淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察

细胞生物学实验报告

淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察lymphocyte isolation and morphological observation of

apoptosis induction

2012年6月2日

淋巴细胞分离和细胞凋亡诱导及形态学观察

lymphocyte isolation and morphological observation of

apoptosis induction

摘要：目的了解细胞凋亡的原理，掌握离体诱导细胞凋亡的方法，及用普通光学显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学变化，并从观察结果初步推断和识别凋亡细胞具体阶段。方法实验所用Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡、Giemsa染色。结果实验结束后得到了染色的结果以及照片。结论所提取的淋巴细胞发生凋亡。

Abstract：Objective Understand the principles of cell apoptosis, master the methods of cell apoptosis induced by in vitro, and by ordinary optical microscopy and fluorescence microscopy observation of morphological changes of apoptotic cells and preliminary inferred from observations and identifying apoptotic cells specific stages. Method Experimental method used in,Hoechst 33342/PI double dye test and the Giemsa stain. Results Be dyed after the end of the experiment results and photos. Conclusions The extraction of lymphocyte apoptosis.

关键词：细胞凋亡、Giemsa染色、Hoechst 33342/PI双染。

Keyword：cell apoptosis、Giemsa stain、Hoechst 33342/PI double staining

1.实验原理

1.1 关于淋巴细胞的分离

外周血中淋巴细胞比重约为1.070，而红细胞和粒细胞的比重较大，为1.902左右。因此，利用相对密度为1.077±0.002的淋巴细胞分离液（称为分层液）离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度分布（使比重中较大的红细胞和粒细胞沉于管底，淋巴细胞浮于分层液与血浆的界面上），从而将淋巴细胞分离出来。

1.2 关于细胞凋亡

细胞凋亡又称编程性死亡或程序性死亡。细胞凋亡是多细胞生物体在发育过程中或在某些环境因子的作用下发生的受基因调控的主动的死亡方式。细胞凋亡对于多细胞生物个体的正常发育、保持自稳平衡、抵御外界各种因素的干扰及多种病理过程具有极其重要的意义，起着非常重要的作用。细胞凋亡是多种生理、病理因子参与的由凋亡相关基因启动的细胞程序性死亡过程，其中由氧应激造成大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）的产生以及继发性细胞损伤过程在细胞凋亡中起着重要作用，如电离辐射或紫外线照射产生大量H2O2、OH-等。

细胞凋亡的诱导因子包括三大类：

1.物理因子：包括射线、较温和的温度刺激（如热激或冷激）等；

2.化学因子：包括活性氧基团和分子、重金属离子等；

3.生物因子：肿瘤坏死因子、生物毒素、抗肿瘤药物、DNA和蛋白质合成的抑制剂等。

细胞凋亡的主要特征包括：

1.染色质凝集、质膜出芽、核裂解及凋亡小体的形成。

2.DNA特异性降解成200bp或其整数倍片断，通过凝胶电泳形成梯状条带，称为DNA Ladder。

3.由于DNA特异性降解而产生大量3’-OH末端，可被末端脱氧核糖核苷酸移换酶介导的dUTP 缺口末端原位标记法（TUNEL）标记，从而产生亮绿色荧光等。

2.材料与方法

2.1 材料

兔子

2.2 试剂

荧光显微镜、离心机、家兔外周血淋巴细胞分离液、磷酸盐缓冲液（PBS）pH=7.0、0.04 mol K2Cr2O7(用pH7.0磷酸盐缓冲液PBS配制)、D-Hank’s溶液、RPMI1640培养液、Giemsa染色液、台盼蓝染色液、细胞凋亡荧光Hoechst 33342/PI双染试剂。

2.3 仪器

荧光显微镜、离心机、血球计数板、无菌注射器、吸管、离心管（5ml、10ml)、EP管、弯头镊子、载玻片和盖玻片、移液器等。

3.实验方法

3.1 淋巴细胞的分离（本实验严格按照无菌操作方法操作）

（1）取兔子新鲜抗凝血2ml，加入5ml离心管中，再加入等量的Hank’s溶液，混匀。（2）取一支10ml离心管加入4ml淋巴细胞分离液，将稀释血用吸管沿离心管壁慢慢加入铺在分层液表面，使血液与淋巴细胞分离液形成清晰的界面，盖紧离心管胶盖。

（3）将离心管放入离心机，水平2000r/min离心20min，小心取出离心管，可见血液成分分层。第一层：为血浆层；第二层：为环状乳白色淋巴细胞；第三层：为透明分离液层；第四层：为红细胞层。

（4）用平口吸管小心吸取第二层白色雾状淋巴细胞层，移入另一离心管中。

（5）加入Hank’s溶液7~8ml，用吸管吸匀，水平离心2000r/min，20min，弃上清，再重复洗细胞一次，弃上清。

（6）加入RPMI1640培养液2ml混匀，计数，并用台盼蓝检测细胞活力，最后用培养液配成所需浓度备用。分装1.5ml EP管。

3.2 细胞凋亡的诱导

（1）分别用10-4 ，10-5，10-6浓度的K2Cr2O7溶液诱导淋巴细胞24小时，空白对照组只加等量的PBS，其他步骤与实验组相同。

（2）2000r/min，离心20min收集淋巴细胞，用PBS洗涤收集的细胞一次。将淋巴细胞用PBS调整浓度为1×106个/mL。收集细胞，进行凋亡观察和测定。

3.3 染色与形态学观察（实验组与对照组分开操作）

（1）Giemsa染色

①将细胞用PBS调整浓度为1×106个/mL，取一滴细胞悬液于载玻片上，涂片室温晾干。(确切细胞计数个数)

②甲醇固定3~5min。

③用Giemsa工作液染10~15min，流水洗片刻，干燥，封片，镜检。

（2）Hoechst 33342/PI双染检测细胞凋亡

①悬浮生长的细胞离心收集，固定培养的细胞消化后收集，将105~106个细胞悬浮于1mL培养基中，再加入10 μL Heochst 33342染液，混匀，37℃孵育5~15min；

②细胞于4℃，500~1000r/min离心5min弃去上清液；

③加入1.0mL Buffer A工作液（用双蒸水将10×Buffer A 稀释10倍）悬浮细胞，加入5μL PI 染液，室温避光放置5~15min混匀；