植物组织培养中常见问题及解决办法(课堂PPT)
《植物组织培养》课件PPT第1章植物组织培养基本知识
②生长周期短，繁殖率高
由于人为控制培养条件，因此生长较快，一般20—30d为一个周期。植物 材料按几何级数繁殖生产，总体来说成本低廉，且能及时提供规格一致 的优质种苗或脱病毒种苗。
③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制
植物组织培养是在一定的场所和环境下，人为提供一定的温度、光照、湿 度、营养、激素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化生产，也利 于自动化控制生产。它是未来农业工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、 田间栽培等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫害等一系列繁杂 劳动，可以大大节省人力、物力及田间种植所需要的土地。
愈伤组织（callus）:在人工培养基上由外植体上形成的一
团无序生长状态的薄壁细胞。
愈伤组织
二、植物组织培养的类型
• 按培养方法分为 固体培养 液体培养 看护培养 微室培养 包埋培养
二、植物组织培养的类型
3.按培养过程分为：
• 初代培养（Primary culture）(无菌培养物)
将从植物体上分离下来的第一次培养。
4.4 组织及细胞培养生产有用物质
Arregnin和bonner在1950年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获 取橡胶的尝试。
近50年来飞速的发展。从400多种植物培养细胞中分离到600多种 次级代谢产物，其中60多种在含量上超过或等于其原植物，20种 以上干重超过1％。 在日本，人参细胞培养已达130600L发酵罐；德国用1000L发酵罐 培养毛地黄细胞；在我国，人参细胞培养技术也已实现产业化。 利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物，德国科学家进行 了出色的研究。他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的 中间化合物毛地黄毒素和一甲基毛地黄毒素，培养细胞以几乎 100％的转化速率使之羟基化，变为医药强心剂地高辛。
植物组织培养中常见问题及对策
细胞分裂素用量不够、温度偏高、光照不足
增加细胞分裂素用量，适当降低温度
苗分化过多，生长慢，部分苗畸形，节间极度缩短，苗密集丛生微型化
细胞分裂素用量过多，温度不适宜
减少细胞激动素用量或停用一段时间，调整培养温度
分化出苗较少，苗畸形，培养较久可能再次出现愈伤化
生长素用量偏Leabharlann ，温度偏高减少激素用量，延长光照。及时转接、减少接种量，改用透气性强的瓶膜
常有黄叶、死苗夹于从生苗中。部分苗逐渐衰弱，生长停止，草本植物有时水渍状、烫伤状
瓶内气体状况恶化，pH值变化过大；久不转瓶糖已耗尽，光合作用不足以满足生长；瓶内乙烯含量升高；培养物已经污染；温度不合适。
不分措施同上。去除污染，控制温度。
幼苗生长无力，陆续黄叶落叶。组织水渍状、煮熟状
部分原因同上，激素搭配不合适，无机盐浓度不合适
部分措施同上。及时转接。适当调整激素比例。
幼苗莲座化，节间极度缩短不伸长
自身合成的赤霉素不够，或细胞激动素用量过多
添加赤霉素、减少细胞激动素用量
苗淡绿色、部分失绿
铁盐不足，pH值不合适，铁、锰、镁元素配比失调，光照过强，温度不适合
减少生长素用量，适当降温
叶粗厚变脆
生长素用量偏高，兼有细胞分裂素用量偏高
减少激素用量，避免叶片接触培养基
再生苗的叶缘、叶面等处偶有不定苗产生
有细胞分裂素用量偏高、或该种植物适于这种再生方法
减少激素用量，或分阶段利用这一再生方法
从生苗过于细弱，不适于生根操作和将来的移栽
温度过高、光照时间短，光强不够、久不转接。生长空间小
激素用量过高、温度过高、培养基渗透势过低
减少激素用量、降低培养温度
