南方医科大学研究生细胞培养技术考试重点总结
细胞培养技术总结
细胞的生长特点
体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴壁型和 悬浮型。 贴壁细胞的主要代表是成纤维细胞，一般在接种 后24h内贴壁，刚开始时细胞多呈圆形，随贴 壁时间延长，逐渐伸展成梭形或多边形。传代 后的成纤维细胞12h开始贴壁，24h内完全贴壁。 上皮细胞型、游走细胞型和多形型都属于贴壁 型细胞。 悬浮型细胞包括血液白细胞和癌肿瘤细胞，不需 要附着于底物而于悬浮状态下生长良好。
四、细胞的冻存与复苏
• 细胞冻存和复苏的基本原则：慢冻快融， 可以最大限度的保存细胞活力。 • 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作 保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的 通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分 渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从 而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。 • 冻存的细胞浓度：正常人的成纤维细胞浓 度： 5×106~1×107细胞/ml
细胞生长的三个阶段
• 潜伏期 ：细胞接种后先悬浮在培养液中，此时细胞 质回缩，胞体呈圆球形，继续培养便开始贴壁， 24h内便可长满瓶壁。 • 对数生长期 ：细胞增殖最旺盛的时期，随细胞数量 不断增多，生长空间逐渐减少，最后细胞互相接触 汇成一片。 • 停滞期：细胞数量达到饱和密度之后，停止增殖， 细胞数量不再增加，但仍有代谢活动，因而培养液 中的营养逐渐耗尽，代谢产物积累，此时需要分离 培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变或者 脱落死亡，故传代应在细胞长满瓶壁80%的时候传 代最好。
注：细胞培养液要贮存在4℃冰箱，避免光照， 试验前放入37℃水浴中温热。
加血清的高糖培养液存放期为六个月，期间 谷氨酰胺会分解，若细胞生长不佳，可以 再添加适量谷氨酰胺。 环境条件：95%空气和5%CO2 的气体； 温度：37℃
三、细胞的消化传代
成纤维细胞生长至高密度时，须分殖至新的培养瓶中， 一般稀释比例为1:3 至1:6。 1.PBS缓冲液、0.25%的胰蛋白酶和含10%的DMEM预先 放入37℃水浴中温热； 2.倒掉培养瓶内旧的培养液，加入4~6ml PBS缓冲液洗 涤残留培养液； 3.加入2~3ml胰蛋白酶，放入37℃ CO2孵箱中消化2~3 分钟，镜检观察，如有细胞间隙变大，细胞质回缩 现象，加入培养液终止消化。 4.用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，加入 离心管中，800rpm离心5min； 5.倾去上清液，加少量培养液重悬细胞，计数后调整 细胞浓度为1×107 /ml，在新的或者灭菌好的培养瓶 加入6ml左右新鲜培养液，将调整好浓度的细胞液 滴入培养瓶中，混匀，做好标记，放入37℃ CO2孵 箱培养。隔天换液。
细胞培养技术总结-重要
细胞培养及检测相关技术小结一、细胞培养基配制以1000ml培养基为例。
1000ml成骨细胞培养基 = 850mlα－MEM培养液 + 150 ml 特级胎牛血清FBS (15%)(1). α－MEM powder: 10.2 g/L ~~~ 8.67 g for 850 ml(2). NaHCO3: 2.2 g/L ~~~ 1.87 g for 850 ml(3). Twice distilled water 850 ml, dissolve the powder in water(4). FBS (15%,v/v) 150 ml(5). Filter to sterilized bottle(6). Label the bottle and store in 4℃.Notes: 4,5 should be operated in the sterile working place. And if necessary, we can add some antibiotics into the medium（usually in primary cell culture）. 二、PBS（10×）NaCl: 80g/LKCl: 2g/LNa2HPO4: 14.4 g/LKH2PO4: 2.4 g/LPH=7.4, with HCl or NaOHToo much PO42-is harmful to cell, so only very little amount is necessary. Get some certain to dilute this 10 times concentration PBS when we need.三、胰蛋白酶Trypsin- EDTA 消化液(10×)This solution is used for cell released from the culture flask。
细胞培养重点
4细胞培养研究的内容
⑴ 细胞内的活动：例如，能量的代谢、DNA转录、凋亡、蛋白质合成等。
⑵细胞内部与细胞外界之间的作用：例如， 细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等
⑶细胞与细胞之间的相互作用：例如，形态的改变、细胞与细胞之间的粘着作用、接触抑制、密度抑制等。
1体外培养（in vitro culture）：是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
体外培养的三个层次：细胞培养，组织培养，器官培养
2细胞培养(Cell Culture)：是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。
（2）培养室和超净工作台的消毒
（3）洗手和着装：原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装
（4）无菌培养操作
18无菌室的消毒：①紫外线照射1-2h /日（使用前）；
②甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸2h / 周；
③新洁尔灭擦拭地面和墙壁1次 / 月。
实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。
（2) 成纤维细胞型：细胞的形态类似于在体内生长的成纤维细胞。
A, 来源 ：凡由中胚层的组织细胞，如纤维结缔组织、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。
B,细胞形态：成纤维细胞形态为，具有长短不等的数个细胞突起，因而多成梭形、不规则三角形或扇形，核为卵圆形位于靠近胞质的中央。
C，细胞生长特点：细胞一般并不紧靠相连成片，而是排列为旋涡状、放射状或似栅栏状。
