淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察
08实验八+细胞凋亡的诱导和细胞凋
(2)高浓度盐Ca2+的处理:
100nmol/L或500nmol/L的CaCl2或NaCl处理洋葱 内表皮8h左右; 48h后用改良苯酚品红染液染 色30min,清洗;镜检。
三、材料和试剂
材料:人类淋巴细胞株、洋葱内表皮 试剂:100μmol/L cyt c的水溶液、 100nmol/L或500nmol/L的CaCl2、改良苯 酚品红染液
四、实验方法与步骤
1.取样
(1)人类淋巴细胞株的培养
(2)直接撕取洋葱内表皮细胞
2.细胞调亡的诱导 (1) cyt c处理: 共做三组样品。试验组样品要先经cyt c处 理,浓度为12.5 μmol/L,时间控制在48h左右; 正对照样品不需要处理,为正常生长的细胞; 负对照样品是将正常细胞煮沸10min,使其坏死。
五、 实验结果
形态学变化 调亡率统计
四、实验报告
设计一个刺激诱导PCD的实验。
(3)不同机械刺激的处理(温和):
冷激、热激、振荡等
3.形态学观察 在显微镜下观察细胞形态变化,比较和描述不同调
亡诱导,诱导细胞调亡形态变化的异同点并对试验
组细胞进行调亡率统计。
计算调亡率=(调亡细胞数/总细胞数)×100%。
在光学显微镜下照相(数码互动显微镜)。
4.DNA电泳(梯状DNA)
实验八 细胞凋亡的诱导和细胞凋亡的 形态特征的观察
一、实验目的
了解细胞调亡的原理;
掌握用于细胞调亡检测的常规方法。
二、实验原理
细胞死亡作为生物体的一种常见现象,一般可 分为两种类型:细胞坏死和细胞程序性死亡 (PCD),也称细胞调亡。 细胞程序性死亡分为两类:受体介导的细胞程 序性死亡和线粒体介导的细胞程序性死亡。 调亡细胞的形态学观察:HE染色、Giemsa染色、 台盼蓝染色、改良苯酚品红染色;细胞调亡生 化特征的检测:DNA电泳、细胞膜磷脂酰丝荧光 显示、调亡细胞原位末端标记法。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式:凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡,坏死过程细胞膜通透性增高,细胞肿胀,核碎裂,继而溶酶体、细胞膜破坏,细胞容物溢出,细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语,意思是花瓣或树叶凋落,意味着生命走到了尽头,细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩,表面微绒毛消失,染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘,继而核裂解,由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面,最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整,不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活,染色体DNA被降解,断裂为50~300 kb长的DNA片段,再进一步断裂成180~200bp整倍数的寡核苷酸片断,在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1.细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征,据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂,一般采用多种方法综合加以判断,同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同,方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的(表?)。
形态学观察方法:利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征:(1)DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
借助于DAPI染色,可以观察细胞核的形态变化。
(2)Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。
(3)吖啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察,活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
实验十三放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察PPT课件
• 最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细 胞吞噬。
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凋亡小体
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• 生化特征: 内源性核酸内切酶基
因的活化和表达,导致 凋亡细胞的染色质 DNA的有控裂解,得 到的DNA片段的长度 为200bp的倍数。
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二、程序性细胞死亡的意义
• 1.动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的 正负控制以及对程序性细胞死亡的正负 控制来维持细胞总数的平衡和机体的生 命活力。
You Know, The More Powerful You Will Be
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结束语
当你尽了自己的最大努力时,失败也是伟大的, 所以不要放弃,坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人:XXXXXX 时 间:XX年XX月XX日
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材料及设备:
HeLa贴壁培养细胞、250 mg/ml 放线菌素D (Actinomycin D)、吖啶橙荧光染料、 卡诺氏固定液、0.9%生理盐水、10%甘 油
荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一 次性吸管、离心机、EP管、培养皿、小 烧杯等。
15实验步骤ຫໍສະໝຸດ • 1.诱导: 向处于对数生长期的Hela细胞中加入250mg/ml的放
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• 3.细胞预固定和固定:
加入0.9毫升生理盐水,悬浮细胞, 使细胞分散,加入0.1毫升卡诺氏固定 液,混匀;离心,去上清(保留0.1毫 升生理盐水);
加入固定液至1毫升,小心悬浮 细胞,室温下固定处理10min,离心, 去上清,加入0.1毫升固定液,小心充 分混匀细胞;
