石蜡切片组织DNA抽提
磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA 提取详细步骤
磁珠法石蜡包埋组织基因组DNA 提取详细步骤注意事项需要自备材料：二甲苯、无水乙醇、异丙醇、磁铁或磁架、1.5mL离心管(最好低吸附的离心管)；需要去除RNA自备RNase A（100mg/ml），在蛋白酶K消化这一步加入4 μl RNase A；◆整个过程请勿离心，以免磁珠不可逆聚集而影响提取效果。
实验准备磁珠用前一定要充分混匀；◆56℃和80℃加热源；◆使用前需在Buffer FTGWI中加入相应体积的无水乙醇，使乙醇比例占80%。
操作步骤1.脱蜡：①切下5 片厚度约为10μM（重约10mg）的组织块，尽量切去石蜡部分，置于1.5ml的离心管中。
加入1ml二甲苯，并振荡30s，然后室温放置5分钟。
20℃，14000 x g 离心3 min，用移液器移尽上清。
②加入1ml 100%乙醇振荡离心管20s，然后20℃，14000 x g 离心3 min，用移液器移去上清，室温干燥组织沉淀15min。
注意：任何残留的乙醇可能会影响蛋白酶K的消化以及减少核酸的得率2. 消化：加300 μL Buffer FTGL，振荡至彻底悬浮，用匀浆机进行匀浆破碎（使其彻底无大块组织残留），再加入20 μL蛋白酶K(PK)，于56℃温浴15min （期间不时混匀），然后置于80℃ 15min；注意：①组织大于50mg时需要增加蛋白酶K (PK)的用量。
3. 裂解结合：将离心管从80℃加热器上离开，冷却至室温，在上清液中加入600 μl Buffer FTGB和600uL 异丙醇，最后加入磁珠悬浮液(MB) 30 μL（使用前充分重悬），颠倒混匀5分钟；将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
4. 漂洗:(1) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer FTGW0,轻微涡旋振荡5S，使磁珠重悬，将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体，重复该步骤一次。
(2) 将离心管从磁力架上取下，向离心管中加入500 μl Buffer FTGW I,轻微涡旋振荡5S，使磁珠重悬,将离心管放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后吸弃液体。
DNA提取操作规程-石蜡切片Omega试剂盒方法
1 目的依据《EZAN.FFPE DNA KIT D3399-01》使用说明书及实际使用情况制定标准操作规程，确保正确、安全操作。
2 适用范围适用于石蜡切片中DNA提取的规范操作。
3 职责实验操作人员负责本程序的进行，实验室负责人负责该程序的监控。
4 标准操作程序4.1实验前准备4.1.1 55-60°C水浴；70°C水浴。
4.1.2. OB蛋白酶加入1.5ml Protease Storage Buffer溶解后，分装保存于-20℃。
4.1.3. DNA Wash Buffer中加入80ml无水乙醇，并于室温保存。
4.2实验操作4.2.1 刮取切片上组织部分的样品至1.5ml离心管，加入1ml二甲苯，剧烈涡旋10s 混匀。
4.2.2 10,000×g离心2min，小心吸掉上清(不要吸到切片)。
4.2.3 加入1ml 无水乙醇涡旋混匀，10,000×g离心2min，小心吸掉上清(不要吸到切片)。
4.2.4 打开盖子放置15min或直到乙醇挥发。
4.2.5 加入200μL Buffer T1和20μL OB蛋白酶。
4.2.6 55℃水浴3h或至组织消化，每隔20-30min混匀一次。
如果有需要也可消化过夜。
4.2.7 90℃处理60min。
4.2.8 室温静置10-30min，室温10,000×g离心5min去除杂质，小心转移上清至一新1.5ml 离心管中。
4.2.9 加入220ul Buffer BL涡旋混匀。
4.2.10 加入250ul的无水乙醇，高速涡旋15秒混匀。
4.2.11 转移混合液至套有收集管HiBind DNA柱子中，室温下8,000×g离心1 min，弃去滤液。
4.2.12 把柱子装在收集管，加入500ul HB Buffer，室温下8,000×g 离心1min，弃去滤液。
4.2.13 把柱子装在新收集管，加入500ul DNA Wash Buffer，室温8,000×g离心1min。
两种石蜡包埋组织DNA 提取方法的比较
作者简介:张晓萍 (1966-). 女，主管检验师，研究方向为临床免疫检验.
e-mail: liuhui ( o
36
兰州大学学报(医学版)
第 35 卷
平均年龄为 60.8 岁;女性 9 例，平均年龄为 58.0 岁。
检查蜡块组织，剔除有自溶、退变或组织结构不
RNA ，比值低于1. 6 说明含有蛋白质较多 [71 。根据
TES 水浴法提取样品的 D260/ D 280 比值在 1. 6~ 1. 8
之间的样品百分率为 4 1. 2% 。两种结果比较，二甲 苯脱蜡法提取 DNA 的战度和纯度明显优于改良
TES 水浴法，结果见表 1 、 20
表 1 样品吸光度测定值及比值
改良 TES 水浴法
min , 15000 r/min 离心 15 min ，弃上清，重复 2 次。
4 1. 2% in DNA samples extracted by improved TES water-bath , and the strips were obscure.