⑶无菌操作间 — 专用于无菌操作、细胞培养
①大小要适当，其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；②墙壁光滑无死角以便清洁和消毒；
细胞培养考试重点整理 南方医科大学
细胞培养cell culture:从活体中取出细胞活其它建系细胞，在体外使之能继续生存﹑生长甚至增值的一种方法。
细胞融合：指两个或两个以上的细胞合并成为双核或多核细胞的过程。
细胞系cell line:原代培养物经首次传代成功后形成的。
细胞株cell strain:通过筛选或克隆化，具有特殊性质或特异标记的细胞且这些特异在以后的培养中必须持续存在。
原代培养primary culture:从机体取得材料细胞组织或器官，在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。
传代培养passage:将细胞从一个培养瓶容器移植到另一培养容器中培养。
贴壁依赖性：细胞培养过程中的特性，有大部分细胞在生长过程中都是贴壁生长的就是要附着在培养用的器皿上。
细胞对培养用器皿的附着能里的不同就是细胞贴壁性能代表了细胞的活力。
贴壁率seeding effifiency:在一定时间内，接种细胞贴附于培养器皿表面的百分率，但应当说明培养时的培养条件。
体外转化in vitro transformation:细胞在体外培养过程上中发生与原代细胞形态﹑抗原﹑增殖或其他特性的可遗传的变化。
细胞周期：细胞每一次增殖所经历的全过程称为细胞的增殖周期，理论上，细胞每经过一个增值周期，在数量上就增加一倍。
1.细胞冻存与复苏的原则？慢冻快融，以最大限度的保存细胞活力。
慢冻，主要是防止细胞在冷冻过程中形成冰晶，对细胞造成损害，加DMSO也是这个原理。
快融。
主要是防止DMSO在液体状态下对细胞的毒害作用，快速使细胞进入复苏和生长状态。
分别经过4度，-20度，-80度和液氮的依次过程进行冻存；经过37度水浴1分钟之内解冻细胞冻存液进行复苏。
2. 玻璃器皿的清洗（新买的和用过的）玻璃器材清洗要领有煮沸﹑刷洗﹑冲洗﹑酸泡和浸泡步骤如下a.刷洗：热水浸泡过用软毛刷带热刷洗瓶内外和盖子使用面；b.冲洗：流水振荡冲洗15-20次；c酸泡：器材50度烤干后清洁液（高锰酸钾﹑重铬酸钾﹑去离子水）酸泡24h；d.浸泡：酸泡器材冲洗沥水后用去离子水浸泡2次每次24h。
南方医科大学细胞工程主观题
一、名词解释（1）组织工程：应用工程学和生命科学的原理和方法来研究正常或病理情况下哺乳动物组织的结构、功能和生长机制，研究开发能够修复、维持或改善损伤组织的人工生物替代物的一门学科（2）细胞融合：在自发或者人工诱导下，两个来源相同或不同的细胞或者原生质体，融合成一个杂种细胞的过程。
（原生质体：除去细胞壁的被细胞膜包围的“裸露细胞”。
）（3）干细胞：具有自我更新和多项分化潜能的原始细胞（4）克隆：由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
（5）自然纯化：利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中靠自然淘汰法，不断排挤其他生长慢的细胞，靠自然增殖的潜力，最后留下生长优势旺的细胞，达到细胞纯化的目的（6）克隆培养：挑选单个细胞或单一集落（克隆）于体外进行培养。
常用于细胞克隆化（纯化），建立细胞株，长期传代。
（7）次代培养：用胰酶等将原代细胞消化分散后，再培养一代。
此操作过程叫传代。
（8）细胞系(Cell line):：原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
（9）传代（Passage）：体外培养细胞生长增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液（培养基），这一过程叫传代。
（10）细胞株(Cell strain)：通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。
细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。
二、简答题1．细胞培养基制备的条件：1、营养物质2、缓冲能力3、等渗性4、无菌2．冻存的步骤：①常规技术消化并收集细胞于离心管中离心。
②去上清，加入4 ℃预冷的冻存液，轻轻重悬细胞后，均匀分装于冻存管中，做好标记。
③尽快将冻存管装于纱布袋中，悬于液氮液面上方（-70 ℃）过夜。
④次日转入液氮中。
3．转基因动物的目的基因转入的方法：①电穿孔法②显微注射法③裸露DNA直接注射法④碳酸钙-DNA直接注射法⑤脂质载体包埋法⑥病毒介导的生物学方法。
南方医科大学 《细胞生物学》习题及解答
《细胞生物学》习题及解答第一章绪论本章要点：本章重点阐述细胞生物学的形成、发展及目前的现状和前景展望。
要求重点掌握细胞生物学研究的主要内容和当前的研究热点或重点研究领域，重点掌握细胞生物学形成与发展过程中的主要重大事件及代表人物，了解细胞生物学发展过程的不同阶段及其特点。
一、名词解释1、细胞生物学cell biology2、显微结构microscopic structure3、亚显微结构submicroscopic structure4、细胞学cytology5、分子细胞生物学molecular cell biology二、填空题1、细胞生物学是研究细胞基本规律的科学，是在、和三个不同层次上，以研究细胞的、、、和等为主要内容的一门科学。
2、年英国学者第一次观察到细胞并命名为cell；后来第一次真正观察到活细胞有机体的科学家是。
3、1838—1839年，和共同提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的。
4、19世纪自然科学的三大发现是、和。
5、1858年德国病理学家魏尔肖提出的观点，通常被认为是对细胞学说的一个重要补充。
6、人们通常将1838—1839年和确立的；1859年确立的；1866年确立的，称为现代生物学的三大基石。
7、细胞生物学的发展历史大致可分为、、、和分子细胞生物学几个时期。
三、选择题1、第一个观察到活细胞有机体的是（ B ）。
a、Robert Hookeb、Leeuwen Hoekc、Grewd、Virchow2、细胞学说是由（ C ）提出来的。
a、Robert Hooke和Leeuwen Hoekb、Crick和Watsonc、Schleiden和Schwannd、Sichold和Virchow3、细胞学的经典时期是指（ C ）。
a、1665年以后的25年b、1838—1858细胞学说的建立c、19世纪的最后25年d、20世纪50年代电子显微镜的发明4、（ D ）技术为细胞生物学学科早期的形成奠定了良好的基础。
细胞学实验考试总结
名词解释1.渗透压：水从低渗溶液穿过半透膜进入高渗溶液时产生的压力。
水分子通过半透膜向溶液扩散的现象称为渗透现象，简称渗透；溶液促使膜外水分子向内渗透的力量即为渗透压。
2.高渗：体内的渗透压高于体外，水由环境中向体内扩散，体内的盐分向外扩散。
通过排泄作用排出多余的水，盐分通过食物和组织摄入。