植物组织培养中存在的问题及其预防措施
植物组织培养中存在的问题及其预防措施作者：王昱淇来源：《南方农业·下旬》2014年第04期摘要针对存在于植物组织培养过程当中的污染问题作具体分析，包括对于引起污染原因的科学认识和研究污染的意义所在，并提出了预防污染的有效措施，包括对于外植体自身灭菌和控制人为因素两方面，以期为工厂化生产提供一定的科学参考。
关键词植物组织培养；污染；预防措施中图分类号：Q943.1 文献标志码：B 文章编号：1673-890X（2014）12-0134-09自20世纪初，德国植物生理学家哈布兰特提出一个观点即高等植物可以由植物器官和组织不断分割，最后可以分到单个细胞水平，并加以设想，离体的组织器官可以通过植株再生性，从而在实验的条件下形成完整植株的能力，这就是哈布兰特提出的植物细胞全能性理论。
20世纪初，植物组织培养同样兴起，并经历了3个阶段，分别为，探索阶段，奠基阶段，迅速发展阶段。
植物组织培养技术已经得到了长远的发展，应用于工厂化的植物组织培养育苗技术就是一个很好的例证，且在农业、林业、医药等领域植物组织培养技术同样产生了巨大的经济效益和社会效益。
鉴于植物组织培养技术在我国日趋完善，且工厂化育苗生产也随着经济发展而在我国呈现出强势的发展势头，在市场竞争下，由于如何降低生产成本是增长经济效应的关键所在，因此，对于植物组织培养当中产生的污染问题导致经济效益的下降应当引起我们的高度重视。
因此，在植物组织培养过程当中，采取富有成效的预防措施，降低外植体被污染的概率，是工厂化组织培养成功与否的关键。
由此，从分析污染原因出发，并提出了在组培过程当中存在的污染原因及其特性，并以此为据，提出了在组培过程当中如何有效预防污染的措施，以期能为工厂化育苗生产提供理论参考和技术支持。
1 植物组织培养的定义植物的组织培养是近年来发展起来的一项新的科学技术，属于无性繁殖，且是根据细胞具有全能性这个理论来施行的。
广义的植物组织培养被定义为离体培养，这是指在无菌操作条件下，通过从植株中分离出适当的器官组织或者原生质体等，进行人工的控制和选育培养，以期获得再生植株或者具有经济效益的其他产品。
第四讲 组培中常见的问题与对策
无机盐浓度过高可引起酚类物质外溢，Mn和Cu是参与
酚类合成和氧化的重要因子，降低盐离子浓度可减少酚 类外溢；
6-BA/KT不仅能促进酚类合成，还刺激多酚氧化酶的活 性，降低这两种激素浓度可减轻褐化；
加入吸附剂（活性碳）和抗氧化物质（PVP、VC）
3）外植体受伤害程度
机械伤害 减少切口伤面，缩短切口在空气中的暴露时间；
催化下迅速氧化成褐色的琨类化合物，导致整个组 织代谢紊乱，死亡。
1、褐变产生的影响因素
影响植物组织培养褐变的因素很复杂，随植物的种 类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐 变的程度也有所不同；
培养基种类，继代次数，外植体放置方式，光照及
培养基中的添加物等，均对褐化有影响
1）外植体的选择
1）接种前培养基出现大量污染 菌落只存在于培养基表面：可能是密封不好或放置 培养基的空气中孢子过多； 菌落存在于培养基内：贮存母液污染，器具不洁净 或灭菌不彻底。
2）接种后真菌大面积污染，菌落位置不定 可能是接种室的孢子过多或超净台的滤网不洁； 经常清洗或更换滤网，用甲醛熏蒸接种室； （将50ml甲醛倒入10g高锰酸钾中，使甲醛蒸汽散 发出来，密闭门窗24小时）
逐渐变成褐色，外植体组织也随之进一步变褐、死
亡，这一现象称为褐变（Browning）。
褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、 悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常 发生。
褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少
和PPO活性有直接关系。在完整组织中两者是分开
的，当切割受到伤害时，酚类化合物外溢，在酶的
化学伤害 各种消毒剂引起的伤害，选择合适的消毒剂和消毒 时间
植物组织培养精PPT.
