微藻的固体培养

微藻的固体培养沈世军中国海洋大学青岛2660031摘要微藻的培养多数采用液体培养的方式进行。

液体培养时营养物交换迅速，微藻生长快，同时缺少有机成分，杂菌也不易繁殖。

然而，液体培养基高流动性的特点造成藻种纯化的困难，同时高代谢率也不利于藻种的长期保存。

固体培养恰好弥补了上述不足。

固体培养因为在藻种分离、陆生微藻的培养与藻类种质保藏中的优势多有应用。

过去对微藻固体培养的研究多是在具体实验过程中进行的单独探索，缺乏系统、全面的总结。

本文将对最近微藻固体培养研究方面的成果进行整理，阐明固体培养的优势与缺点，总结微藻固体培养现在依旧面临的问题，为将来的研究提供参考。

本文根据固体培养的用途，包括分离藻种、微藻培养、种质保藏和陆生藻的培养，而分别进行介绍。

关键词：微藻固体培养无菌化种质保藏植物激素营养盐引言微藻本身多生活于水中，所以液体培养基适宜多数微藻的生长，应用也十分广泛。

液体培养基流动性强，有利于气体（特别是二氧化碳）的溶解、营养元素的吸收，同时微藻在液体培养基中生长阻力小。

除此之外，液体培养基中几乎不含有有机组分，能减少细菌滋生，避免由细菌繁殖引起液体浑浊和有害代谢产物积累而限制微藻生长。

这些因素使微藻在液体培养基中生长迅速，细胞健壮。

液体培养也是藻类培养中应用最普遍，效果最好的培养方式。

然而，液体培养也有一些缺点使其不能完全满足实验需求。

首先，液体培养基的高流动性使藻种高度混合，尤其是在充气培养的条件下，藻种在整个培养基中快速移动，特别不利于微藻的纯化培养；其次，微藻在液体培养基中代谢水平普遍较高，世代时间也相应缩短，不利于遗传稳定性的保持，而且一旦藻种被污染，液体培养的种质由于其高度混合的特性，藻种将全部受害，故而液体保存种质既不利于长期保存，也不利于种质安全；最后液体培养也不能适应发菜、普通螺旋藻、钝顶螺旋藻等陆生微藻的生长。

将普通螺旋藻进行液体培养时，虽然其生长依旧旺盛，但其形态与生理生化特征与野生状态的普通螺旋藻还是有显著差异的[1]。

这对于陆生藻的形态学和生理生化研究是非常不利的。

固体培养一方面可以弥补液体培养的上述不足，另一方面还能实现藻种无菌化培养的目的，是分离无菌种质的重要手段[2]。

于此同时，固体培养也有利于毒理学的研究，由于固体1男，1991年8月20日，shenshijun91@，178********培养基上微藻平铺于培养基表面，少量毒物就能达到实验目的；同时，藻落的固定也有利于毒性反应的观察[3]与抗毒藻株的选育。

然而，现阶段微藻固体培养的研究遇到一些问题，比如藻体消毒手段的欠缺和培养基对藻落生长的限制等。

这就需要对之前的经验进行总结，明确今后的研究方向。

正文固体培养主要作为微生物的培养手段使用，在微藻的培养中应用不多。

这一方面是固态的培养基阻碍物质交换和藻体生长，固体培养基表面容易干燥，对水生微藻的健康生长构成威胁；另一方面固体培养对无菌操作有着更高的要求，若不能实现无菌化，细菌将会在培养基表面大量繁殖，产生有害代谢产物而影响藻类本身的生长[1]。

如能解决上述难题，固体培养还是有很大的应用前景的。

现阶段微藻固体培养已经得到相当的研究，其应用的范围主要包括四个方面：微藻的纯化、增殖、保藏和陆生藻的培养。

微藻的纯化与增殖。

微藻纯化既包括除去其中的杂藻，也包括除去杂菌。

去除杂藻的步骤主要是先通过不同微藻的生理特性来尽量降低杂藻的浓度，杜氏盐藻就可利用反复提高盐度和恢复正常盐度的方法除去大部分杂藻[3]，衣藻则可利用其向光性达到这样的效果[2]，另外，二氧化锗可除去硅藻[4]法。