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学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂
表1 常见的细胞凋亡诱导剂和抑制剂诱导剂与抑制剂靶细胞诱导剂激素地塞米松T细胞细胞因子IL—2 胸腺细胞TGF—β肝细胞、上皮细胞、慢性B淋巴瘤细胞IL—10 髓样白血病细胞IFN—Υ前B细胞、T细胞抗体抗IgM抗体B细胞抗IgD抗体B细胞抗HLA—II抗体静止B细胞超抗原SPE CD4+T细胞胞内信号分子调节剂放线菌酮T细胞PKC激活剂胸腺细胞其他DNA拓扑异构酶抑制剂白血病细胞放射线淋巴样细胞抑制剂细胞因子IL—2 T H1细胞IL—4 T H2细胞IL—10 B、T细胞IFN—ΥT细胞IL—4 B细胞黏附分子LFA—1、ICAM—1 B细胞VLA—4、VCAM—1 B细胞胞内信号分子调节剂PKC激活剂T、B细胞细胞凋亡(apoptosis)是一种由基因控制的细胞自主死亡方式。
1972年,英国教授Kerr首先提出凋亡的概念。
近十余年来,细胞凋亡现象引起了广泛重视,有关的研究工作取得重要进展,并成为医学生物学各学科共同关注的极为活跃的研究领域。
细胞凋亡与组织器官的发育、肌体正常生理活动的维持、某些疾病的发生以及细胞恶变等过程均有密切的关系。
1.形态学变化:细胞凋亡的形态变化大致可分为三个阶段:1)胞体缩小,与周围细胞失去联系,细胞器变致密,核体积缩小,核仁消失,染色质浓集于核膜内表面下,形成新月形致密小斑块。
2)染色体断裂,核膜与细胞膜均内陷,包裹胞内成分(胞浆、细胞器、碎裂的染色质及核膜)形成“泡”样结构,此为“凋亡小体”。
最后,整个细胞均裂解成这种“小体”。
3)凋亡小体被邻近的巨噬细胞、上皮细胞等识别、吞噬、消化。
上述三个阶段维持时间很短,通常在几分钟、十几分钟内即可完成。
2.细胞凋亡的生化改变:1)胞内Ca2+浓度增高所有细胞凋亡过程中均出现胞内Ca2+浓度增高,这可能是Ca2+内流所致。
2)内源性核酸内切酶激活细胞发生凋亡时,由于内源性核酸内切酶被激活,DNA被从核小体连接处水解,形成180—200bp 或其整倍数的片段。
淋巴细胞转化实验报告
淋巴细胞转化实验报告本实验旨在探究淋巴细胞的转化过程及其影响因素。
实验过程中,将淋巴细胞与一种称为“共同诱导剂”的物质一起培养,观察其细胞增殖情况,并对其进行形态、生物学指标等方面的分析。
实验设备:1.淋巴细胞分离液2.共同诱导剂3.2.5%DMSO4.96孔板5.无菌蒸馏水6.比色计7.显微镜实验步骤:1.将新鲜小鼠脾脏切割成碎片,加入10ml的淋巴细胞分离液中,用离心机将其离心5min,取上清液为淋巴细胞。
2.将淋巴细胞洗涤三次,倒掉上清并加入10ml新的淋巴细胞分离液进行离心。
重复该步骤3次,以去除悬浮在淋巴细胞上的血红细胞和血小板。
3.将10μl细胞悬液加入90μl试验液(不含共同诱导剂),分别加入5% DMSO,共同诱导剂和一个对照组,分别孵育24h,48h和72h。
4.将80μl的淋巴细胞悬液加入新的96孔板中。
根据实验要求进行加药与相应的控制。
5.将淋巴细胞36h悬液转移到新的96孔板中,各包含80μl,进行形态学观察。
6.将淋巴细胞72h转移,在比色计中检测细胞增殖情况,计算得到相应的增殖指数(SI)。
实验结果:1.形态观察通过显微镜观察淋巴细胞的形态学变化。
对照组:淋巴细胞间距等距,无细胞破裂或缺损。
5% DMSO:淋巴细胞受到较严重的损伤,细胞全部变形。
共同诱导剂:淋巴细胞形态多样性,出现组织块状聚集现象。
2.细胞增殖情况70h后,比色计检测增殖情况。
对照组:SI为15% DMSO:SI为0.4共同诱导剂(分析不同剂量):(a) 0.01ug/ml:SI为1.8(b) 0.1ug/ml:SI为2.7(c) 1.0ug/ml:SI为2.1实验分析:淋巴细胞转化是一种细胞增殖的过程,在此过程中细胞数量增加。
转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。
体外诱导转化中,加入化合物或病毒等诱导剂,以刺激细胞增殖。
本实验中,采用的淋巴细胞采用体外诱导转化的形式。
实验结果表明,共同诱导剂对淋巴细胞转化具有明显的促进作用,而DMSO对淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在维持机体内稳态和发育过程中起着关键作用。
因此,对细胞凋亡的检测方法研究具有重要意义。
在本文中,我们将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法,以及它们的优缺点和适用范围。
1. 形态学观察法。
形态学观察法是最早用于检测细胞凋亡的方法之一。
通过光学显微镜观察细胞形态的变化,如细胞体积缩小、胞质浓缩、核染色质凝聚和核小体形成等,来判断细胞是否发生凋亡。
这种方法简单直观,但不适用于高通量检测和定量分析。
2. DNA断裂检测法。
DNA断裂是细胞凋亡的一个显著特征,因此可以通过检测DNA 的断裂来判断细胞是否发生凋亡。
常用的DNA断裂检测方法包括凝胶电泳、TUNEL法和DNA断裂酶切法。
这些方法可以对凋亡细胞进行定量分析,但需要特殊仪器和试剂,操作较为复杂。
3. 蛋白质检测法。
细胞凋亡过程中,一些特定的蛋白质会发生变化,如Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白等。
因此,可以通过检测这些蛋白质的表达水平或活性来判断细胞是否发生凋亡。
常用的蛋白质检测方法包括Western blot、免疫荧光染色和流式细胞术。
这些方法对于定量分析和高通量检测具有优势,但需要特异性抗体和专门仪器。
4. 细胞色素C释放检测法。
在细胞凋亡过程中,线粒体膜通透性增加,导致线粒体内膜空间的细胞色素C释放到细胞质中。
因此,可以通过检测细胞色素C的释放来判断细胞是否发生凋亡。
常用的方法包括免疫荧光染色和细胞色素C活性检测。
这些方法对于研究凋亡的机制和药物筛选具有重要意义。
综上所述,不同的细胞凋亡检测方法各有优缺点,研究者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。
随着生物技术的发展,新的细胞凋亡检测方法也在不断涌现,相信在不久的将来,会有更多更简便、灵敏的方法问世,为细胞凋亡研究提供更多的选择和可能性。