原因车，辆及的处安理全善感后觉工敏作锐。的前台接待员可以就应聘者的态度发表有价值的意见。
条件下，可以获得不同的器官。 室到让顶了应部 展 聘的厅者热里进风以入分后一配，模器销拟，售工通人作过员环热可境风以，分接以配着帮器跟助的客你热户评空谈估气，他均让的匀客“地户工进参作入与”干，能燥让力室客。内户情。确境并认测呈，试螺一往旋项往状一在转项面动地试。提的料示最液他后经，阶贮 提 段槽示进进完行入了，塔以这顶后时，的将客面料户试液本人送来选到怀已装疑为置的数在问不干题多。
茎尖离体培养后，可能会出 现的反应：
① 生长太慢；
② 生长过旺，愈伤增多；
③ 生长正常；
二.植物愈伤组织培养
• 愈伤组织培养：是指诱导植物外植体产生无序生 长的薄壁细胞及对其培养的技术。
• 产生原因：经过灭菌或切割后，在适当的环境下 产生的。
• 一般薄壁细胞和形成层易形成愈伤组织。 • 特点：或疏松或致密；颜色不一；可形成一些
• 茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分， 进行无菌培养。这是组织培养中用得最多的一个取 材部位。
• 根据培养目的和取材大小可分为微茎尖培养和普通 茎尖培养。微茎尖指带有1-2个叶原基的生长锥，其 长度不超过0.5mm。普通茎尖指较大的茎尖(如几 mm到几十mm)、芽尖及侧芽。
• 特点：技术简单，操作方便，茎尖容易成活，成苗 所需时间短。
水清7．分理成迅 身交速上资蒸的讯发堆，积在物极，短然的后时用间砖内头干、燥木成棍品等。支持可能不塌的物体，扩大空间。这时，一定要用衣物捂住鼻、口，防止因灰尘呛闷而造成
植物组织培养 PPT课件
植物细胞全能性的发现和证实，为植物种质资源的长期保存开辟 了一条新途径。采用液氮超低温保存技术，能保持很高的存活率，并 且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如建立茎尖分生组织培养 物的超低温保存种质库，不仅可以防止种质的遗传变异和退化，而且 可以长期保存无病毒的原种。
• <6>植物组织培养与转基因技术的应用
试管苗大规模培养
• <2>目前进展较多的大概还有胚状体形成、离体胚培养、高频 再生系 统建立、药用植物细胞培养、染色体检测、抗性研究等， 随着与其他 学科的相互渗透，植物组织培养的前景也将越来越宽广
5.植物组织培养的应用现状
• <1>植物快速繁殖和无病毒种苗生产
目前，通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有 100 多科1000 种以上，有的已经发展成为工业化生产的商品。世界 上80% ～ 85% 的兰花是通过组织培养进行脱毒和快速繁殖的。利用 组织培养进行植物快速繁殖及无病毒种苗生产，不仅能够挽救珍惜濒 危物种，而且能够解决植物野生资源缺乏的问题。
植物组织培养
生命科学学院0802班梅定兰2008114010239
植物组织培养
1.植物组织培养技术的历史 2.植物组织培养的原理 3.植物组织培养技术的研究应用现状 4.植物组织培养技术存在的问题及对策
1-5 植物组织培养中常见问题及解决办法
（二）减轻褐变现象发生的方法
（3）使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱
氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够有效地避免 或减轻很多外植体的褐变现象。
培养基中添加0.1%～0.5%的活性炭对防止 褐变也有较为明显的效果。
（二）减轻褐变现象发生的方法
（4）连续转移：对容易褐变的材料可间隔
的成败有着至关重要的影响。结
合你的实践经验，分析如何降低
组培过程中污染现象的发生？
1）植物品种
由于多酚氧化酶活性上的差异，有些品种 的外植体在接种后较易褐变，而有些品种 的外植体在接种后不易褐变。
2）生理状态：
一般来说，老熟的组织在接种后褐变程度较
幼嫩组织严重。
3）培养基成分：
浓度过高的无机盐会使褐化程度增加；
细胞分裂素水平过高也会刺激某些外植体的 多酚氧化酶的活性，从而使褐化现象加深。
（二）、继代培养阶段
• 1、苗分化数量少、速度慢、 分枝少、个别苗生长细高
• 可能原因：细胞分裂素用量
不足，温度偏高，光照不足。 • 改进措施：增加细胞分裂素 用量，降低温度，改善光照， 改单芽继代为丛芽继代。
2、苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，
苗丛密集，微型化
可能原因：细胞分裂素用
量过多，温度不适宜。
（一）、初始培养阶段
1、培养物变色、坏死、茎断面附近 干枯
可能原因：表面杀菌剂过量，消毒 时间过长，外植体选用不当 改进措施：调换其他杀菌剂或降低 浓度，缩短消毒时间，试用其他部
位，生长初期取材。
2、培养物长期培养几乎无反应
可能原因：基本培养基不适 宜，生长素不当或用量不足， 温度不适宜。 • 改进措施：更换基本培养基 或调整培养基成分，增加生 长素用量，试用2，4-D，调 整培养温度。
植物的组织培养(上课用)PPT演示课件
（四）培养
1、愈伤组织的培养
从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。 2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白 色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温 箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈 伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽， 必须更换培养基，进行继代培养.