除杂藻的过程中，最关键的是保存目标藻株，避免其在处理过程中受到伤害。

处理后的藻液要喷撒到固体培养基的表面。

当出现分离的藻落时，将各藻落分别用显微镜进行镜检，找到目标藻种。

从以上分离藻种的过程中可以发现，固体培养是藻种分离中不可或缺的实验方法，也是纯化效果检验的重要方法。

固体培养将藻种固定在特定位置，提高了分离的便捷性。

除了固体培养外，毛细管法也是获得纯化藻种的有效方法[5]。

纯化藻种的另一方面，去除杂菌则相对困难一些。

由于细菌个体极微小，适应性很强，通常吸附于微藻表面，使得无菌藻种的获得非常困难；而且某些细菌与微藻共生，去除后微藻长势变差，这也增加了实验的难度。

但是无菌藻种的优势又十分明显，无菌藻种克服了微藻培育中最大的不可控变量，对于微藻生理生化特征的定量研究意义重大。

微藻的除菌现在常用的方式是抗生素法，包括卡那霉素，硫酸链霉素等。

这主要还是因为抗生素的特异性较强，对微藻本身生长的影响较小[6]。

当然使用柠檬酸钠、升汞等化学方法处理而成功获得无菌藻株的事例也有报道。

经处理过的藻液采取喷雾法或划线法在固体培养基上涂布藻种，达到分离无菌藻落的目的。

此时固体培养基除了需含有微藻生长所需营养盐外，还要含有细菌生长所必需的的营养物质，一般用牛肉膏-蛋白胨琼脂培养基，也可加入土豆或豆芽提取液，促进细菌的生长，令染菌的藻落充分暴露，达到分离目的[6]。

此外，固体培养也应用于微藻的无菌增殖。

固体培养的一个优势就是杂菌污染和细胞分泌物不易扩散，特别利于藻种的安全性和突变藻体的分离筛选[4]，在无菌培养中有很多应用。

其中最常见，研究最多的就是紫菜。

紫菜属于红藻门，体细胞为单倍体，若能将藻体酶解并培养这些分离的细胞，再分化成紫菜幼苗，便能实现紫菜的快速繁殖[8]。

紫菜成体的酶解一般采用细菌酶、葡萄糖酶或海螺酶进行酶解，获得原生质体。

然后将原生质体喷洒或划线分散在培养基表面，密封并在光照条件下培养。

由于固体培养的气体交换性差，可加入碳酸氢钠作为碳源。

数日后便可长出藻落，并分化出新的叶状体。

培养过程中的氮源以硝态氮为佳，浓度0.47-18.8µM，磷浓度以0.01µM-0.14µM为好，低于0.03µM或高于0.3µM都不利于原生质体的生长，最优氮磷比是5:1[9]。

此外，0.1μg／mL的生长素和1μg／mL-2μg／mL的6-BA（细胞分裂素类似物）可有效促进原生质体的生长于分化[7]。

除了紫菜，还有很多单细胞微藻。

对于这些微藻的无菌培养，最重要的是确定琼脂浓度，琼脂浓度过高不利于物质交换会抑制藻类生长，过低又不能很好地固化凝结，实验所得最适琼脂浓度是1%到2%[10]，当然琼脂用量不能机械地照搬硬套，应根据琼脂的质量与特定藻类的需求而调整。

对于没有细胞壁或细胞壁较为脆弱的藻类，如金藻等，就应该适当减少用量。

营养盐则应参照液体培养基的配方并适当增加用量，借以弥补由于固体形态对物质交换的阻碍。

金藻和硅藻不容易在固体培养基表面生长，有可能是由于固体表面张力较大的缘故，加入100-500µg/L的表面活性剂可明显改善其生长状况[11]。

由于单胞藻种类多样，所以氮源的种类也要区别不同物种分别对待[12]。

微藻的保藏。

微藻的保藏是固体培养另一个重要运用领域。

固体培养基物质交换速度慢，基质固定，既降低了微藻的代谢速率，又避免了杂菌杂藻的蔓延，是一种安全有效的保种方式。

固体方法保藏杜氏盐藻通常能达到半年到一年时间，而液体培养多数半年以下[3]。

如果在培养基中加入适量碳酸氢钠作为碳源[12]，其保种时间还能延长。

这样便能减少传代次数，降低劳动强度，保持藻种遗传稳定性。

固体保种通常用软琼脂保藏法，即加11%的f/2培养液和0.6%的琼脂用海水混合溶解，灭菌，冷却并维持42℃的温度，注入20%浓缩藻液，迅速用自来水冷却，培养将接种完毕的固体培养基置于:温度20℃的房间内,自然光照(3000~5000lx左右,避免直射光)的环境条件中培养,约2周时间。