Conclusion The xylene dewaxing DNA extraction method is simpler , quicker , more effective ,
为 62.5% ，电泳条带清晰可见;改良 TES 水浴法提取样品 D260/ D 280 比值在 1.6~1. 8 之间的为 4 1. 2% ，电
泳条带模糊不清。结论二甲苯脱蜡法提取 DNA 简单快速，需要的组织样品少，是一个值得推荐的石蜡
包埋组织 DNA 的提取方法。 关键词:石蜡包埋组织
中图分类号: R361
{1. Clinical
Lαbomtory，
从石蜡组织中提取DNA
石蜡包埋组织DNA提取方法
一脱蜡：
1、切取石蜡组织5-10片（5um—7um）放入1.5ml的离心管中；
2、加入1ml二甲苯，55°10min，离心轻弃上清，重复两到三次（因组织而定）；
3、加入1ml无水乙醇，室温三分钟，重复二次，离心弃上清，并干燥待酒精挥发。
二消化：
例：设置250ul体系，加入2x裂解液125ul、10%SDS 5ul、蛋白酶k25ul（1mg /ml）、纯水95ul（以上根据裂解液、SDS、蛋白酶K的配置浓度不同和组织量多少而需重新设置），55°消化过夜（按组织的消化情况而定，若没消化完全可适量加入蛋白酶k），直至组织完全液化。
三抽提：
1、加纯水至500ul，加入Tris饱和酚250ul，颠倒混匀，静置5min，再加入250ul 氯仿，颠倒混匀静置5min ，瞬时离心，
2、取出上清液至1.5ml离心管中，加入500ul氯仿，轻混匀，室温静置5min瞬时离心；取上清400ul（吸取液体量可比总体积小，避免吸到蛋白）
四沉淀DNA ：
1、加入3M醋酸钠40ul（醋酸钠的量是吸取上清体积的十分之一），轻混匀，加入880ul无水乙醇（两倍体积）混匀，-20°过夜。
五收集DNA
1、13000rpm 15min，离心轻弃上清
2、加入75% 1ml酒精轻洗，即刻13000rpm 5min 轻弃上清，空气干燥（可用55℃），待干燥为止。
六加入50-100ul纯水溶解，30分-1小时。
石蜡包埋组织的DNA提取
石蜡包埋组织的DNA提取近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。
目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突瘘和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表过和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。
医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。
在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。
通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对开矿学延伸。
通过对DNA或mRNA 分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。
这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节不再赘述。
Goelz(1985)和Dubeau等（1986 ）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻的探针，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。
本节重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。
一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而业。
Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术，是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，进入含SDS和高浓度蛋白酶K（１mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。
所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分了生物学实验。
Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。
首先通过组织切片和二甲苯和脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA 小段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA分子，从而提DNA质量，适于做Sorthern印迹杂交分析。
石蜡切片提取基因组操作标准