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法:常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法:各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法:琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法:原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织:主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测:细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法:1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测:1典型的生化特征:DNA 片段化2检测方法主要有:琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法:1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测:正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应:细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测:1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据:1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响;3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例;4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料:PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标:PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标:磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察:1用苏木素-伊红HE染色:细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察:1细胞体积变小,全面皱缩;2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料:丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项:细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180~200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理:脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1%,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS:磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,:蛋白酶K 0.02g;PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液:H2O2 ;PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配:Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml;再加入二甲砷酸钠29.96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液:TdT酶32μl;TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液:氯化钠17. 4g;柠檬酸钠8.82g;ddH2O 1000ml7、%二氨基联苯DAB溶液:DAB 5mg;PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、%甲基绿:甲基绿0.5g;0.1M乙酸钠100ml;9、100%丁醇,100%、95%、90%、80%和70%乙醇,二甲苯,10%中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理:1石蜡包埋的组织切片预处理:将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95%和75%乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug/ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理:将冰冻组织切片置10%中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇:乙酸2:1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理:将约5 × 107个/ml细胞于4%中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50~100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2%过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1~5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意:阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的%DAB溶液,室温显色3~6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100%正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理:吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光>580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液:AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液:Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液:将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液;所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液:称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液:20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液:甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果:在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理:在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分:500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法:1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片:最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织:有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