39
2、愈伤组织的继代培养
45
结合录像外植体灭菌与接种操作，谈谈组织培养污染的主 要途径及怎样预防污染？
1、外植体带菌 3、接种操作时带入
2、培养基及接种 器具灭菌不彻底
4、环境不清洁
46
污染的预防措施
（一）防止外植体带菌 （二）保证培养基及接种器具彻底灭菌 （三）操作人员严格遵守无菌操作规程 （四）保证接种与培养环境清洁
21
③当同时使用这两类激素时，两者用量的比 例影响植物细胞的发育方向。
生长素用量比细胞分 裂素用量
植物细胞的发育方向
比值高时
有利于根的分化、抑 制芽的形成
比值低时
有利于芽的分化、抑 制根的形成
比值适中时 促进愈伤组织的生长
22
（4）环境因素： （ pH、温度、光照）等条
件也能影响植物组织培养。菊花组织培养，一
微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不 同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物 包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。
③、高等植物是光能自养型生物，为什么在植 物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？
此时的组织或细胞为离体的，细胞所生活 的环境为液体有机物营养环境，而不能体现其 整个植物体的光能自养。
2、无菌操作要求
操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后， 都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。
《植物组织培养》PPT课件
分化程度低的细胞>分化程度高的细胞
细胞分化的实质：基因的选择性表达。
精选课件
16
②全能性的表达
少数体细胞在发育过程中可能丢失一部分遗传物质, 因而失去全能性。如筛管细胞,它在发育过程中失去细胞 核,因而没有全能性。
目前还无法使所有的离体植物细胞都实现其全能性。
精选课件
17
条件
离体状态
营养物质
无机营养 有机营养
人为提供一定的温度、光照、湿度、营养、激 素等条件，既利于高度集约化和高密度工厂化 生产，也利于自动化控制生产。它是未来农业 工厂化育苗的发展方向。它与盆栽、田间栽培 等相比省去了中耕除草、浇水施肥、防治病虫 害等一系列繁杂劳动，可以大大节省人力、物
力及田间种植所需要的土地。
精选课件
14
二、植物组织培养的基本原理
根据不同植物不同部位的不同要求而提供不同
的培养条件，因此生长较快。另外，植株也比
较小，往往20-30天为一个周期。所以，虽然植 物组织培养需要一定设备及能源消耗，但由于
植物材料能按几何级数繁殖生产，故总体来说
成本低廉，且能及时提供规格一致的优质种苗
或脱病毒种苗。
精选课件
13
③管理方便 ，利于工厂化生产和自动化控制 植物组织培养是在一定的场所和环境下，
➢ 细 胞 培 养 单细胞培养
➢器
官
培
养
胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、 叶、花和幼果的部分组织的培养
➢ 原生质体培养
➢ 分生组织培养 茎尖精、选课根件尖等
10
愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤刺激后， 在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成， 可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。
植物组织培养过程中的常见难点及解决
植物组织培养过程中的常见难点及解决1玻璃化现象在进植物组织培养时，经常会发现试管苗呈半透明状，植株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩或卷曲、脆弱易破碎；叶表无角质层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组织，没有栅栏组织。
这种试管苗生长异常现象被称为“玻璃化”，是植物组织培养中特有的一种生理性病变，是培养环境中的一些物理、化学和生化因子共同作用使植物组织新陈代谢紊乱所造成的。
玻璃苗的光合能和酶活性低，器官功能不全，分化能力低，很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料。