规范从石蜡切片提取基因组操作标准目的：规范提取石蜡切片基因组操作设备和材料：试剂：FFPE Tissue Genomic DNA Kit仪器：离心机，水浴锅，核算测试仪，漩涡振荡器样品处理：1、石蜡切片样品：将水浴锅打开并调至90度， 55度各一个。
注意：Hp检测不适应10um厚度样本，需要提供6um厚度样本1.1 有条件的实验室，将样品分装成两份，一份留作备用，另一份将样品编号。
1.2 将5-10片切片组织加入250ul Buffer GA， 90度孵育30min-60min。
（若Buffer GA 出现沉淀，在温水中溶解后再使用。
）此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的时间和温度过长过高都会造成DNA的断裂。
1.3 90度孵育后，12000rpm 离心2Min，小心穿过石蜡层，吸取200ul 包含组织的液体到一新的1.5mlEP管中，加入20ul 蛋白酶k ，颠倒混匀。
（加入蛋白酶的量可依据组织的多少而定，若过夜笑话组织仍未消化完全，需要考虑蛋白酶k 自身问题）1.4 55度水域，过夜消化，以组织基本都消化为准。
DNA提取：将水浴锅打开并调至70度，并将Elution Buffer 70度预热。
1、将消化后的样品12000rpm 离心2min，吸取上清到一新的编好号的EP管中，加入250ul Buffer GB，充分震荡混匀，70度10min。
2、加入250ul 无水乙醇，充分震荡混匀。
3、转移混合液到编好号的DNA吸附柱中（口腔拭子用枪头挤压吸取混合液），放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液。
4、加入500ul Buffer GD，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管。
5、计入500ul Buffer PW，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管。
6、重复步骤5.7、吸附柱套到新的收集管中，12000rpm离心2min。
石蜡标本DNA提取
石蜡标本DNA提取第一天：1.脱蜡①加入二甲苯1.2-1.3ml，震荡混匀，70℃，10min孵育，13000rpm离心2min，弃上清。
②重复①操作2-3次。
2.脱二甲苯：①加酒精即无水乙醇1.2-1.3ml，震荡混匀（剧烈），13000rpm离心1.5min，弃上清。
②重复①操作2-3次。
3.开盖，70℃，静置30min，直至管中无水乙醇挥发完全。
4.加入180ul ATL Buffer，20ul蛋白水解酶混匀，放入56℃水浴锅孵育过夜。
第二天：1.观察组织消化程度，若组织消化不完全，加适量蛋白水解酶（5-10ul），56℃孵育0.5-1.0h。
2.90℃金属浴1h。
3.待温度冷却至室温，加入200ul AL Buffer，轻轻混匀后，迅速加入200ul无水乙醇，上下颠倒混匀。
4.13000rpm离心10-20s，将上清移至吸附柱内，勿吸入白色沉淀。
5.13000rpm离心1min，至离心柱内液体全部离心至收集管中。
6.弃收集管，将吸附柱放于新的收集管中，加入AW1 Buffer 500ul，13000rpm离心1min。
7.弃去收集管中液体，加入AW2 Buffer 500ul，13000rpm离心1min。
8.弃收集管，将吸附柱放于另一个新的收集管中，13000rpm离心3min。
9.弃收集管，将吸附柱放于干净的1.5ml EP管中，开盖，70℃，金属浴放置20-30min，至酒精挥发完全。
10.离心柱中央加入50-100ul ATE Buffer（70℃预热），置70℃5-10min。
11.13000rpm离心1.5min。
12.将DNA保存于-20℃。
从石蜡包埋组织中提取DNA
基因突变检测实验操作流程一、DNA提取1.Extract RNA（详见QIAGEN Rneasy FFPE Kit,货号74404）注意：所有的离心步骤均在室温下进行。
1)用刀片切除多余石蜡，暴露组织。
2)切片厚度为5-10um（若样本表面已暴露于空气中，则弃掉刚开始的2-3片）。
3)迅速将样本切片放入1.5或2.0ml的小离心管中，加入1ml的二甲苯，盖上管盖，旋涡样剧烈振荡10s。
4)室温下全速（14,000rpm）离心2min。
5)弃掉上清夜，不要接触到沉淀。
6)加入1ml乙醇（96-100%），旋涡样充分混匀。
7)室温下全速（14,000rpm）离心2min。
8)弃掉上清夜，不要接触到沉淀。
9)打开管盖，在室温或37℃下放置10min，直至残留乙醇挥发完。
10)加入180ul缓冲液ATL重悬沉淀，再加入20ul蛋白酶K，充分混匀。
11)于56℃孵育1h（直至样品完全溶解）。
12)90℃孵育1h。
13)稍稍点动离心去除管壁上的液体。
14)加入200ul Buffer AL 于样品中，充分混匀，再加入200ul乙醇（96-100%），再次充分混匀。
15)稍稍离心去除管壁上的液体。
16)将所有的液体混合物转移至QIAamp吸附柱内（套在2ml的收集管内），垂直加入，不要湿润管壁，盖上管盖，8000rpm离心1min。
将收集管及其内液体一并丢掉，QIAamp吸附柱放入一个干净的2ml收集管中。