3.低渗：体内的渗透压低于体外，水由体内向环境中扩散，环境中的盐分向内扩散。
水和钠同时缺失，但缺水少于缺钠，血清钠低于正常范围，细胞外液呈低渗状态4.凝集素：是一类含糖的并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。
凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。
5.差速离心：利用不同物质沉降速率的差异，在不同离心速度下分离和收集不同颗粒的离心技术。
常用于分离细胞匀浆中的各种细胞器。
6.荧光：某些物质在一定短波长的光的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光，这种光成为荧光。
7.自发荧光：有些生物体内的物质受激发光照射后可直接发出荧光，成为自发荧光。
8.次生荧光：有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光材料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光。
9.活体染色：是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无害的一种染色方法。
分为体内染色和体外染色（超活染色）。
10.细胞培养：在实验室中用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
11.组织培养：从机体分离出的组织或细胞在体外人工条件下培养生长的技术。
12.原代细胞培养：是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直接到第一次传代为止。
13.传代细胞培养：是指细胞从一个培养瓶以1:2或1:2以上的比例转移接种到另一培养瓶的培养。
细胞培养考试题
细胞培养考试题 Updated by Jack on December 25,2020 at 10:00 am细胞培养试题1、体外培养包括几类什么是组织培养技术体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养三类；组织培养技术是指：从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
2、进行细胞培养的基本条件包括哪些？（1）无污染的环境。
无毒和无菌培养环境是保证培养细胞生存的首要条件。
（2）适宜温度。
人体细胞的适宜温度为℃+℃，偏离时，会影响细胞代谢，甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力比对高温强。
（3）气体和pH值。
开放培养时（碟皿或培养瓶松盖培养），一般置于95%的空气加5%CO2混合气体环境中。
O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。
多数细胞缺氧不能生存。
CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，作用是维持培养基的pH值，细胞要求。
（4）营养物质。
包括糖，无机盐，氨基酸，维生素，促细胞生长因子等。
牛血清是提供生长因子和细胞所需物质的来源。
（5）渗透压。
260-320 m Osm/L 培养基3、原代培养、传代培养、二倍体细胞、克隆细胞株的概念。
原代细胞：直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。
传代细胞：初代培养细胞从第一次传代培养后具有增殖能力的细胞群。
二倍体细胞：细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同的细胞群。
克隆细胞株：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单个细胞增殖形成的细胞群。
4、制备单细胞悬液的方法主要有哪些？（1）悬浮细胞的分离方法是离心法，最简单方法是采用1000r/min 的低速离心10min。
（2）实体组织材料的分离方法有机械分离法和消化分离法，机械分离法包括切割分离法（组织培养法）和机械挤压分离法；消化分离法包括胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶协同用法、EDTA消化法。
细胞培养复习题
细胞培养复习题名称解释细胞培养（动物细胞培养）：动物细胞培养是指将动物活体体内取出的组织用机械或消化的方法分散成单细胞悬液，然后放在类似于体内生存环境的体外环境中，进行孵育培养，使其生存、生长并维持其结构与功能的方法。
组织培养：从生物体内取出活的组织（多只组织块）在体外进行培养的方法。
有时泛指所有的体外培养。
器官培养：是将活体内的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的、配方恒定的培养基。
无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充因子（生长因子和激素、结合蛋白等）组成。
完全培养基：在合成培养基里添加血清后的培养基。
接触抑制：体外培养的细胞在贴附底物上连接成片、相互接触后失去运动的现象。
无限细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
去分化（脱分化）：细胞在体外不可逆地失去原有特性。
注意：去分化不意味分化能力完全丧失！在适当调节信号刺激下仍能表现出分化特性。
但分化能力会随培养时间延长而逐渐丧失。
不适应：各种分化细胞，在体外培养时逐渐失去各自的形态与功能特征，表现出某种趋同性。
原因：培养条件变化使分化发生阻抑细胞分裂指数（MI）：是指细胞群中每1000个细胞中的分裂相数量细胞群体倍增时间：是指培养物中细胞数量翻倍的时间。
原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。
培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。
传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
1）体外培养细胞，其生长方式主要有贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁细胞和悬浮细胞。
2）一般可将贴壁细胞生长的体外培养细胞大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多行细胞型四种类型，最常见的为前两种。
细胞培养学笔记(4)