1.1 玻璃苗发生的因素培养材料种类和外植体类型影响玻璃苗的发生：梅菜外植体玻璃苗发生率依次是下胚轴≥茎尖≥子叶。
瑞香基部茎段玻璃苗的发生率最低，其次是茎尖，中部茎段产生的玻璃苗几率最高。
此外，玻璃化还可能与外植体大小有关。
组培苗生长的微环境能够影响玻璃化的发生有研究表明，光照时间太长会导致玻璃化现象的增加，超过１４ｈ玻璃化现象较严重。
使用透气性较差的塑口薄膜封口或组培温度过高时，由于引起组培瓶内气体组成的改变，也提高了玻璃化率。
培养基成分（如大量元素、植物激素和蔗糖浓度等）与玻璃化现象有关：培养基中的ＮＨ４＋过多容易导致试管苗玻璃化的发生。
在ＢＡ质量浓度０、５～１．０ｍｇ／Ｌ条件下，玻璃苗率随ＢＡ浓度的增加而显著上升。
蔗糖浓度与玻璃化呈负相关，在一定范围内，蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。
1.2 措施：①增加组培室内通气，并改善培养容器的通风换气条件，适当缩短继代间隔时间。
许多研究表明，使用透气性好的容器或封口材料（如牛皮纸和棉塞）可显著降低玻璃苗率。
增加自然光照②组培室温度：组培室温度控制在２０～２５℃，可缓解玻璃化现象。
另外，采用昼夜变温交替取代恒温也是不错的选择。
③适当提高培养基中蔗糖含量在培养基中添加４％和３.５％的蔗糖，能分别较好地预防光叶楮和山桐子组培玻璃苗的发生。
④调节培养基中植物生长调节剂的浓度和比例2褐变2.1 影响褐变的因素植物种类、基因型及外植体类型：橡胶树不同品种或品系的褐变程度不同，海垦２号的花药褐变较少，而有些品种极易褐变。
植物组织培养实验中存在的问题及其解决办法
植物组织培养实验中存在的问题及其解决办法李万德，杜桂，张剑（湖北生态工程职业技术学院，湖北武汉430200）[摘要]植物组织培养操作过程中的经验积累和技术的掌握是很重要的。
在实验过程中常常出现下列问题：培养基母液配置时容易出现钼酸钠难溶解，母液的贮存过程中产生沉淀或有结晶析出，培养基高压蒸气灭菌后出现灭菌不彻底，组织培养中出现褐化及玻璃化现象。
通过改进母液的配制方法、培养基高压灭菌时采用二次排气法，在培养基中,添加有机物、抑制剂等可解决实验出现的问题。
[关键词]植物组织培养；问题；解决办法[中图分类号]Q813.1+2[文献标识码]C [文章编号]0000-2157/SG (2006)02-0011-02植物组织培养研究自Haberlandt (1902)的工作开始，至今已有100年的历史，广义的组织培养，不仅包括在无菌的条件下利用人工培养基对植物组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。
Gam-borg 曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养、悬浮组织培养、器官培养（胚、花药、子房、根和茎的培养等）、茎尖分生组织培养和原生质体组织培养。
现在植物组织培养技术已在科研和生产中广泛应用，成为最引人注目的生物技术之一，虽然植物组织培养的操作过程并不复杂，但在实验和生产的失败，给科研和生产造成损失，所以，植物组织培养操作过程中经验积累和技术掌握是很重要的。
1培养基母液的配制MS 培养基是组织培养中常见的培养基，下面以MS 培养基为例，简述其母液配制过程中常见的问题及改进办法。
1.1大量元素母液贮存时有沉淀物大量元素中的Ca 2+与SO 42-和HPO 42-容易生成CaSO 4，CaHPO 4沉淀，改制方法把其中的Ca 2+单独配制成一个贮备液，而把其他的大量元素配制成另一个贮备液，考虑到大量元素的溶解度及方便使用问题，通常配制成20倍母液，例如配制1000ml 培养基，只需50ml 大量元素母液。
第五章 植物组织培养中常见问题及解决办法
二、褐变
（一）定义 在组培过程中，培养材料向培养基中 释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色， 培1、品种：由于多酚氧化酶活性上的差异， 有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有 些品种的外植体在接种后不易褐变。 2、生理状态：一般来说，幼嫩的组织在接 种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接 种后褐变程度较为严重。
三、 玻璃化
（一）定义
在组培过程中，叶片和嫩梢 呈透明或半透明水浸状的培养 物称为玻璃苗。