17)小心打开QIAamp吸附柱，垂直悬空正中加入500ul Buffer AW1，不要加到管壁上。
盖上盖子，8000rpm离心1min。
将收集管及其内液体一并丢掉，QIAamp 吸附柱放入一个干净的2ml收集管中。
18)加入500ul Buffer AW2于QIAamp吸附柱内，8000rpm离心1min，弃掉收集管和管内液体，并将QIAamp吸附柱置于一个干净的2ml收集管中。
19)14,000rpm离心3min。
石蜡标本DNA提取
石蜡标本DNA提取第一天：1.脱蜡①加入二甲苯1.2-1.3ml，震荡混匀，70℃，10min孵育，13000rpm离心2min，弃上清。
②重复①操作2-3次。
2.脱二甲苯：①加酒精即无水乙醇1.2-1.3ml，震荡混匀（剧烈），13000rpm离心1.5min，弃上清。
②重复①操作2-3次。
3.开盖，70℃，静置30min，直至管中无水乙醇挥发完全。
4.加入180ul ATL Buffer，20ul蛋白水解酶混匀，放入56℃水浴锅孵育过夜。
第二天：1.观察组织消化程度，若组织消化不完全，加适量蛋白水解酶（5-10ul），56℃孵育0.5-1.0h。
2.90℃金属浴1h。
3.待温度冷却至室温，加入200ul AL Buffer，轻轻混匀后，迅速加入200ul无水乙醇，上下颠倒混匀。
4.13000rpm离心10-20s，将上清移至吸附柱内，勿吸入白色沉淀。
5.13000rpm离心1min，至离心柱内液体全部离心至收集管中。
6.弃收集管，将吸附柱放于新的收集管中，加入AW1 Buffer 500ul，13000rpm离心1min。
7.弃去收集管中液体，加入AW2 Buffer 500ul，13000rpm离心1min。
8.弃收集管，将吸附柱放于另一个新的收集管中，13000rpm离心3min。
9.弃收集管，将吸附柱放于干净的1.5ml EP管中，开盖，70℃，金属浴放置20-30min，至酒精挥发完全。
10.离心柱中央加入50-100ul ATE Buffer（70℃预热），置70℃5-10min。
11.13000rpm离心1.5min。
12.将DNA保存于-20℃。
石蜡包埋组织的DNA提取及影响因素
• 2.1 有机溶剂脱蜡法
• 二甲苯是被常用于包埋组织脱蜡的高效有机溶剂 。首先将石蜡包埋的组织浸泡在二甲苯溶液中于 室温下脱蜡，一般进行两次，分别为2h和12h。 然后用梯度乙醇(100%至70%)复水，使组织结构 疏松,利于消化液渗入，同时去除组织中痕量的二
甲苯和甲醛。待乙醇自然挥发后将组织浸泡于消
• 医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是 一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡 切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物 学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过 对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细 胞化学的发现。
• Goelz(1985)成功地从蜡块中提取出高质量 的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物 学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新 鲜或冰冻组织细胞的历史，而且可以广泛 地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤 发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断 研究和患者预后评估等方面均具有重要价 值。
化缓冲液。根据需要，可适当提高二甲苯脱蜡的 温度(48℃或65℃)、增加脱蜡的次数、延长脱蜡 或复水时间等。该法脱蜡比较彻底，利于组织消 化，但是过多的操作步骤增加了DNA受污染的可 能，亦容易人为地造成DNA机械性损伤，并且需 要接触有毒物质二甲苯。
• 2.2加热脱蜡法
• 通过加热使石蜡溶解，继而从组织中分离 出来的方法，比较省时省力，同时也避免 了接触有毒化学试剂。但DNA受热后不稳 定，组织内释放出的一些金属离子以及核 酸酶等易对其造成损伤，加热温度越高时 间越长，DNA受损则越严重。另外, 组织受 热不均, 脱蜡有不彻底的可能。
但条带较淡，目的基因测序图混乱，难以读出碱 基序列，效果远不如其他两种情况[7]。
DNA提取的预处理—脱蜡
一种从石蜡包埋组织中快速提取DNA的方法
张 惠丹 任 ，
摘 要： 目的
组 织 切 片 直接 浸 入 １０ ｔ 消化 液 中 ，６℃ 孵 育 ０ ５ｈ １ｈ和 ２ｈ 灭 活 蛋 白酶 Ｋ后 离 心取 上 清 即为 Ｄ Ａ提 取 物 。琼 脂 糖 凝 胶 ５ ｌ ｔ ５ ． 、 ， Ｎ
电泳检测所提取 Ｄ Ａ的片段分 布 ， Ｎ 紫外分光光度法测定 Ｄ Ａ的产量及纯度。以提取 的 Ｄ Ａ为模板 ，Ｃ 扩增不 同长度产物 Ｎ Ｎ ＰＲ