体:取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC:取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液:二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液;标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP;链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟;23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟;3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟;5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟;6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟;7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法:凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下:每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级;3-6个为Ⅱ级;6-10个为Ⅲ级;>10个者为IV级;阳性对照:经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照:切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞:凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制:100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚:氯仿:异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿:异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液:100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。
细胞生物学实验智慧树知到课后章节答案2023年下宁波大学
细胞生物学实验智慧树知到课后章节答案2023年下宁波大学宁波大学第一章测试1.在单克隆抗体制备过程中,需要使用下列哪项技术?()A:显微操作技术 B:细胞转染 C:细胞核移植 D:细胞融合答案:细胞融合2.团队协作精神体现在下列哪些课堂活动中。
()A:实验视频制作和校对 B:预习实验流程,并进行分工 C:实验结果评估 D:实验期间卫生打扫答案:实验视频制作和校对;预习实验流程,并进行分工;实验结果评估;实验期间卫生打扫3.预习需要完成的任务包括()。
A:观看网上视频 B:小组内讨论实验流程及分工 C:准备实验流程图 D:完成预习习题答案:观看网上视频;小组内讨论实验流程及分工;准备实验流程图;完成预习习题4.下面不属于本课程开设的实验是()。
A:动物细胞培养 B:叶绿体的分离与观察 C:细胞凋亡诱导 D:细胞转染 E:细胞骨架观察 F:细胞融合答案:细胞转染5.期末考核不包括下面哪一项内容。
()A:随堂作业 B:实验报告 C:理论考试 D:操作考试答案:随堂作业第二章测试1.细胞是()过程精巧的结合的综合体。
A:物质(结构) B:遗传 C:能量与信息 D:代谢答案:物质(结构);能量与信息2.细胞()的测量是研究正常的或病理组织细胞的基本方法之一。
A:长度 B:体积 C:周长 D:面积答案:长度;体积;面积3.细胞实际长度按照哪个公示计算。
()A:目镜测微尺的每小格的刻度=(镜台测微尺的格数×10 μm)÷目镜测微尺的格数 B:目镜测微尺的每小格的刻度=(镜台测微尺的格数×10 μm)×目镜测微尺的格数 C:目镜测微尺的每小格的刻度=(10 μm÷镜台测微尺的格数)÷目镜测微尺的格数答案:目镜测微尺的每小格的刻度=(镜台测微尺的格数×10 μm)÷目镜测微尺的格数4.如果是在10×目镜下测定目镜测微尺每小格的实际长度,那么在接下来目标细胞大小可换其他倍镜进行观察。
细胞凋亡的检测原理
细胞凋亡的检测原理
细胞凋亡的检测原理主要包括:
1. 形态学观察:细胞凋亡时,通常会出现一系列形态学的变化,如细胞核染色质凝聚、胞质收缩、细胞核碎裂等。
通过显微镜观察细胞形态的变化,可以初步判断细胞是否经历了凋亡过程。
2. 细胞凋亡标记物检测:细胞凋亡过程中,常常会出现一些特定的生物标记物的改变,如细胞膜外翻的磷脂,如磷脂血小板活化因子(phosphatidylserine,PS);细胞核内特异性酶活性
的改变,如DNA酶(DNAse)的活化;细胞质内特定蛋白的
表达和位置改变等。
利用这些特定标记物的改变,可以通过免疫荧光染色、荧光探针标记等方法来检测凋亡细胞的存在和数量。
3. DNA断裂检测:细胞凋亡时,DNA会发生断裂并形成大小
不等的DNA片段。
传统的DNA断裂检测方法包括DNA凝胶
电泳和TUNEL反应。
其中,DNA凝胶电泳是通过电泳将
DNA片段按照大小分离,从而检测细胞凋亡的存在和程度;TUNEL反应则是利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记
的核苷酸与DNA断裂端连接,通过荧光或酶标反应来检测凋
亡细胞。
4. 细胞凋亡相关蛋白的检测:细胞凋亡过程中,会有一系列蛋白质的变化。
常用的检测方法包括Western blot和流式细胞术。
通过检测细胞凋亡相关蛋白如caspase家族蛋白(caspase-3、caspase-8等)的表达或活性变化,可以间接判断细胞是否发
生凋亡。
综上所述,通过观察细胞的形态变化、检测细胞凋亡标记物的
改变、DNA断裂以及细胞凋亡相关蛋白的表达和活性变化等多种方法,可以对细胞凋亡进行检测和判断。
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测实验14 细胞凋亡的诱导和检测20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式:凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)。
细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡,坏死过程细胞膜通透性增高,细胞肿胀,核碎裂,继而溶酶体、细胞膜破坏,细胞内容物溢出,细胞坏死常引起炎症反应。
细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语,意思是花瓣或树叶凋落,意味着生命走到了尽头,细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。
凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。