细胞培养学笔记（4）一、细胞一般形态学观察法1.细胞固定方法:(1)甲醇/醋酸(3:1):甲醇穿透力好易于挥发;醋酸固定蛋白效果好,可使细胞膨胀,结合使用,能维持细胞形态不变,用于观察染色体.(2)FAA固定液:(80%酒精90ml;冰醋酸5m1;中性福尔马林(用时向瓶中加过量MgCO3中和)5ml.) 用于盖片单层培养.(3)Carnoy(纯酒精60 ml;氯仿30ml;冰醋酸10ml):是非水溶性固定液, 穿透力差,适用于显示细胞化学成分等方法,对固定培养单层细胞效果非常好.2.一般染色法:Giemsa染色法: (1)Giemsa粉0.5g,甘油22ml研磨;(2)56℃保温2小时后,加入33ml纯甲醉,保存; (3)pH6.8-7.38的磷酸盐缓冲液,按1:9比例稀释染液;(4)甲醇固定10min,或醋酸/甲醇固定30min, 染色;(5)染10-15min,自来水冲,干燥,二甲苯透化,树脂胶封.胞核染成紫红色或蓝紫色,胞浆染成粉红色.苏木精-伊红染色法:(1)37℃温BSS洗3次,20s-1min,中性福尔马林固定3min;(2)蒸馏水洗1次,再用稀释的苏木精液(1/20)染10min;(3)水洗,置入1%NaHCO3液中漂洗至蓝紫色;(4)伊红水溶液中染30s-1min;(5)蒸馏水洗,迅速通过丙酮2次,每次3-5min;(6)通过2:1丙酮/二甲苯3次,每次1-2min;(7)通过1:2丙酮/二甲苯3次.每次1-2min;(8)纯二甲苯5-10min;(9)把盖片置载物玻片上,用树胶封存,再覆以较大盖片.Feulgen染色法:鉴别细胞中DNA的组织化学方法.细胞中的DNA在60℃,用1M HC1酸解离脱氧核糖核酸,使嘌呤碱基与糖苷键破坏,嘌呤碱脱掉,脱氧核糖中的醛基游离;醛基能与Schiff试剂相结合,形成一种紫色的复合物.(1)单层盖片法培养细胞,Carnoy或醋酸/甲醇固定20-30min; (2) 室温投入1M HC1 1-2min(3) 60℃投入1M HCl 8-10min;(4) 10℃暗处投入Schiff剂中染色1-5h;(5)漂洗液洗2x2min;(6)蒸馏水漂洗2x2min;(7) 酒精75%-100%脱水;(8)透化:二甲苯2次,每次3min;(9)盖片置于载物片上,滴少许树胶,再加较大盖片覆盖;(10)盖片加微型重物加压数日,树胶干后观察.镜下可见,细胞核成粉红色至紫红色,胞质无色.吖啶橙染色荧光观察法:(1)盖片培养细胞,温Hanks洗3-5s;(2)投入95%酒精或醋酸/甲醇min;(3)1%醋酸作用30s;(4)1×10-4吖啶橙染30s或1min; (5) 0.1MCaCl2处理30s -2min;(6)PBS漂洗3次,每次数秒; (7)PBS封片,荧光显微镜下直接观察并拍照.3.透射电子显微镜:常用超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻复型法超薄切片法:取材;固定(戊二醛2.5%-5%;锇酸1%;高锰酸钾;甲醛、多聚甲醛);脱水二、免疫细胞化学技术观察细胞成分法1.原理:用荧光素或酶等标记物或显色物标记特异性抗体,通过免疫学反应与细胞内的相应抗原结合,形成带有荧光素或显色物的抗原抗体复合物.可用荧光显微镜或普通光学显微镜观察到复合物,达到检测细胞内抗原物质的目的.细胞免疫化学包括标本的准备(制备、储存、固定)、染色方法以及结果的分析判断,非特异性染色的减轻、消除等.2.标本制备及固定:细胞可直接培养在盖玻片上、培养瓶内或培养板上,也可将一定量的细胞收集离心制成涂片.福尔马林类1-15 min;丙酮类5-15min; 4%多聚甲醛类3-5min 注意事项:①立即固定,防止细胞自溶,保持其固有的组织结构,保存细胞内的抗原性,使抗原不失活,不发生弥散和保证免疫组化定位准确.彻底清洗多余的固定液,否则将影响免疫组化染色效果.②以室温为宜,某些酶的固定,要求在37℃下进行.3.染色方法(1)免疫荧光技术:直接法:以荧光素标记的抗体直接与标本内的抗原反应,形成抗原-荧光素标记抗体复合物.(1)固定, PBS洗3×3min;(2)荧光素标记的抗体,湿盒内37℃孵育50min, PBS洗;(3)0.1%伊文氏兰复染,PBS洗3×3min,去NaCl结晶;(4)甘油封片,镜检.间接法:特异性抗体与细胞内相应抗原结合,再用荧光素标记的二抗与特异性抗体相结合,形成抗原-特异性抗体-标记荧光抗体的复合物.(1)固定,PBS洗涤3×3min; (2)滴加一抗,37℃40min或4℃过夜, PBS洗3×3min; (3)滴加荧光标记二抗37℃40min PBS洗3×3min;(4)0.1%伊文氏兰复染; PBS洗3×3min;(5)甘油封片,镜检.(2)标本保存及封片介质的制备:如需保存,可在0-5℃暗处保存.用缓冲甘油封固的标本,过夜后特异荧光褪色约25%,一周后褪色约60%,用聚乙烯醇封片,保存的时间长一些.但罗丹明在中聚乙烯醇溶解,故用罗丹明标记抗体的染色标本,不宜用聚乙烯醇封片.缓冲甘油液(pH 8.5)的制备:0.5MpH8.5碳酸盐缓冲液1份,无荧光甘油(AR)9份混合后充分搅匀即可.聚乙烯醇-缓冲甘油混合剂的配制:0.5M pH8.5碳酸盐缓冲液4份,聚乙烯醇1份,混合搅匀(约需6小时)后,再加入1份AR,继续搅拌6h,离心72000转/分,60分钟,去上清液分装在棕色瓶内,4℃保存备用.(4)免疫酶标技术免疫酶标法和免疫荧光法比较:①用普通的光学显微镜即可检测,易于推广;②对比度好,且染色后可长期保存;③可用苏木精等试剂复染,可将免疫组化染色结果与形态学特征相结合进行分析.④不仅可用光镜观察,而且能用于超微结构的研究.直接法原理:先将酶与抗体结合形成酶标抗体,然后和相应的抗原反应,使抗原抗体复合物上带有酶分子,再与酶的底物H2O2- DAB(3’3-二胺荃联苯胺)发生显色反应,在显微镜下观察,根据颜色产物检测相应抗原.间接法是将酶标记在第二抗体上,再与已形成的抗原抗体复合物中的第一抗体反应.目前广泛应用的PAP法、ABC法是在间接法的原理和技术的基础上发展起来的.直接法:(1)标本固定,PBS洗涤2×3min; (2)1% H2O2(1%H2O2甲醇)抑制内源性过氧化物酶,室温10-20min; (3)正常血清(1:10)孵育,室温20min;(4)滴加酶标记的抗体37℃1h或4℃过夜,PBS洗2×3min;(5)DAB+H2O2显色5-10min,镜下控制染色结果;(6)充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检.目前只用于单克隆抗体的筛选及酶联免疫吸附试验.间接法:(1)-(3)同直接法;(4)滴加第一抗体,37℃ 1h或4℃过夜,PBS洗涤3×3min; (5)滴加酶标二抗,室温1h,PBS洗涤3×3min; (6)0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min;(7)充分水洗后,复染、脱水、透明、封片、镜检.PAP法(过氧化物酶抗过氧化物酶抗体复合物法)PAP的基本原理是在间接法的基础上,即在加完酶标二抗以后,再加一个PAP复合物(过氧化物酶-抗过氧化物酶抗体复合物)PAP复合物为由3个酶分子和2个抗酶抗体亚单位构成的复环形复合物,其稳定性很强,冲洗时不会脱落.在这种方法中,PAP复合物中的抗酶抗体与特异性一抗必须来自同一种属动物.其优点是比间接法更为灵敏,而且背景染色低.1)-(3)同直接法;(4)滴加一抗,室温1h或4℃过夜, PBS洗3×3min; (5)滴加二抗,室温30min,PBS洗3×3min; (6)加PAP复合物,室温60min,PBS洗3×3 min;(7)0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min; (8)充分水洗,苏木精复染,封片观察.