ｐｔ ， ｈｎ ａ ｇ １ ０ ０ ，Ｃ ｉａ ｉ ｌ Ｓ ｅ ｙ ｎ ０ ２ ｈｎ ） ａ １
Ａｂｓｒ ｃ ：Ｐｕｒ ｓ Ｔｏ ｅ ｔｂｌｓ ｏ ｒｕｌｏ ｅ ｓｅ ｔｏ ｏ ａ ｄ ＤＮＡ ｘｒ ｃｉｎ ｆｏ ｆｒ ｌｎ ｆｘ ｄ ｐ ｒ ｆ ｎ ｅ ｔａ ｔ ｐｏ ｅ ｓａ ｉｈ ａ ｐ ｗｅ ｆ ｎ —ｔ ｐ ｍｅｈ ｄ ｆｒｒｐｉ ｅ ｔａ ｔｏ ｒ ｍ ｏ ｍａｉ — ｅ ａ ａ — ｍｂｅ ｅ ｉｓ ｅ ． ｉ ｉ ｄｄ ｄ ｔｓ ｕ ｓ Ｍ ｅｈｏｄ Ｏｎｅ １ Ｉｍ ｒｈｉａ ｉｓ ｅ ｔｏ ｓｄ ｒ ｃｌ ｌｃ ｄ ｉ ｏ ｔｅ ｄ ｇ ｓｉｎ ｂｕｆ ｒｗｉ ｏ ｎ ｒ ｔｅ ｔ ｎ ｎｄ ｉｃ ａｅ ｔ ｔ ｓ ｘ ａｃ ｖ ｌｔｓｕｅｓ ｃ ｉｎ ｗａ ｉｅ ｔｙ ｐａ ｅ ｎｔ ｈ ｉｅ ｔｏ ｆｅ ｔ ｕｔａ ｙ ｐ ｅｒ ａｍｅ ｔａ ｎ ｕｂ ｔｄ ａ ０ ｈ ５６ ℃ ｆ ｒ０． １ ｈ ａ ｅ ｐ ｃｉ ｅｙ，ａ ｄ ｔｅ ｕ ｍ ｉｅ ｏ ｉａ ｔｖ ｔ ｎ ｏ ｒ ｔｉａｓ ａ ｄ ｃ ｔｉｕ ａｉｎ． Ｇｅ ｏ ｃ ＤＮＡ ｎ ｔ Ｕ ｏ ５ ｈ． ｎｄ２ ｈ ｒ ｓ ｅ ｔｖ ｌ ｎ ｈ ｎ ｓ ｂ ｔ ｄ ｔ ｎ ｃ ｉａｉ ｆｐ ｏｅｎ ｅ Ｋ ｎ ｅｎｒｆ ｇ ｔｏ ｔ ｏ ｎ ｍｉ ｉ ｈｅＳ — ｐ ｒ ａａ ｔｗａ ｕａ ｔ ｅ ｎｄ ｑｕ ｌｆｅ ｙ ＤＮＡ ｌｃｒ ｐ ｒｓｓ，ｓ ｅ ｔｏ ｈｏｏ ｔｙ ａ ｄ ｕ ｅ ｓ ｔ ｅ ｔｍ ｐａ ｅ ｏ ｌｍｅａｓ ｈ ｉ ｅ ｃ ｅ ｎ ｔｎ ｓｑ ｎｉ ｄ ａ ａｉ ｄ ｂ ｉ ｆ ｉ ｅｅ ｔｏ ｈｏｅ ｉ ｐ ｃｒ ｐ ｔｍｅｒ ｎ ｓ ｄ ａ ｈ ｅ ｌｔ ｆｐｏｙ ｒ ｅ ｃ ａｎ ｒ ａ —
石蜡组织的DNA提取步骤
QIAamp DNA Mini Kit (50),货号：51304材料：1.二甲苯2.无水酒精3. QIAamp DNA Mini Kit ,货号：51304（ALT Buffer,,蛋白酶K，RNase A, AL buffer,QIAamp Spin Column,AW1buffer, AW2 buffer, AE buffer）一．提取具体步骤：1.取不超过25毫克的石蜡组织放在1.5毫升的离心管中（不提供）。
2.加1200μl的二甲苯，震荡器剧烈混合（涡流）。
3. 室温下14000rpm离心5分钟(15–25°C)。
4. 用枪吸去上清，不要碰到下面的沉淀。
5.加1200ul的酒精（96-100%），以便洗去残留二甲苯，用震荡机轻轻震荡。
6. 室温下14000rpm离心5分钟(15–25°C)。
7. 用枪小心吸去酒精，不要碰到下面的沉淀。
8. 重复5-7步。
9. 放置一定时间（37度条件下孵育10-15分钟），直到酒精完全挥发。
10.把沉淀悬浮在180ul的ATL Buffer（如果缓冲液产生沉淀，需要在56度中孵育溶解）中。
11. 加20ul的蛋白酶K。
用震荡器充分混合，56度孵育直到组织完全溶解。
（从孵育到组织的溶解过程中需要不时振荡，不同组织溶解时间不同，通常是1-3小时。
样品可以反应过夜，这不会影响DNA的制备。
为了保证有效的裂解，应该在摇动的水浴或摇床上进行；如果没有此条件，可以在孵育过程中，每小时晃动2-3次）。
12.将1.5ul的离心管进行短暂离心，以便除去盖子内部的水滴。
13. 继续步骤3a。
(或者如果需要不含RNA的基因组DNA，继续步骤3b)说明：转录活性组织如肝脏和肾脏，含丰富的RNA（将和基因组DNA一起被纯化）。
RNA可以抑制一些下游的酶反应，但是不会影响PCR。
3a 加入200ulAL buffer到样品中，用脉冲震荡器震荡15s，短暂离心以便除去盖子内部的水滴,70度下孵育10min，。
石蜡样本DNA提取
石蜡样本DNA提取1.使用手术刀,修剪多余的石蜡样本块.2.减少部分5 - 10μm厚.注：如果样品表面暴露在空气中,丢弃最先弄的2-3片3.立即将样品放在1.5或2毫升微型离心管,并添加1毫升二甲苯.盖上盖子,漩涡震荡10s. 4室温下全速离心2分钟.5.除去上清液.不去除沉淀颗粒.6.加入1毫升乙醇(96 - 100%)颗粒,通过涡流和混合.从样品乙醇提取残余二甲苯.7. 室温下全速离心2分钟.8.除去上清液.不去除沉淀颗粒..小心地去除任何剩余乙醇，使用细吸管吸.9.打开离心管,在室温(15 - 25°C)或37°C孵化10分钟或直到所有残余乙醇蒸发.10.加入缓冲液ATL 180 μl和20μl蛋白酶K,混合涡流.11.孵化56°C 1 h(或直到样品被完全细胞溶解).12.孵化在90°C 1 h.注：90°C的孵化缓冲ATL部分逆转甲醛改性核酸.更长的潜伏期时间或更高的孵化温度导致更分散的DNA.如果只使用一个加热块,离开后的样品在56°C孵化后室温放置,直到加热块达到90°C. 13.短暂离心.注：如果需要RNA-free基因组DNA,加入2μl核糖核酸酶(100毫克/毫升)和孵化在室温下2分钟,然后再继续步骤14.允许样品冷却到室温之前添加核糖核酸酶.14.加入200μl缓冲液AL样品并漩涡震荡混合彻底.