凋亡时细胞皱缩,表面微绒毛消失,染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘,继而核裂解,由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面,最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。
凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整,不引起炎症反应。
细胞凋亡时的生化变化特征是核酸内切酶被激活,染色体DNA被降解,断裂为50~300 kb长的DNA片段,再进一步断裂成180~200bp整倍数的寡核苷酸片断,在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。
细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。
1.细胞凋亡的检测方法凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征,据此可以鉴别细胞的死亡形式。
细胞凋亡的机制十分复杂,一般采用多种方法综合加以判断,同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同,方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的(表?)。
表凋亡的检测方法(引自DL 斯佩克特等,2001)方法细胞类型特点说明形态学/细胞旋转不限简单、快速、低廉、贮存无限制略带主观性,但可靠Hoechst染色不限极快,不能贮存略带主观性,但可靠吖啶橙/溴化乙锭不限极快,不能贮存凋亡初期可用,略带主观性,但可靠FACS/FSC X SSC 非贴壁细胞简单,须及时进行客观,仅能提示凋亡FACS/PI吸收非贴壁细胞简单,需及时进行客观,不能辨别凋亡于坏死;早期凋亡的细胞呈阴性膜联蛋白V(锚定蛋白) 最好非贴壁细胞快速简单;细胞可以被固定并非所有细胞在膜整合损失前受PS影响;测定已知的显著性的反应DNA片段(琼脂糖电泳)不限很快、低廉定性,不能确定凋亡;某些细胞不适用DNA片段(PI染色) 不限很快,低廉定量;用于估计凋亡程度DNA片段(JAM 分析) 循环细胞低廉,可分析多种类混合定量,不能确定凋亡含量;不能用于所有细胞TUNEL 不限昂贵,耗时定量,常被认为可靠(尽管应该结合形态学评价)线粒体膜电位损不限低廉,不能确定凋失快速亡,并非次生坏死前的所有细胞都适用caspase活化(蛋白酶活性) 不限中等花费,很快目前不能确定凋亡,但适用于监测器;不能鉴别特定激活的caspasescaspase活化(caspase免疫印迹) 不限中等花费可以鉴别特定激活的caspases;依赖于抗体的有效性caspase活化(基质免疫印迹) 不限中等花费通过特异切割反应测定caspase活化;如这些反应功能可确定形态学观察方法:利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征:(1)DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。
细胞凋亡的诱导与检测
•
• 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜
• 一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用 的DNA特异性染料有:HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
• 电子显微镜观察
(扫描电镜) 正常细胞
(扫描电镜)
(透射电镜)
凋亡细胞—凋亡小体 凋亡细胞 凋亡小体
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细胞凋亡诱导及检测
1.概述 2.细胞凋亡的过程与机制 3.凋亡与坏死的区别 4.细胞凋亡生物学意义 5.细胞凋亡的诱导及检测
细胞凋亡
细胞凋亡是指细胞在一定的生理或 病理条件下,受内在遗传机制的控 制自动结束生命的过程。
• 概述
悉尼· 悉尼·布雷诺尔
罗伯特· 罗伯特·霍维茨
约翰· 约翰·苏尔斯顿
增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞
■参与防御反应
细胞毒T 细胞毒T细胞
凋亡过多或不足→→疾病: 肿瘤、艾滋病、神经变性性疾病、缺血性损伤
细 胞 凋 亡
1、细胞凋亡的形态学检测 、
• 光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞:凋亡细胞V变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象, 晚期可见凋亡小体。 • 染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的 染色质浓缩、边缘化,呈新月状附在核膜周围。
七.注意事项:
1.由于荧光会发生淬灭,加入DAPI染色后要尽 量避光 操作,在显微镜下操作时,先用可见光 找到细胞再转换到紫外光,因为紫外光对荧光的 淬灭效果比可见 光强很多。 2.实验要求阴性对照,不然说明不了问题。 3.每一个步骤都要PBS溶液洗掉上一步的试剂, 避免 影响下一步。 4.EB为强染色剂,使用实应高度注意。 5.在显微镜下观察时候要操作迅速因为细胞会 变干而发生改变。
细胞凋亡的形态学变化
细胞凋亡的形态学变化细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在生物体发育、免疫调节和疾病发展等过程中起着至关重要的作用。
细胞凋亡的形态学变化是其最早被观察到的特征之一,本文将详细探讨细胞凋亡的形态学变化及其在生物学中的意义。
细胞凋亡的形态学变化主要包括细胞体积缩小、核染色质凝聚和核内核外囊泡形成。
首先,细胞凋亡发生时,细胞体积会明显缩小,称为细胞收缩。
这是由于细胞内的细胞骨架和细胞质骨架发生重组导致的,细胞内的细胞器也会被重新排列。
细胞收缩是细胞凋亡的早期特征之一,它与细胞内的凋亡信号通路的激活有关。
其次,细胞凋亡的形态学变化还包括核染色质的凝聚。
正常情况下,细胞核内的染色质是均匀分布的,但在细胞凋亡过程中,染色质会变得更加浓缩和凝聚。
这是由于细胞凋亡信号通路的激活导致核内的DNA断裂和染色质的重排。
核染色质凝聚是细胞凋亡的一个重要标志,它可以通过核染色质染料如伊红染液或DAPI进行观察和检测。
最后,细胞凋亡的形态学变化还包括核内核外囊泡的形成。
在细胞凋亡过程中,细胞核内和核外会形成许多囊泡,称为凋亡小体。
这些凋亡小体由磷脂和蛋白质组成,它们可以通过电子显微镜观察到。
凋亡小体的形成是细胞凋亡的一个重要步骤,它们可以通过胞吞作用被周围的细胞或巨噬细胞摄取和清除。
细胞凋亡的形态学变化在生物学中具有重要的意义。
首先,它可以通过形态学的观察和分析来鉴定细胞是否发生凋亡。
细胞凋亡的形态学变化是细胞凋亡的早期特征,可以通过显微镜观察到。
其次,细胞凋亡的形态学变化还可以用于研究细胞凋亡的调控机制和信号通路。
通过观察细胞凋亡的形态学变化,可以了解细胞凋亡的发生和进程。
最后,细胞凋亡的形态学变化在疾病的诊断和治疗中也具有重要的价值。
许多疾病如肿瘤和神经退行性疾病都与细胞凋亡的异常有关,通过观察细胞凋亡的形态学变化可以对这些疾病进行诊断和治疗。
