和电化学法等。
紫外吸收光谱法是利用糖化酶催化反应底物或产物在特定波长下的吸光度改变，通过测定光强变化来间接测定糖化酶活性。
荧光分光光度法是通过测定糖化酶催化反应中产生的荧光物质的荧光强度变化来测定糖化酶活性。
电化学法是利用糖化酶催化反应中产生的电流变化来直接测定糖化酶活性。
2. 间断监测法（Discontinuous Monitoring）间断监测法是一种通过在催化反应开始与结束时测定底物或产物的浓度变化来测定糖化酶活性的方法。
常用的间断监测方法包括酶抑制法、血红蛋白法和多糖沉淀法等。
酶抑制法是通过在糖化酶催化反应中添加一种特定的抑制剂，抑制糖化酶的活性，然后在一定时间内测定抑制前后底物或产物的浓度变化，从而间接测定糖化酶活性。
血红蛋白法是通过测定糖化酶催化反应中产生的血红蛋白含量的变化来测定糖化酶活性。
糖化酶可以将底物中的血红蛋白逐步降解，通过比较血红蛋白的降解速率来测定糖化酶活性。
多糖沉淀法是通过将糖化酶催化反应中的产物与多糖结合形成沉淀，然后通过测定沉淀的质量来测定糖化酶活性。
3. 反射光度法（Reflectance Photometry）反射光度法是一种通过测量糖化酶催化反应中产生的反射率变化来测定糖化酶活性的方法。
在糖化酶催化反应中，底物被转化为产物后，产物的光学性质会发生变化，测量其反射率的变化可以确定糖化酶活性。
总之，测定糖化酶活性的方法很多，选择合适的方法应根据实验的具体目的、测量条件、仪器设备和操作方便性等因素来综合考虑。
糖类消化酶活性的测定方法及原理
通过标准曲线获得相应的麦芽糖含量（mg/ml）
按下列公式计算淀粉酶活性
α -淀粉酶活性=(A2-A1)*V*D/W 其中：A1为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）
4 实验结果计算
A2为测定管中α -淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）
V为酶促反应体积 D为酶液总体积
W为样品鲜重
（α ＋β ）淀粉酶总活力=（B2-B1）*V*D/样品鲜重 其中：B2为(α ＋β )淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）
利用35二硝基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成麦芽糖的含量以单位时间内淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性大小再与非钝化条件下的总活性进行加减运算得到另一个淀粉酶的活性1实验原理2实验材料淀粉酶液50ml恒温水浴锅刻度试管04mol的naoh1淀粉35二硝基水的柠檬酸缓冲液以1号管为空白调零点在540nm波长下比色测定光密度以麦芽糖浓度mgml为横坐标a540nm为纵坐标用excel绘制标准曲线取两只试管一只对照一只测定各加淀粉酶原液1ml70加热15min冷却向对照管加4ml04mol的naoh终止酶活性
于禾谷类的种子中。β-淀粉酶存在于休
眠的种子中，而α -淀粉酶是在种子萌发 过程中形成的。
课本提要
实验原理：
1、在最适温度之前，淀粉酶的活性随着温度的升高而升高，达到 最适温度之后，淀粉酶的活性随着温度的升高而降低至失活。 2、淀粉水解反应：淀粉 蓝糊精－>紫糊精－>红糊精－>无色糊精 －>麦芽糖 遇碘呈现颜色：蓝色－> 蓝色－>紫色－>红色 －> 无色－>无色
（1）实验原理
α-淀粉酶：耐热不耐酸，70℃加热15min 仍保持活性，pH<3.6时钝化； β-淀粉酶：耐酸不耐热，70℃加热15min 即钝化 本实验采用加热法钝化β-淀粉酶，测定α淀粉酶的活性。具体方法：利用3,5-二硝 基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成麦 芽糖的含量，以单位时间内淀粉酶分解生 成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性大小，再 与非钝化条件下的（α＋β）总活性进行加 减运算得到另一个淀粉酶的活性
05-01-013实训指南-糖化酶活力测定(精)
天津现代职业技术学院
1 实训安排 序号
具体实训内容
学时（2） 实训方式 1 分配任务，发放引导文；
组织几个学习小组；每组各选出一名组
长各学习。
30分钟 引导教学 分组讨论 2 各学习小组成员根据各自学习，通过讨论等方式，确定蛋白酶活性测定的实施
方案。
20分钟 3 根据糖化酶活性测定实施方案，教师参与糖化酶活性测定的实施过程；
在方案实施过程的每个环节中，实施者要始终对物质定量分析的准确性高度重
视，因此在操作中要避免影响准确性的不正确或不规范操作及其他影响因素。
这个过程中师生共同分析、解决生产中发酵染菌的问题。
160分钟 4 各组成员对酶的稀释、标准曲线的绘制、酶活性测定、酶活力单位计算等情况进行评价；
各班组成员对任务的组织、策划、实施等过程进行自评和互评；
教师就各组成员在不同阶段的个方面的
表现情况进行评价；
教师根据标准曲线的绘制、酶活性测定、酶活力单位计算等情况提出问题，学生通过讨论方式尝试给出解释方法，教师总结归纳解决方法。
30分钟 分组讨论 教师监督 5
撰写、提交实训报告和实训总结 30 小组总结。
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实验十四糖化酶活力的测定
一、实验目的
1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。
2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。
二、实验原理
糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。