然后添加200μl乙醇(96 - 100%)并漩涡震荡混合彻底注：至关重要的是,样本,缓冲区,和乙醇混合立即完全由涡流或移液产生一个均匀的解决方案.缓冲液AL和乙醇可以预先混合,加在一起在一个步骤时节省时间处理多个样本.缓冲液AL和乙醇混合后可能会产生白色沉淀，这个沉淀不会干扰QIAamp过程.15.短暂离心.16.仔细整个溶解产物转移到带有吸附柱的离心管中,关闭盖子, 6000 x g(8000 rpm) 离心1分钟.弃去废液，将吸附柱放到2ml的收集管中注：如果溶解产物没有完全通过离心后的硅胶膜,离心机在更高的速度,直到吸附柱是空的.17.小心翼翼地打开吸附柱盖子，并添加500μl缓冲AW1 ，盖上盖子, 6000 x g(8000 rpm)离心1分钟.把吸附柱在一个干净的2毫升收集管,并丢弃之前的收集管18.小心翼翼地打开吸附柱盖子并添加500μl缓冲AW2，盖上盖子, 6000 x g(8000 rpm)离心1分钟.把吸附柱在一个干净的2毫升收集管,并丢弃之前的收集管19.空柱离心 (20000 x g;20000 rpm)3分钟.注：这个步骤是必要的,因为乙醇残留可能会干扰下面的步骤20.把吸附柱在一个干净的1.5毫升微型离心机管，丢弃收集管.小心翼翼地打开盖子，在吸附柱中心上方并加入20 - 100μl缓冲液ATE注:确保缓冲液ATE放置到室温.如果使用小洗脱量(< 50μl), 在吸附柱中心上方加入，确保完全洗脱DNA.吸附柱洗脱体积的选择上提供了很大的灵活性.根据需求选择一个量，洗出液的体积不能少于5μl.21.盖上盖子,在室温(15 - 25°C)放置1分钟.(20000 x g;20000 rpm)离心1分钟.通常随着DNA产量而增加放置时间至5min.。
石蜡组织DNA提取SOP
石蜡组织DNA提取SOP提取石蜡包埋组织基因组DNA标准操作规程1. 目的：由石蜡包埋组织中提取出基因组DNA，以保证后续检测的正常进行。
2. 操作者：病理科负责取材的技术员、病理医师以及分子病理技术员。
3. 准备工作：3.1 56℃和90℃水浴锅3.2二甲苯或无毒脱蜡液(Deparaffinization Buffer)3.3无水乙醇3.4蛋白酶K溶液：每管干粉状的蛋白酶K中加入1.1ml蛋白酶K 溶解液，颠倒让蛋白酶K充分溶解，分装保存于-20℃。
3.5洗涤液GW1使用前，须加入17ml无水乙醇进行稀释。
3.6洗涤液GW2使用前，须加入80ml无水乙醇进行稀释。
4. 步骤：4.1标本接收：分子病理技术员负责核对送样登记表所记录的病理号与标本编号是否一致，要求10um肿瘤组织病理石蜡切片不少于4张，可以是已经切好并放在载玻片上的切片；所有切片均应是未经染色的白片。
4.2脱蜡(可按以下方案A或方案B去除石蜡）：方案A：二甲苯去除石蜡(经典方案)A1：石蜡蜡卷A1-1：将石蜡切片置于1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯，盖紧涡旋振荡10s，13000r/min 离心2min，吸去上清，保留沉淀；如脱蜡不完全，可重复该步骤一次。
A1-2：向离心管中加入1ml无水乙醇，涡旋振荡混匀，13000r/min离心2min，吸弃上清，用移液器吸头小心将组织摊开粘附于管壁，置于恒温加热器（预先设置为37℃）10min晾干，直到乙醇完全挥发，之后按4.3步骤进行操作。
A2：石蜡切片A2-1：将组织切片置于二甲苯浸泡10分钟，两次；A2-2：无水乙醇浸泡5分钟，一次；A2-3：蒸馏水中浸泡，刮取肿瘤区域到1.5ml离心管中，之后按4.3步骤进行操作。
方案B：无毒脱蜡液(Deparaffinization Buffer)去除石蜡B1-1：加入0.5ml Deparaffinization Buffer至样品中，剧烈涡旋10s。
10-石蜡组织切片DNA提取操作流程(ADx)
石蜡组织切片DNA提取操作流程实验目的本实验使用二甲苯和QIAamp DNA FFPE Tissue 试剂盒相结合的方法抽提石蜡包埋组织DNA，有效减少PCR抑制剂对后续实验的影响。
实验材料∙二甲苯∙吐温 20∙一次性解剖刀∙ 1.5 ml 离心管∙无水乙醇∙振荡器∙干浴∙冷冻离心机∙QIAamp DNA FFPE Tissue Kit （QIAGNE Cat No: 56404）实验步骤步骤一：切片组织刮取步骤二：DNA脱蜡及消化步骤三：QIAamp DNA FFPE Tissue Kit 提取DNA步骤一：切片组织刮取经过病理评估的组织切片，需事先将肿瘤区域标识出来。
通常本方法使用适当数量5µm厚度切片，刮取肿瘤组织面积约4cm2抽提的DNA量足够检测之用。
DNA提取的得率和质量很大程度上取决于组织本身的性质以及切片制备情况。
1．将相应的样本号标识于1.5mL离心管上。
2．吸取微量(2µl ~ 8µl，根据肿瘤标识区域面积决定吸取的量)的吐温20滴于切片肿瘤标识区域正面以防止刮取切片时组织飞散。
3．用一次性的解剖刀刮取组织至 1.5mL离心管中，注意需刮肿瘤标识区域的组织。
(注意在刮取组织的过程中，尽量仔细小心)4．重复步骤2直至该样本的所有切片均已被刮下转至同一离心管中.步骤二：DNA脱蜡及消化1．加入1 ml二甲苯至样本管中，盖紧并混匀10秒。