综上所述,细胞凋亡的形态学变化是细胞凋亡的重要特征之一,它包括细胞体积缩小、核染色质凝聚和核内核外囊泡形成。
细胞凋亡的形态学特点
细胞凋亡的形态学特点
细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式,它在生物体的正常发育、组织修复和免疫调节中起着至关重要的作用。
细胞凋亡的形态学特点是其特殊的细胞形态和结构变化,这些变化可以通过显微镜观察到。
本文将详细解释细胞凋亡的形态学特点,并符合标题中心扩展下的描述。
1. 细胞体积缩小:在细胞凋亡过程中,细胞体积会明显缩小。
这是由于细胞内部的细胞器和细胞质逐渐收缩,导致整个细胞体积减小。
与正常细胞相比,凋亡细胞的体积通常缩小约20%至30%。
2. 核染色质凝聚:在细胞凋亡过程中,细胞核内的染色质会发生明显的变化。
正常情况下,细胞核内的染色质呈现均匀分散的状态,而在凋亡过程中,染色质会逐渐凝聚成片状或颗粒状,形成明显的核染色质凝聚。
3. 核膜破裂:细胞凋亡时,核膜会发生破裂。
正常情况下,细胞核内的染色质被核膜包裹着,而在凋亡过程中,核膜会发生断裂,导致染色质暴露在细胞质中。
4. 凋亡小体形成:在细胞凋亡过程中,细胞质内会形成一些小的囊泡状结构,称为凋亡小体。
这些凋亡小体由细胞内的细胞器和细胞质组成,通常具有高度电子致密性,可以通过电子显微镜观察到。
5. 细胞膜破裂:在细胞凋亡的晚期,细胞膜会发生破裂,导致细胞内容物泄漏到周围环境中。
这一过程被称为细胞溶解,是细胞凋亡的最终阶段。
细胞凋亡的形态学特点包括细胞体积缩小、核染色质凝聚、核膜破裂、凋亡小体形成和细胞膜破裂。
这些特点在细胞凋亡的不同阶段中表现出来,通过观察这些形态学变化,可以对细胞凋亡进行初步的鉴定和研究。
细胞凋亡的形态学特点对于理解细胞生物学、疾病发生机制以及药物研发具有重要意义。
实验十二凋亡细胞的诱导与光镜下形态观察
4
对照组 细胞膜完整,细胞核呈球形,染色均匀,细胞质均匀透明,从 细胞核大都倚靠边缘可推断液泡依然完整
5
凋亡细胞 细胞核有裂解现象,中间出现空泡,有的呈半月形。出现轻度质壁分离,并
且细胞核大都不再处于边缘,这说明液泡可亡细胞的形态变化 了解一些诱导细胞凋亡的实验方法
1
实验原理
细胞凋亡(apoptosis)是细胞受到内、 外因子刺激后发 生的由基因调控的生理性死亡行为 ,是一个主动和高度有序 的过程。
细胞凋亡对生物体的生长发育有着重要的作用。近年来 ,它 已成为生命科学的热点研究领域 ,并取得许多突破性进展。
2
方法与步骤
本实验以洋葱鳞茎内表皮细胞为材料 ,以不同 的试剂(比如不同浓度 Ca2 +和 Na+)作为凋 亡诱导剂 ,通过光学显微镜观察洋葱鳞茎内表 皮细胞是否发生了凋亡。
要求:
1.查找资料,设计方案。(采用的药品与浓度) 2.实验 3.观察,统计。 4.论文写作。
3
凋亡的现象:类似动物细胞凋亡的形态学特征 ,即细胞膜皱 缩 ,细胞核固缩 ,核染色质聚集 ,形成凋亡小体等
掌握各个阶段淋巴细胞的形态特点及镜下识别
多,对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
免疫缺陷病
03
某些免疫缺陷病患者,外周血中成熟淋巴细胞数量可减少,对
于疾病的诊断和鉴别诊断具有一定帮助。
05 活化淋巴细胞与记忆淋巴 细胞
活化淋巴细胞形态特征及功能
形态特征
活化淋巴细胞体积增大,细胞核增大、分裂活跃,细胞质内 RNA和蛋白质合成增加,可见细胞质扩张和线粒体增多等现 象。
相关疾病与诊断意义
相关疾病
幼稚淋巴细胞增多可见于急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病等疾病。
诊断意义
幼稚淋巴细胞是白血病细胞的重要组成部分,其形态学特征是白血病诊断和分 型的重要依据之一。同时,幼稚淋巴细胞计数也是判断白血病治疗效果和预后 的重要指标之一。
04 成熟淋巴细胞阶段
成熟淋巴细胞形态特征
细胞大小
细胞质
成熟淋巴细胞大小较均一,直径一般 在6-9μm之间。
细胞质较少,呈淡蓝色,无颗粒或仅 有少量嗜天青颗粒。
细胞核
成熟淋巴细胞的细胞核呈圆形或卵圆 形,染色质呈粗块状,核膜清晰,核 仁消失。
镜下识别方法及技巧
染色方法
常用瑞氏-吉姆萨染色法进行染色, 使得细胞核和细胞质呈现不同的 颜色,便于观察。
功能
活化淋巴细胞具有高度的增殖能力和分化能力,可迅速分裂 并分化为效应细胞和记忆细胞,参与机体的免疫应答。
记忆淋巴细胞形态特征及功能
形态特征
记忆淋巴细胞体积较小,细胞核较大 而细胞质较少,表面标记和细胞内分 子特征与普通淋巴细胞有所不同。
功能
记忆淋巴细胞具有长期存活的能力, 当机体再次接触相同抗原时,可迅速 增殖并分化为大量效应细胞,产生更 快、更强的免疫应答。
观察要点
细胞生物学实验-细胞凋亡观察
色加深,或核染色质聚集于核膜一边,呈新月状;晚期凋亡细胞胞核碎裂成大小 不等的原形小体,并被细胞膜所包绕,即凋亡小体。 ⑤ AO(吖啶橙)和EB(溴化乙锭)双染色:AO可以透过细胞膜完整的细胞而嵌入 核DNA呈绿色,EB只能透过细胞膜破损的细胞而嵌入核DNA呈红色。显微镜下 观察,活细胞为荧光深浅不一的结构样特征,核染色质为绿色;凋亡细胞染色强, 亮度高,核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体 或均匀一致的圆状或固缩团状结构。 ⑥ 透射电镜观察:凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形, 核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”,同时可以观察到凋亡 小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬。
细胞凋亡检测
保留的细胞
不健康的细胞
细胞开 始收缩
细胞崩 溃分解 成碎片
不健康的细胞已被除去, 组织内附近的细胞进行 有丝分裂,合上缺口
细胞凋亡检测
细胞凋亡的诱导试剂:
名称 Actinomycin D
Aphidocolin A23187 Caffeine
Camptothecin Cycloheximide Dexamethasone
溶剂 甲醇 二甲亚砜 二甲亚砜 沸水 二甲亚砜
水 乙醇
水
二甲亚砜, 热水 水
二甲亚砜 二甲亚砜 磷酸盐缓冲液
甲醇
细胞凋亡检测
细胞凋亡的检测方法:
实验十三、放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察
• 最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细 胞吞噬。 胞吞噬。
凋亡小体
• 生化特征: 生化特征: 内源性核酸内切酶基 因的活化和表达, 因的活化和表达,导致 凋亡细胞的染色质 DNA的有控裂解,得 的有控裂解, 的有控裂解 到的DNA片段的长度 到的 片段的长度 的倍数。 为200bp的倍数。 的倍数
• 4.制片(空气干燥法) 制片(空气干燥法) 制片
取一滴细胞悬液,滴于倾斜放置 一滴细胞悬液, 细胞悬液 的洁净盖玻片上,让细胞均匀分散, 的洁净盖玻片上,让细胞均匀分散, 自然干燥。
cover slip