双PAP法:这种方法可在复合物体系中连接更多的PAP复合物,对抗原可进一步放大,因此灵敏度更为增强,适用于微量抗原的检测.(1)-(6)同单PAP法;(7)二次加二抗,PBS洗;(8)二次加PAP, PBS 洗;(9)0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min; (10)苏木素复染核,封片,镜检.ABC法(卵白素-生物素-过氧化物酶复合物法):由于卵白素与生物素具有高度亲和力,可形成卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC复合物),ABC复合物与生物素化二抗结合,最后形成抗原-抗体-生物素化二抗-ABC复合物.(1)-(5)同PAP法;(6)加ABC液(A与B液等量,于用前30min混合),室温60min,PBS洗;(7) 0.04%DAB+0.03H2O2显色5-10min;(8)充分水洗;苏木精复染、封片、镜检.。
细胞培养设计知识点
细胞培养设计知识点细胞培养是生物学和医学领域中的一项重要技术，它是指将细胞体外培养，并为其提供必需的条件来生长、繁殖和维持特定功能。
细胞培养的设计是成功进行细胞培养实验的关键，下面将从培养基的选择、细胞传代、处理细胞的方法以及细胞培养的环境控制等方面介绍细胞培养设计的相关知识点。
一、培养基的选择培养基是细胞培养中最重要的基础，它提供了细胞所需的营养物质、生长因子和环境条件。
培养基的选择应根据具体实验目的来确定。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，不同类型的细胞常使用不同的培养基。
此外，还需要添加适当的血清、抗生素和缓冲剂等，以确保细胞的正常生长。
二、细胞传代细胞传代是指将细胞从一种培养器皿转移至另一种培养器皿中，以维持细胞生长和细胞系的延续。
在细胞传代中，需要注意以下几个知识点：1. 细胞密度：细胞密度应适当，过低会延长细胞生长周期，过高会导致细胞死亡和凋亡。
通常，当细胞生长至80%至90%的密度时进行传代较为适宜。
2. 去除培养容器中的血清：在细胞传代前，应将培养容器中的血清彻底去除，以免对细胞的生长产生影响。
3. 使用胰蛋白酶消化细胞：胰蛋白酶可以帮助将细胞从培养容器表面解离下来，以进行传代。
消化时间和使用的浓度需要根据不同的细胞类型进行调整。
4. 倍液和重新分装：将胰蛋白酶消化的细胞与新的培养基混合后，需要进行适当的倍液和重新分装，以提供新的生长环境。
三、处理细胞的方法在细胞培养过程中，有时需要对细胞进行处理以满足实验的需要，这涉及到以下几个知识点：1. 细胞冻存：将细胞冷冻保存可以长期保存细胞，并且在需要时可以重新进行细胞培养。
在细胞冻存过程中，需要使用适合的冻存液和冷冻容器，同时控制冻结速度和解冻温度。
2. 细胞分离和纯化：当需要分离细胞亚群或纯化细胞时，可以使用特定的细胞分离方法，如离心、负选择法、正选择法等。
3. 细胞转染：将外源DNA导入细胞内，以实现目标基因的表达或基因沉默。
细胞培养学笔记(2)
细胞培养学笔记（2）一、组织培养的基本操作和培养技术1.培养操作基本要领和要求（1）无菌操作:防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。
(2)培养前准备:a.操作野消毒: 室内及台面紫外消毒,主要用于消毒台面上用品。
紫外灯照射期间,在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物,以免受射线影响必要时可用纸张覆盖。
物品相互遮挡射线,会降低消毒效果。
b.洗手和着装:利用净化台需着白服；在无菌室内工作需着消毒衣帽。
c.火焰消毒:在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时,首先要点燃酒精灯。
以后一切操作,如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等,都需经过火焰烧灼进行。
注意:金属器械不能在火焰中烧的时间过长,以防退火。
烧过的金属镊等要待冷却后才能挟取组织,以免造成组织损伤。
已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼,因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入培养液中。
(3)培养操作:动作准确敏捷,但又不必太快,以防空气流动,增加污染机会。
不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒触及部,如不便消毒时,应取备品更换。
为便于拿送用品,工作台面上的用品要有合理的布局,酒精灯置于中央。
要保持一定顺序性,组织或细胞未做处理之前,勿过早暴露在空气中,培养液未用前,不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口。
吸取营养液、BSS、细胞悬液及其它各种用液时,均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致细胞交叉污染。
工作中不能面向操作野讲话或咳嗽,以免发生污染。
2.基本培养操作技术(1)取材:a.取鸡胚组织:方法与前述取鸡胎汁法相同。
b.取鼠胚组织:引颈法杀死动物; 浸入盛有75%酒精的烧杯中,置2-3秒钟后,取出,使体表灭菌,置入碟皿中,在动物躯干中部用尖剪刀环行切开皮肤,用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾两端,把动物躯体翻包起来,暴露出胸腹部,剖腹取出鼠胚或其它组织,置无菌碟皿中备用。
注意:小鼠在酒精中浸泡时间不能过长,以免酒精从口或其它孔道侵入体内影响组织活性。
南方医科大学研究生细胞培养技术考试重点总结
一. 细胞培养技术的概念,简史在体外对细胞培养并进行研究的技术, 也叫细胞克隆技术. 细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
细胞培养技术主要包括二大方面内容:1.微生物细胞培养技术2.动, 植物细胞培养技术：1) 器官培养技术 2) 组织培养技术 3) 细胞培养技术二. 细胞培养的优点1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动2.可控制：（1）可控制-选择对象：类型：上皮？间质？性质：正常？肿瘤？（2）可控制-调节条件：各种因素:物理、化学、生物等因素（3）可控制-利用方法。