2．室温（15-25℃）下最大离心速度(14000rpm)离2分钟。
3．小心的吸去上清，切勿吸去颗粒(沉淀)，弃上清液。
4．加入1 ml 无水乙醇到沉淀中，震荡混匀（去除二甲苯）。
5．室温（15-25℃）下最大离心速度(14000rpm)离2分钟。
6．吸去上清，切勿吸去沉淀，弃上清液。
7．打开离心管盖子，室温或37℃晾干，约10分钟，直到乙醇完全蒸干。
8．向沉淀中加入180µl Buffer ATL，再加入20µl 蛋白酶K，震荡混匀9．56℃消化过夜，直至样品完全裂解。
石蜡切片组织DNA抽提
蔡旭
- 17 -
EGFR 突变检测申请 病理学评估
DNA 抽提
样品处理
DNA 定量（质控）
EGFR突变检测
DNA测序
ARMS
-3-
1. EGFR 突变检测申请
-4-
样品处理
组织蜡块
切片
病理学评估
DNA
实验/数据
存放位置, 使用情况, 是否返还 样品移交记录（实验室间）
LIMS (实验室信息管理系统) Microsoft Excel or Access 手写记录
实验部分：安全注意事项 实验室内必须戴专用安全眼镜 实验室内必须穿实验服 办公区内不准穿实验服 实验室内动手做实验前必须戴手套
- 16 -
实验部分：分组
组 姓名
邢岳士麓超
#1
张稷 陈建
韩晓红
#2
王帅 吴传勇
李喆
#3
冯芬 时利
组 姓名
刘毅
#4
王高文 李建民
王玉艳 谭小军
#5
张晔 李喆
-5-
DNA抽提前
福尔马林固定石蜡包 埋组织(FF-PET)
病理学评估 确认肿瘤细胞
数大于50
-6-
3. DNA 抽提
福尔马林固定石蜡包埋组织
受破坏DNA（固定步骤）
降低DNA 得率
需要可靠的DNA抽提方法
后续分析困难
-7-
DNA抽提方法
• 商业试剂盒 vs. 实验室固有方法
试剂盒
实验室固有方法
通过吐温20释放使DNA从细胞核中释放， 蛋白酶K消化组蛋白,消化裂解过夜，期 间至少重复加入4µL 10mg/mL蛋白酶K两 次，每次间隔1小时以上
石蜡包埋组织DNA提取
石蜡包埋组织DNA提取操作步骤：1.样本处理：制作石蜡切片2.将装有石蜡切片样本的1.5ml离心管中加入1ml二甲苯，震荡均匀后56度温育5min，12000r室温离心2min，用枪头将上清吸出，注意不要去除掉沉淀，重复该步骤3次。
3.向弃沉淀后的离心管内加入1ml无水乙醇，震荡均匀后12000r室温离心5min，用枪头将上清吸出，注意不要去除掉沉淀，重复该步骤2次。
4.室温放置5-10min，充分挥发乙醇，使样品呈现干燥无水状态。
5.加入200μl缓冲液GA和20μl蛋白酶K（可根据样本数量提前将GA和蛋白酶K混合分装，使充分混匀与方便加样），充分混匀后56度温育至样本完全裂解（根据具体实验室情况选择时间，必要和时间允许时可选择过夜温育）。
6.将离心管至于90度孵育1h（原则上不少于30min）。
7.在离心管中加入220μl缓冲液GB和250μl无水乙醇（可根据样本数量提前将GB和无水乙醇混合分装），充分混匀12000r室温离心2min使沉淀沉于管底。
8.准备样本数量相对应的吸附柱（标注样本名称信息等）和收集管，将上述离心管中液体移入吸附柱中（不要吸取沉淀），8000r室温离心2min，将收集管中液体重新移入吸附柱中再8000r室温离心2min，倒掉废液，吸附柱放回收集管中。
9.向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，8000r室温离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
10.向吸附柱中加入600μl缓冲液PW，8000r室温离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管中。
重复一遍。
11.将收集管12000r室温空离2min，弃收集管，将吸附柱开盖置于预先准备的1.5ml新离心管中悬空放置2-5min，以彻底晒干吸附材料中残余的漂洗液（主要为乙醇，乙醇残留会对酶反应有抑制作用）。
此时可以将TE置于65度预热。
12.向吸附膜中间部位悬空加入40μl洗脱缓冲液TE，静置3-5min，12000r离心2min。
石蜡切片提取基因组操作标准
规范从石蜡切片提取基因组操作标准目的：规范提取石蜡切片基因组操作设备和材料：试剂：FFPE Tissue Genomic DNA Kit仪器：离心机，水浴锅，核算测试仪，漩涡振荡器样品处理：1、石蜡切片样品：将水浴锅打开并调至90度， 55度各一个。
注意：Hp检测不适应10um厚度样本，需要提供6um厚度样本1.1 有条件的实验室，将样品分装成两份，一份留作备用，另一份将样品编号。
1.2 将5-10片切片组织加入250ul Buffer GA， 90度孵育30min-60min。
（若Buffer GA 出现沉淀，在温水中溶解后再使用。
）此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的时间和温度过长过高都会造成DNA的断裂。
1.3 90度孵育后，12000rpm 离心2Min，小心穿过石蜡层，吸取200ul 包含组织的液体到一新的1.5mlEP管中，加入20ul 蛋白酶k ，颠倒混匀。