5.染色: 染色: 染色 滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上, 滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上, 铺开染液,置标本于培养皿中, 铺开染液,置标本于培养皿中,室温下 黑暗环境中染色10min,自来水小心冲洗 黑暗环境中染色 ,自来水小心冲洗, 自然晾干(避光)。 自然晾干(避光)。 6.封片及观察: 封片及观察: 封片及观察 在载玻片( 在载玻片(slide)上滴一滴 )上滴一滴10%的甘 的甘 油,用镊子小心将贴有细胞的盖玻片盖 在液滴上,细胞面向下,不要产生气泡, 在液滴上,细胞面向下,不要产生气泡, 及时于荧光显微镜下观察 于荧光显微镜下观察。 及时于荧光显微镜下观察。
2.程序性死亡 程序性死亡(programmed 程序性死亡 cell death, PCD)
定义:
又称细胞凋亡( ),细胞在 又称细胞凋亡(apoptosis),细胞在 ), 一定的生理或者病理条件下按照自身的 程序结束其生存, 程序结束其生存,是细胞接受指令后进 行的主动性死亡, 行的主动性死亡,涉及一系列基因的激 表达和调控。 活、表达和调控。
一、细胞死亡(cell death) 细胞死亡( )
细胞凋亡(apoptosis)的形态学观察
细胞凋亡(apoptosis)的形态学观察细胞凋亡(apoptosis)的命名主要是根据某些单个细胞死亡时细胞碎裂如花瓣或树叶散落般的形态学特征。
目前对细胞凋亡的认识正不断得到深化,检测凋亡细胞的方法也逐渐增多,但形态改变仍是确定细胞凋亡的最可靠的方法。
一、光学显微镜观察凋亡细胞的主要特征为核染色质致密深染,形成致密质块,有时可碎裂。
在HE染色的组织切片中细胞体积缩小,胞质致密、嗜酸性染色增强,并可形成凋亡小体。
在组织中凋亡细胞常以分散单个形式存在,凋亡细胞与周围细胞分离,不引起炎症反应。
本方法简便易行,但在细胞密集的组织中对于改变不典型的细胞判断较困难,常缺乏较为特征的指标,具有较强的主观性,重复性差。
本方法可用于调亡现象的初步观察,作为分析指标之一。
检测方法:细胞涂片或组织石蜡切片作HE染色或Giemsa染色,在高倍物镜下观察凋亡细胞的形态改变,结合显微测量工具可作凋亡细胞计数。
二、视频时差显微技术(video time-lapse microscopy)本方法用于细胞培养,通过相差显微镜可动态观察细胞凋亡的变化过程,尤其是观察细胞表和外形的变化。
凋胞与基质分离,胞体变圆、收缩、出泡,有的细胞拉长,出现钉状突起,特续数小时后细胞膜破裂,细胞溶解,通过连续观察,本方法可养壑培养中的凋亡细胞,但不能用于病理组织。
检测方法:收集2×105细胞/ml培胞,置于多孔培养板,加入凋亡诱导剂,在带有自动摄像装置的相差显微镜下观察凋亡细胞的动态改变,每隔分钟 30秒作序列摄影,连续24小时。
如同进进行荧光染色,可参荧光晃微镜下观察和摄影。
三、电子显微镜观察关于凋亡细胞的超微结构特征,包括透射电镜和扫描电镜下的改变,在许我文献中已有详尽描述。
凋亡细胞的典型形态改变如胞质的固缩,染色质浓缩成半月形或帽状附于核膜,核的碎裂和凋亡小体形成等,在透射电镜下得到最佳的体现。
为凋亡细胞判定提供了最可靠的依据。
本方法的缺点是样品制作过程较复杂,且仪器、设备的费用昂贵,较难广泛大量开展。
诱导细胞凋亡的信号转导
三. 凋亡酶学分析
• 1. 内切核酸酶(endonuclease, DNase)
• 种类:DNase Ⅰ (内质网、高尔基体), DNase Ⅱ(溶酶体、胞核),NUC18(胞核,胸 腺细胞中) 等
• 作用:使DNA断裂成180-200bp或其倍数的 片断
析与分选的一门技术。
1, A1/Bfl-1等 • 均含有BH(Bcl-2 homology)结构域,
通过此结构域以二聚体形式调控凋亡。
• 2. 其他相关蛋白 • p53, Myc, Fas等
流式细胞分析
FLOW CYTOMETRY
流式细胞术的概念
•
流式细胞术(flow cytometry)是对单
个细胞或其他微粒进行快速定性、定量分
• 激活机制:CAD(caspase-activate DNase)
•
ICAD(inhibtor of CAD)
• 检测:Western Blotting
• 2. Caspases家族
• Caspase是半胱氨酸基天冬氨酸-特 异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)的缩写,共有13个 家族成员。可将人体内的caspases分为 三个亚家族:①ICE亚家族,caspase1,4,5, 主要参与炎症反应;②Yama亚家 族,caspase-3, 6, 7, 8,10, 主要参与细 胞凋亡;③Nedd-2亚家族,caspase2,9,参与细胞凋亡。
诱导细胞凋亡的信号转导
死亡受体介导的细胞凋亡
凋亡与疾病
一、凋亡与恶性肿瘤 肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关,
还与凋亡障碍有关。
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细胞生物学实验报告
淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察lymphocyte isolation and morphological observation of
apoptosis induction
2012年6月2日
淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察
lymphocyte isolation and morphological observation of
apoptosis induction
摘要:目的了解细胞凋亡的原理,掌握离体诱导细胞凋亡的方法,及用普通光学显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化,并从观察结果初步推断和识别凋亡细胞具体阶段。
方法实验所用Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡、Giemsa染色。
结果实验结束后得到了染色的结果以及照片。
结论所提取的淋巴细胞发生凋亡。
Abstract:Objective Understand the principles of cell apoptosis, master the methods of cell apoptosis induced by in vitro, and by ordinary optical microscopy and fluorescence microscopy observation of morphological changes of apoptotic cells and preliminary inferred from observations and identifying apoptotic cells specific stages. Method Experimental method used in,Hoechst 33342/PI double dye test and the Giemsa stain. Results Be dyed after the end of the experiment results and photos. Conclusions The extraction of lymphocyte apoptosis.