采用各种研究技术、记录方法：研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记--记录：摄影照片、缩时电影、电视--3. 应用广（1）学科多：（2）对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类；一种动物：不同年龄；不同组织: 正常或异常（肿瘤）4.较经济：花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象5. 不易污染环境三、细胞培养的缺点1. 现人工无法完全模拟体内环境：a. 失去彼邻关系b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响2. 细胞趋向单一化3.失去原有组织结构和细胞形态4.分化减弱或不显：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
5. 某些类型细胞还很难培养6.大规模培养难度大四. 体外细胞培养的方式1.粘附型培养: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
粘附是大多数有机体细胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式2.悬浮型培养: 不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
来源:来自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团优点 : 生存空间大，提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获可获得稳定状态.缺点:观察不方便, 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)五.体外培养细胞的生长形态分类根据形态大致的不同，主要2类：1.上皮样：来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物, 消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状2.成纤维细胞样：培养中形态与成纤维细胞类似。
细胞培养技术考试重点
细胞培养技术考试重点名词解释：1.群体倍增时间：细胞指数增长期时，细胞群倍增所需的时间。
是由于表示群体细胞指数生长期内细胞分裂活动的程度，是判断细胞生长是否旺盛的重要指标。
2.接触抑制（contact inhibition）：细胞相互接触后失去运动的现象。
3.密度抑制（density inhibition）：由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多和生存空间消失所引起的细胞增殖的抑制现象。
4.肿瘤干细胞(tu mor stem cells，TSC)表现为一种特殊类型的干细胞，具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化的潜能。
TSC增殖过程中，通过不均一分裂，一个TSC分裂形成一个新的TSC 和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持TSC数目稳定并产生肿瘤。
5.细胞汇合(Confluent)：指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。
6.饱和密度(Saturation density)：在特殊培养条件下，每平方厘米(单层培养)或每毫升细胞悬液内可达到的最大细胞数。
7.二倍体细胞系或株(Diploid cell line or strain)：具有二倍体染色体数的细胞系或株。
8.二倍体(Diploid)：指双倍数的染色体数或具有此数的细胞系。
9.组织工程：是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。
10.细胞融合(Cell fusion)：指两个独立的细胞借媒介物(PEG等)融合成杂种细胞的过程。
11.细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。
12.三维培养：把细胞悬液接种在一定立体形态的支架上，使细胞生长在三维环境中的培养方法。
13.平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）：简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。
细胞培养考试重点整理
细胞培养考试重点整理第一章绪论体外培养（IN VITRO CULTURE）：是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或活体器官等）甚或活的个体从体或其寄生体取出，模拟体的生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使之存活和生长发育的方法。
按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为分为：组织培养（tissue culture）指从生物体取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养（cell culture）指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养（organ culture）指从生物体取出活的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或者器官原基在体外进行培养的方法。
单一化现象组织培养过程中，培养组织不能在体外长期维持其结构和功能，培养的时间长，经过反复传代，细胞出现单一化现象——趋向单一类型的细胞——最终成为细胞培养。
体培养（IN VIVO CULTURE)：将活体结构成分（如活体组织、活体细胞、活体器官等）甚至活的个体从体或其寄生体取出，放在其他生物体让其生长和发育的方法。
最常见的体培养方式就是移植（trans-plantation）。
体外培养技术创立代表性的人或者实验H ARRISON的工作，较为完善地建立了体外培养活体组织的培养体系，第一次较为系统地观察了体外培养活体组织的结果。
被公认为是体外培养技术的的开始。
标志着体外培养技术的创立，标志着盖玻片悬滴培养法的建立，标志着神经组织体外培养的开始，也标志着神经突起是由神经细胞长出的这一重论的诞生。
C ARREL对体外培养的贡献：◆将无菌操作观念引入体外培养过程中。
◆将培养组织包埋技术、营养供应以及继续培养（也称传代或继代培养）等许多重要的培养条件和方法引入盖玻片悬滴培养系统，从而完善了Harrison的方法。
◆发现鸡胚浸液能明显地促进多种细胞的体外生长。
◆设计卡氏培养瓶减少了污染，扩大了细胞生存空间。
现在一般认为体外培养技术是从Harrison和Carrel真正开始的。
细胞组织培养重点
体外培养包括组织培养、细胞培养、器官培养Tissue culture:从体内取出组织摹拟体内的生理环境，在无菌、适当温度、和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
细胞培养：培养物是单个细胞或细胞群。