（加入蛋白酶的量可依据组织的多少而定，若过夜笑话组织仍未消化完全，需要考虑蛋白酶k 自身问题）1.4 55度水域，过夜消化，以组织基本都消化为准。
DNA提取：将水浴锅打开并调至70度，并将Elution Buffer 70度预热。
1、将消化后的样品12000rpm 离心2min，吸取上清到一新的编好号的EP管中，加入250ul Buffer GB，充分震荡混匀，70度10min。
2、加入250ul 无水乙醇，充分震荡混匀。
3、转移混合液到编好号的DNA吸附柱中（口腔拭子用枪头挤压吸取混合液），放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液。
4、加入500ul Buffer GD，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管。
5、计入500ul Buffer PW，放置1min，12000rpm离心30s，弃滤液，柱子重新套回收集管。
6、重复步骤5.7、吸附柱套到新的收集管中，12000rpm离心2min。
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实验部分：安全注意事项
实验室内必须戴专用安全眼镜 实验室内必须穿实验服 办公区内不准穿实验服 实验室内动手做实验前必须戴手套
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实验部分：分组
组 姓名 岳麓 邢士超 张稷 #1 陈建 韩晓红 王帅 #2 吴传勇 李喆 冯芬 #3 时利 组 姓名 刘毅 王高文 #4 李建民 王玉艳 谭小军 张晔 #5 李喆 蔡旭
石蜡组织切片DNA抽提
鹿亚超/ Peter Lu
阿斯利康中国创新研究中心 (ICC) 2010.04.11
ANNUAL BUSINESS REVIEW
概览
EGFR 突变检测申请 病理学评估 DNA 抽提
样品处理
DNA 定量（质控）
EGFR突变检测
DNA测序
ARMS
-2-
内容
1. EGFR 突变检测申请 2. 样品处理 3. DNA抽提
-5-
DNA抽提前
福尔马林固定石蜡包 埋组织(FF-PET)
病理学评估 确认肿瘤细胞 数大于50
-6-
3. DNA 抽提
福尔马林固定石蜡包埋组织
受破坏DNA（固定步骤）
降低DNA 得率
后续分析困难
需要可靠的DNA抽提方法
-7-
DNA抽提方法
• 商业试剂盒 vs. 实验室固有方法
试剂盒 质控情况 方便性 成本 DNA质量 经过质控 方便 高 取决于方法 实验室固有方法 可能有内部质控 不方便 低
• 一般，DNA质量越高的方法，DNA得率越低。 • 需要样品量：4~5cm25µm
-8-
Qiagen QIAamp DNA Mini Kit
订购方便 已质控试剂盒 DNA得率相对较高
-9-
QIAamp Mini Kit Procedure
- 10 -
石蜡组织切片DNA提取：实验原理
2.组织切片刮取
3.加热裂解消化DNA
4.去除石蜡
通过离心石蜡将悬浮于裂解液上层，吸取 石蜡层下的溶液，注意吸取时应尽量小心
以避免吸入石蜡等污染物
5.吸附柱收集DNA
使用QIAgen吸附柱收集
- 12 -
该方法优点
无需二甲苯脱蜡，避免对实验人员的伤害 采用加热与吐温蛋白酶K结合，充分裂解胞核消化DNA 采用QIAgen吸附柱有效快速收集DNA，减少PCR抑制剂影响
- 11 -
石蜡组织切片DNA提取步骤
1.石蜡组织切片收集 及鉴定
每个样本以约4~5cm25µm的石蜡组织切 片量为宜，每张片子应由病理医生进行 病理鉴定，并圈出肿瘤区域 使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡 组织至离心管中，尽量防止组织碎片飞 散造成交叉污染 通过吐温20释放使DNA从细胞核中释放， 蛋白酶K消化组蛋白,消化裂解过夜，期 间至少重复加入4µL 10mg/mL蛋白酶K两 次，每次间隔1小时以上
加热法&QIAgen DNA试剂盒： 通过高温结合吐温20以及蛋白酶K使DNA从石蜡组织中裂解 释放，并通过DNA吸附柱有效提取DNA 关键点：
吐温20：非离子型变构剂, 裂解细胞核释放DNA 蛋白酶K：消化与DNA结合的组蛋白
DNA吸附柱：有效快速收集DNA，有效减少PCR反应抑制剂对后续实 验的影响
- 13 -
控制交叉污染
必须严样品用一个解剖刀片
实验前后清洁工作区 经常换手套
无PCR产物区域
- 14 -
核心信息
可靠的样品追踪记录 DNA质量不高 （FFPET样品） 可靠的DNA抽提方法方便后续
EGFR突变分析
控制样品间交叉污染
- 15 -
- 17 -
样品处理
EGFR 突变检测申请 病理学评估 DNA 抽提
DNA 定量（质控）
EGFR突变检测
DNA测序
ARMS
-3-
1. EGFR 突变检测申请
-4-
样品处理
组织蜡块
切片
病理学评估
DNA
实验/数据
存放位置, 使用情况, 是否返还 样品移交记录（实验室间）
LIMS (实验室信息管理系统) Microsoft Excel or Access 手写记录