（二）玻璃化苗的特点
1、玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿，叶片皱缩成 纵向卷曲，脆弱易碎。 2、叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔， 仅有海绵组织而无栅栏组织。 3、体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、 纤维素和木质素含量低。 4、吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降 低，苗生长缓慢、繁殖系数大为降低，甚至 死亡。 5、生根困难，移栽成活率低。
（三）防治措施
1、增加培养基中的溶质水平，以降低培养 基的水势； 2、减少培养基中含氮化合物的用量；
3、增加光照；
4、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这 对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用； 5、降低培养温度，进行变温培养，有助于 减轻试管苗玻璃化的现象发生； 6、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考 虑加入适量脱落酸。
3、培养基成分：如浓度过高的无机盐会使 褐化程度增加，细胞分裂素的水平过高 也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活 性，从而使褐化现象加深。 4、培养条件不当：例如光照过强、温度过 高、培养时间过长等，均可使多酚氧化 酶的活性提高，从而加速被培养的外植 体的褐变程度。
（三）防治措施
1、选择合适的外植体：一般来说，最 好选择生长处于旺盛的外植体。 2、合适的培养条件：无机盐成分、植 物生长物质水平、适宜温度、及时继代 培养均可以减轻材料的褐变现象。
植物组培技术存在的问题及解决方法
植物组培技术存在的问题及解决方法摘要针对当前植物组织培养中存在的外植体污染、褐化和玻璃化现象进行了阐述，同时对相应的解决方法的研究现状进行了综述，并展望了植物组织培养的研究前景。
关键词植物；组织培养；外植体；问题；解决方法植物组织培养是根据植物细胞具有全能性的理论，以植物细胞培养技术为前提的一项生物技术。
利用植物体离体的器官，诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。
利用组培技术可以快速繁殖大量种苗，有利于品种更新，还可用于脱除病毒和无病毒种苗的繁殖[1]。
1 植物组织培养中存在的问题1.1 外植体污染真菌污染和细菌污染是外植体污染的2种主要形式。
其中，细菌污染是由各种细菌及内生菌引发的，潜伏期很长，有时继代几次后才表现出来。
真菌污染易于发现，由霉菌和酵母菌引发，污染速度快，控制困难，一旦发生则损失较大[2]。
污染既有可能是外植体带入，也有可能是在培养过程中造成的。
培养室灭菌不彻底，操作污染，培养基高压灭菌不到位，后期培养过程中经常出入等原因都有可能造成污染发生[3]。
1.2 外植体褐变外植体褐变是指培养过程中，由于外植体释放褐色物质导致培养基逐渐变褐，最终使外植体变成褐色而死亡。
就外植体本身而言，不同的品种选择的部位、大小、形状、选择的时期、预处理方式、培养条件（包括培养基的成分、状态）、培养的外部环境（如光照、温度、pH值）等都是引发褐变的原因[4]。
1.3 外植体玻璃化玻璃化是指培养过程中，组培苗的叶、嫩梢呈水渍状（透明或半透明），芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎[5]。
与褐变一样，玻璃化既有外植体本身的原因也有外部原因，是培养环境中一些物理、化学因素和生化因子共同作用使植物组织新陈代谢紊乱所致[6]。
外植体的选择、温度、光照、封口的材料、培养基的类型等都会造成玻璃化，液体培养是导致玻璃化的主要原因[7]。
2 组培问题解决途径2.1 污染问题的解决（1）组培室消毒。
植物组织培养中常见的问题及防治措施
植物组织培养中常见的问题及防治措施1微生物污染问题1.1造成污染的原因（1）外植体材料本身带菌；（2）接种过程中接种工具灭菌不彻底或者交叉污染；（3）培养基灭菌不彻底。
1.2防治措施（1）外植体灭菌要彻底。