本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。
碘量法定糖原理：
淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：
I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O
NaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI
体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。
I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI
三、仪器、原料和试剂
仪器
吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。
原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。
试剂
1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。
倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。
2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。
3. pH
4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。
取分析纯冰醋酸
5.78毫升定容至1000毫升。
以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。
4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。
6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。
四、操作步骤
1糖化曲制备（以浅盘麸曲为例）
（1）菌种的活化
无菌操作取原试管菌一环接入察氏培养基斜面，或用无菌水稀释法接种，31℃保温培养4~7天，取出，备用。
（2）三角瓶种曲培养
称取一定量的麸皮，加入70%~80%水，搅拌均匀，润料1h，装瓶，料厚约1.0~1.5cm，包扎，在9.8×104Pa压力下灭菌40min。
冷却后接种，31~32℃培养，待瓶内麸皮已结成饼时，进行扣瓶，继续培养3~4天即成熟。
要求成熟种曲孢子稠密、整齐。
（3）糖化曲制备
a配料
称取一定量的麸皮，加入5%稻皮，加入原料量70%水，搅拌均匀。
b蒸料
园气后蒸煮40~60min。
时间过短，料蒸不透对曲质量有影响；过长，麸皮易发粘。
c接种
将蒸料冷却，打散结块，当料冷至40℃时，接入0.25~0.35%（按干料计）三角瓶种曲，搅拌均匀，将其平摊在灭过菌的瓷盘中，料厚约1~2cm。
（4）前期管理
将接种好的料放入培养箱中培养，为防止水分蒸发过快，可在料面上覆盖灭菌纱布。
这段时间为孢子膨胀发芽期，料醅不发热，控制温度30℃左右。
约8~10h，孢子已发芽，开始蔓延菌丝，控制品温32~35℃。
若温度过高，则水分蒸发过快，影响菌丝生长（5）中期管理
这时菌丝生长旺盛，呼吸作用较强，放热量大，品温迅速上升。
应控制品温不超过
35~37℃。
（6）后期管理
这阶段菌丝生长缓慢，故放出热量少，品温开始下降，应降低湿度，提高培养温度，将品温提高到37~38℃，以利于水分排除。
这是制曲很重要的排潮阶段，对酶的形成和成品曲的保存都很重要。
出曲水分应控制在25%以下。
总培养时间约24h左右。
（7）糖化曲感官鉴定
要求菌丝粗壮浓密，无干皮或“夹心”，没有怪味或酸味，曲呈米黄色，孢子尚未形成，有曲清香味，曲块结实。
2. 糖化酶活力测定
（1）浸出液的制备
称取5.0g固体曲（干重），置入250ml烧杯中，加90ml水和10ml pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液，摇匀，于40℃水浴中保温1h，每隔15min搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲浸出液。
（2）糖化酶活力的测定
取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入待测酶液2毫升(空白以蒸馏水代替酶液)准确计时1小时。
取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷却至室温。
取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L 碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。
加入2N硫酸2毫升。
用0.05硫代硫酸钠滴定至无色。
其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。
五、计算：
A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；
B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；
90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；
V1—酶液的体积(2毫升)；
V2—反应液总体积(32.20豪升)；
V3—吸取反应液样品体积(5毫升)；
N—酶液稀释倍数；
N—Na2S2O3的当量浓度(0.01mol/L)。
六、结果
1. 记录制曲过程中观察到的现象。
2. 酶活力测定结果列表记录。
七、思考题
1. 固体曲和液体曲相比，各有何优缺点？
2 糖化酶活力测定中应注意哪些因素？。