在其表面覆盖0.3cm厚度的单胞藻培养液8~10℃的低温培养箱中,给予自然光照[13]。

这种方法一方面抑制了藻的代谢，另一方面表面的单胞藻培养液也避免了培养基的干燥。

如果应用培养皿表面培养的方法，则需20-25天接种一次，25天以上不接种会有衰退。

固体培养基藻种若需要长期保存, 可在藻类生长完全后, 注入经过灭菌的液体石蜡, 这样, 能延长保存时间至5一6 个月[2]。

将微藻与褐藻酸钠混合并制成胶球，在一定湿度下低温保藏也是很好的保藏方法。

这样一方面能够通过调节胶球的大小，缓解胶球内物质交换受到的阻碍，另一方面低温的环境也能抑制微藻的繁殖，使保藏时间进一步延长，并且能节约空间，减少劳动强度，是现今重要的研究方向。

在制备固体培养基时加入25mg /L的山梨酸钾，具有明显的抑菌效果，同时其对微藻的生长也不会造成不利的影响[12]。

此外，柠檬酸钠对于细菌的繁殖也有抑制作用，可适量加入固体培养基中。

固体培养还应用于陆生微藻的培养。

陆生藻包括普通螺旋藻、发菜、地衣共生藻等种类。

它们由于特殊的生长环境，并不十分适合液体培养，即使能够获得成功，获得的微藻也与野生型存在着形态与生理生化上的差异。

普通螺旋藻的固体培养首先于土壤培养基上获得成功，但由于藻种不够纯净，20天后杂藻繁殖，藻体死亡，尚不清楚为什么在液体培养基中普通螺旋藻能够对杂藻保持优势而在固体培养基上却会受到杂藻的抑制。

而在琼脂培养基上则是细菌的繁殖令螺旋藻直接被微生物毒害而死亡，这也充分说明了有效的除菌方式对于固体培养的极端重要性。

由于螺旋藻属于原核生物，受多数抗生素（卡那霉素、硫酸链霉素、氨苄青霉素等）的抑制，只能使用升汞、柠檬酸钠等化学物质处理，若把握不好处理浓度和时间，极易造成螺旋藻的死亡，所以还需要更多的研究。

海藻酸钠小球固体培养效果最好，1个月后小球被螺旋藻占据，2个月小球破裂[1]。

其它陆生藻的固体培养则报道不多，这主要是由于液体培养能够直接用过滤的方式获得纯净的藻体，相比于从固体培养基上分离藻体的繁琐过程，更加能满足藻类产业化培养的要求。

对于实验研究来说，现在处于探索各种陆生藻最佳培养条件的阶段，将微藻的快速生长和稳定保藏作为研究重点，固、液培养条件下藻类的生理生化差异还没有引起研究者足够的兴趣，研究并不多。

此外，固体培养在毒理实验也有应用，可以更加直观地反映毒物的影响[3]，对于抗毒藻株的筛选有着很好的应用前景。

固体培养在其他方面的应用还需要更加深入的研究探索。

结论综上，微藻固体培养的研究已经有很多，也取得了许多的成果，尤其是在微藻的纯化、增殖与保藏等方面的应用十分广泛。

但是在这一过程中也遇到了很多的困难。

首先，缺少对微藻进行除菌抑菌的合适方法。

决定固体培养成败的最大难点是高效除菌方式的确定，如果除菌力度太大可能会妨碍微藻生长，甚至造成死亡，若除菌力度过小则会令细菌占据培养基，微藻仍然生长不好，所以找到更多合适的抑菌除菌方法是未来的一大研究方向，这方面的成功也能使固体培养的适宜培养微藻的种类进一步扩大。

其次，培养基配方并不完善。