细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。
器官培养：与组织培养条件相似，培养的是器官的原基，器官的一部分或整个器官，以便能够在体外生存、生长和保持一定功能的方法体内外细胞分化的差异：“反祖”（Atavism)现象：细胞失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显；表现为细胞趋于单一化，或获得永生性，或变成具有恶性性状的细胞群。
不适应（deadaption) 细胞在原体内时所拥有的分化特征减弱或不显。
（培养的肝细胞酪氨酸转移酶特性丧失）。
生存条件改变使分化阻抑。
脱分化或去分化：细胞失掉发生分化的能力（培养的肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失去储存肝糖原能力）。
是基因突变所致培养细胞在体外生存时间与其分化能力呈反向关系。
细胞分化的关键在于是否存在有诱导细胞发生分化的因子原代培养（primary Culture) 从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。
细胞群是异质的，细胞相互依赖性强。
细胞独立生存性差。
传代培养：当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新培养液，继续接种进行培养。
这一过程称为传代。
否则将影响细胞的继续生存。
组织培养细胞生命期：原代培养期传代期衰退期细胞系（cell line)：初代培养细胞一经传代后，称做细胞系。
无限细胞系：细胞获永久性增殖能力。
核型大多变成异倍体。
克隆形成率（Cloning Efficiency)：细胞被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。
克隆细胞株:从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法,由单细胞增殖形成的细胞群冻存配方：向培养液中加入DMSO或甘油，封与安瓶，存于温度达-196℃液氮中长期储存连续细胞系：获得持久性增殖能力的细胞群体。
细胞培养笔记
细胞培养编辑细胞培养细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。
不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。
细胞培养，既包括微生物细胞的培养，细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。
通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。
因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
目录1基本概述2设施器材3培养基4具体步骤5一般过程6一般条件⑴温度⑵pH⑶渗透压⑷营养物⑸水⑹无菌条件⑺光⑻气体7培养条件动物细胞培养植物细胞培养微生物细胞培养8注意事项9意义10方式群体培养克隆培养11优点12不足1基本概述细胞的生长需要营养环境，用于维持细胞生长的营养基质称为培养基。
培养基按其物理状态可分为液体培养基和固体培养基。
液体培养基用于大规模的工业生产以及生理代谢等基本理论的研究工作。
液体培养基中加入一定的凝固剂（如琼脂）或固体培养物（如麸皮、大米等）便成为固体培养基。
固体培养基为细胞的生长提供了一个营养及通气的表面，在这样一个营养表面上生产的细胞可形成单个菌落。
因此，固体培养基在细胞的分离、鉴定、计数等方面起着相当重要的作用。
从多细胞生物中分离所需要细胞和扩增获得的细胞以及对细胞进行体外改造，观察，必须解决细胞离体培养问题，同微生物细胞培养的难易相比，比较困难的是来自多细胞生物的单细胞培养，特别是动物细胞的培养。
细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境等特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。
细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一。
[1]2设施器材设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、电热鼓风干燥箱、冰柜、电子天平、恒温水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。
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一. 细胞培养技术的概念,简史
在体外对细胞培养并进行研究的技术, 也叫细胞克隆技术. 细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
细胞培养技术主要包括二大方面内容:
1.微生物细胞培养技术
2.动, 植物细胞培养技术：1) 器官培养技术 2) 组织培养技术 3) 细胞培养技术
二. 细胞培养的优点
1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动
2.可控制：（1）可控制-选择对象：类型：上皮？间质？性质：正常？肿瘤？
（2）可控制-调节条件：各种因素:物理、化学、生物等因素
（3）可控制-利用方法。
采用各种研究技术、记录方法：
研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记--
记录：摄影照片、缩时电影、电视--
3. 应用广（1）学科多：（2）对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类；一种动物：不同年龄；不同组织: 正常或异常（肿瘤）
4.较经济：花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象
5. 不易污染环境
三、细胞培养的缺点
1. 现人工无法完全模拟体内环境：
a. 失去彼邻关系
b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响
2. 细胞趋向单一化
3.失去原有组织结构和细胞形态
4.分化减弱或不显：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
5. 某些类型细胞还很难培养
6.大规模培养难度大
四. 体外细胞培养的方式
1.粘附型培养: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
粘附是大多数有机体细胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式
2.悬浮型培养: 不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。
来源:来自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.