关键词:细胞凋亡、Giemsa染色、Hoechst 33342/PI双染。
Keyword:cell apoptosis、Giemsa stain、Hoechst 33342/PI double staining
1.实验原理
1.1 关于淋巴细胞的分离
外周血中淋巴细胞比重约为1.070,而红细胞和粒细胞的比重较大,为1.902左右。
因此,利用相对密度为1.077±0.002的淋巴细胞分离液(称为分层液)离心,可使一定比重的细胞按相应密度梯度分布(使比重中较大的红细胞和粒细胞沉于管底,淋巴细胞浮于分层液与血浆的界面上),从而将淋巴细胞分离出来。
1.2 关于细胞凋亡
细胞凋亡又称编程性死亡或程序性死亡。
细胞凋亡是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的受基因调控的主动的死亡方式。
细胞凋亡对于多细胞生物个体的正常发育、保持自稳平衡、抵御外界各种因素的干扰及多种病理过程具有极其重要的意义,起着非常重要的作用。
细胞凋亡是多种生理、病理因子参与的由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程,其中由氧应激造成大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生以及继发性细胞损伤过程在细胞凋亡中起着重要作用,如电离辐射或紫外线照射产生大量H2O2、OH-等。
细胞凋亡的诱导因子包括三大类:
1.物理因子:包括射线、较温和的温度刺激(如热激或冷激)等;
2.化学因子:包括活性氧基团和分子、重金属离子等;
3.生物因子:肿瘤坏死因子、生物毒素、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成的抑制剂等。
细胞凋亡的主要特征包括:
1.染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。
2.DNA特异性降解成200bp或其整数倍片断,通过凝胶电泳形成梯状条带,称为DNA Ladder。
3.由于DNA特异性降解而产生大量3’-OH末端,可被末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP 缺口末端原位标记法(TUNEL)标记,从而产生亮绿色荧光等。
2.材料与方法
2.1 材料
兔子
2.2 试剂
荧光显微镜、离心机、家兔外周血淋巴细胞分离液、磷酸盐缓冲液(PBS)pH=7.0、0.04 mol K2Cr2O7(用pH7.0磷酸盐缓冲液PBS配制)、D-Hank’s溶液、RPMI1640培养液、Giemsa染色液、台盼蓝染色液、细胞凋亡荧光Hoechst 33342/PI双染试剂。
2.3 仪器
荧光显微镜、离心机、血球计数板、无菌注射器、吸管、离心管(5ml、10ml)、EP管、弯头镊子、载玻片和盖玻片、移液器等。
3.实验方法
3.1 淋巴细胞的分离(本实验严格按照无菌操作方法操作)
(1)取兔子新鲜抗凝血2ml,加入5ml离心管中,再加入等量的Hank’s溶液,混匀。
(2)取一支10ml离心管加入4ml淋巴细胞分离液,将稀释血用吸管沿离心管壁慢慢加入铺在分层液表面,使血液与淋巴细胞分离液形成清晰的界面,盖紧离心管胶盖。
(3)将离心管放入离心机,水平2000r/min离心20min,小心取出离心管,可见血液成分分层。
第一层:为血浆层;第二层:为环状乳白色淋巴细胞;第三层:为透明分离液层;第四层:为红细胞层。
(4)用平口吸管小心吸取第二层白色雾状淋巴细胞层,移入另一离心管中。
(5)加入Hank’s溶液7~8ml,用吸管吸匀,水平离心2000r/min,20min,弃上清,再重复洗细胞一次,弃上清。
(6)加入RPMI1640培养液2ml混匀,计数,并用台盼蓝检测细胞活力,最后用培养液配成所需浓度备用。
分装1.5ml EP管。
3.2 细胞凋亡的诱导
(1)分别用10-4 ,10-5,10-6浓度的K2Cr2O7溶液诱导淋巴细胞24小时,空白对照组只加等量的PBS,其他步骤与实验组相同。
(2)2000r/min,离心20min收集淋巴细胞,用PBS洗涤收集的细胞一次。
将淋巴细胞用PBS调整浓度为1×106个/mL。
收集细胞,进行凋亡观察和测定。
3.3 染色与形态学观察(实验组与对照组分开操作)
(1)Giemsa染色
①将细胞用PBS调整浓度为1×106个/mL,取一滴细胞悬液于载玻片上,涂片室温晾干。
(确切细胞计数个数)
②甲醇固定3~5min。
③用Giemsa工作液染10~15min,流水洗片刻,干燥,封片,镜检。
(2)Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡
①悬浮生长的细胞离心收集,固定培养的细胞消化后收集,将105~106个细胞悬浮于1mL培养基中,再加入10 μL Heochst 33342染液,混匀,37℃孵育5~15min;
②细胞于4℃,500~1000r/min离心5min弃去上清液;
③加入1.0mL Buffer A工作液(用双蒸水将10×Buffer A 稀释10倍)悬浮细胞,加入5μL PI 染液,室温避光放置5~15min混匀;
④荧光显微镜观察:Heochst 33342用氪激光激发的紫外光,激发波长为352nm,发射波长为400~500nm,产生兰色荧光;PI用氩离子激光激发荧光,激发波长为488nm,发射波长大于630nm,产生红色荧光。
(另一个参考资料:荧光显微镜下观察:激发光为紫外光)。
4.实验结果及分析
4.1 实验结果
4.1.1 台盼蓝染色的结果
图一凋亡细胞的台盼蓝染色结果图二活细胞的台盼蓝染色结果4.1.2 Giemsa染色的结果
图三凋亡细胞的Giemsa染色结果
4.1.3 经荧光Hoechst 33342/PI双染的结果
图四10-4 浓度K2Cr2O7诱导染色图五10-5 浓度K2Cr2O7诱导染色
图六10-6 浓度K2Cr2O7诱导染色图七空白对照组的诱导染色
4.2 实验结论
通过观察结果发现经K2Cr2O7诱导后,细胞出现凋亡,并伴随坏死的现象;若K2Cr2O7浓度过大,细胞会出现大量坏死,所以能观察到的凋亡细胞数减少。
4.3 分析与讨论
由于本次所拍得的图像并不理想,经过分析可能原因为:实验培养时间短,不能够定量的得出诱导因素对细胞凋亡情况之间的明确关系,只能定性的分析。
而且,由于培养时间过短,细胞数量过少,分布过于稀散,所以,影响到了最后的实验结果观察;并且进行荧光显微镜观察前,制片存放的时间过长,导致荧光染料挥发散失。
故若要得到更好的实验结果,应该延长细胞培养的时间。