特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团
优点 : 生存空间大，提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获可获得稳定状态.
缺点:观察不方便, 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
五.体外培养细胞的生长形态分类
根据形态大致的不同，主要2类：
1.上皮样：来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物, 消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
2.成纤维细胞样：培养中形态与成纤维细胞类似。
来源：中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮
形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核。
3.其它，不定型
六. 常用术语
1.细胞系（cell line ）：原代培养物首次传代后，就可以称细胞系。
不能或有限传代下去称有限细胞系。
能连续传代的称连续细胞系。
2.细胞株：某类细胞经传代克隆并保持了该类细胞理化特征的细胞群体。
3.原代培养：直接取自生物体的组织细胞并进行培养
4.传代培养：将细胞从一个培养物内分散到另一个培养物的过程。
5.转染（transfection ）：将某个基因转移到培养细胞核内。
6.lipofection ：常用细胞转染剂（脂质体），它搭载基因（DNA ）后形成复合物可转染到动物细胞。
第二章 细胞培养的条件及设备
一、细胞培养室
二、常用设备
1. 超净工作台；
2. 纯水装置；
3. 抽气泵；
4. 消毒装置；
5. 干燥装置；
6. CO2培养箱(孵箱)；
7. 液氮生物容器；
8. 冰箱；
9. 离心机 10. 天平 11. 显微镜 12. 过滤装置 13. 空调 14. 酸度计 15. 干燥器
三、常用消耗器材
1.培养瓶及各种相关玻璃用品、塑料用品和棉制品
2.手术器材
四、培养用液
1.天然培养基（液）：血清、鸡胚浸出液、鼠尾胶
2.人工合成培养液：合成培养基、平衡盐溶液、缓冲液、蒸馏水、消化液和抗菌素等
五、消耗性器皿的清洗、包装及消毒
第三章细胞培养基本技术
一、原代培养基本技术：取材→漂洗→剪切→消化→计数→接种
二、传代培养技术：去旧换新液→消化→分装
三、细胞冻存及复苏技术
培养液高度：2.5~3.0mm
第四章每代细胞基本的生长过程
一. 游离期：细胞接种后最初一段时间, 细胞在培养基中呈悬浮状, 胞体圆形
二. 贴壁期：细胞附着于支持物上
三. 潜伏期：
四. 指数增长期
影响因素
1. 细胞种类
(附着最强)巨噬细胞(30’)一成纤维
细胞——上皮细胞——血细胞(最弱)
2. 生物因素
血清、培养液中的促附着因子
3. 机械，物理等
离心：促进附着
流动：培养液流动可阻止细胞附着
低温：可抑制附着
增加细胞粘附的措施（因素）
1.增加支持物粘附性
a.赖氨酸类
b.血清
c.某些生物活性物质,纤维性物质
d. 减少接种时细胞悬液的量
待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液
e. 减少培养液中血清的含量
使培养液黏度降低
f. 培养液中离子成分及其浓度
如，培养液中的Ca含量过低时不利于
细胞的粘附、贴壁和铺展
g. 培养液的温度
低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁
伸展过程
细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状
当接触坚硬平面
即铺展于底物上，扁平状
与底物形成很多接触点
伸展分几个阶段
(1)开始阶段
开始附着铺开
细胞附着于底物
球形的细胞，下方表面与底物接触成扁
但尚未形成新的伪足
(2)放射状铺展阶段
在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起
伪足形状
主要柱形丝状: 直径0.2-0.5um 长10-20
扁平片状: 厚0.1-0.5 宽2-5
尚有: 小泡状叶状: 直径1-2
开始时: 絲状多
以后片状增加
许多伪足
形成薄的胞质小片牢固贴于底物
胞体中央部分扁
整亇细胞扁平
(3) 极化阶段
细胞最后伸展附着的情况
实验：用多种细胞，
以显微操作及缩时电影
定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况
检测--显微针头—
结果：附着规律
附着点：附着规律
几乎未见于细胞的中央区
(如不在核之下)
总在边缘，边缘”摆动”活动的部位
凸的边缘
在薄的边缘
附着区：
约为细胞下面表面的15-35％
附着、伸展的条件
底物
细胞能在很多固体表面附着
最终铺展的程度，取决于底物的性质
影响因素：
活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中，
或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上如Fn，胶原，聚赖氨酸
机械，物理因素
三. 潜伏期
细胞活着但无分裂.
细胞株6—24h
原代24—96h
☐四. 指数(对数)增长期
☐细胞增殖旺盛, 数量成倍增多, 最适合实验研究. 3—5d以后来到.
☐判断方法:
☐ a. 细胞群体倍增时间
☐ B. 细胞分裂指数
☐五. 停止期(衰退期)
☐细胞长满瓶壁, 有活力, 不增殖, 能存活一段时间. 如传代进入下一循环. 传代培养到一定的代数时，细胞的生命活动明显减弱。
即使及时传代也无效
表明培养物已经进入衰退期，再向前发展，只有退化、死亡
接触抑制和
密度依赖性生长仰制
增殖的密度抑制
实验
方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿，
5d细胞计数
于加入10％、20％、30％牛血清的
培养液中，结果：。