首先可以选择组织内部无菌材料；其次根据不同的材料选择不同的消毒剂和消毒时间；第三外植体消毒要细心，比如茎段消毒，经过消毒处理后，要把两端切去约0.5cm，这样就可以大大减少污染的概率。
（2）严格遵守无菌操作规程。
操作人员在进入接种室前一定要洗手，然后换上接种服，带上口罩，操作之前先用75%的酒精擦拭双手，接种工具要经常灼烧一保证不会带菌或者交叉污染。
（3）加抗生素。
在培养基中适当的加入抗生素可以有效防止污染。
（4）无菌培养环境。
培养室内要定期进行灭菌，可在室内装紫外灯，或者用高锰酸钾和甲醛熏蒸，或者利用其它的熏蒸剂进行灭菌。
（5）控制外植体的接种数量。
每个培养瓶中尽量接种少量的外植体。
（6）及时继代培养。
定期检查组培苗的生长情况，发现有污染苗头的组培苗及时转接到新鲜培养基上。
2褐变问题2.1影响褐变的因素（1）外植体材料的基因型；（2）外植体的生理状态；（3）培养基成分。
2.2防治措施（1）选择适当的外植体。
选择处于旺盛生长状态的外植体，对于容易褐变的植物注意对其不同品系的基因型进行筛选，选择褐变率较低的材料作为外植体。
（2）在培养基中加入还原性物质或者吸附剂。
在培养基中加入偏二亚硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸等抗氧化剂；或者加入0.1-1%的活性炭吸附培养物在生长过程中分泌的酚类、醌类物质，但是要注意活性炭也可以吸收培养基中的激素使之浓度降低。
（3）对培养材料进行预处理。
用抗氧化剂溶液进行预处理或者在接种前用无菌水洗净切口渗出的酚类物质。
（4）适当的培养条件。
在培养初期保持较低温度（15-20℃），可以降低PPO活性，防止酚类物质氧化，减轻褐变。
（5）其他措施，培养初期进行连续转接。
3玻璃化问题3.1影响玻璃化的因素（1）外植体材料；（2）培养的环境条件；（3）培养基成分，琼脂的浓度、碳源的种类及含量等；（5）封口材料。
植物组织培养基本理论与操作技术(PPT 42页)
(四)、pH值
1.培养基适宜PH值5.0-6.5，一般为5.6－5.8； 可用0.1M的NaOH和HCl溶液进行调整。
2.ｐH值影响培养基的硬度。
PH＞6.5 PH＜5.0
培养基会变硬 培养基不易凝固
3.灭菌之前，培养基的ｐH要比标准提高0.2 －0.3个单位。
(五)、气体(必要条件)
1.培养瓶内氧气的充 足与否与封口材料有 关。 可用棉塞或特制的封 口塑料。通气最好的 是棉塞，但棉塞易使 培养基干燥，夏季易 引起污染。
磁 力 搅 拌 器
恒温水浴锅
冰箱
2、配药室
功能：培养基母液的配制、 药品贮藏等。
配备：工作台；冰箱、各类天 平、酸度计、药品橱、移液器、 各类玻璃容器等。
要求：干燥、洁净。
药 品 橱
工 作 台
电 光 分 析 天 平
电 子 天 平
托盘天平
3、贮藏室
•功能：贮藏各种上玻璃器皿、日用品等。 •结构：明亮、干燥。 •面积：根据需要而定
培养基中添加白糖可有 效提高培养基的渗透压。
实训一
在参观完学院的植物组织培
？
养室后，你认为有存在什么问题？ 如果给你一块空地，请你设计一 个合理的组培实验室以及需要配 置的仪器设备。
•
1、先天下之忧而忧；后天下之乐而乐 。—— 范仲淹
•
2、捐躯赴国难，视死忽如归。——曹 植
•
3、近乡情更切，不敢问来人。——宋之 问
(五)、气体(必要条件)
2.培养基内氧气充足与否与培养基的种 类和培养方式有关。 ◆固体培养基可加进活性炭来增加通气 度,以利于发根。 ◆液体培养时，可考虑采取振荡培养的 方式，以增加通气性。
(六)、渗透压
《植物组织培养中常见的问题与对策》PPT文档共39页
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
Thank you
《植物组织培养中常见的问题与对策》
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
6、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考 虑加入适量脱落酸。
18
19
20
21
22
23
24
25
26Biblioteka 272829
30
31
32
11
3、培养基成分：如浓度过高的无机盐会使 褐化程度增加，细胞分裂素的水平过高 也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活 性，从而使褐化现象加深。
4、培养条件不当：例如光照过强、温度过 高、培养时间过长等，均可使多酚氧化 酶的活性提高，从而加速被培养的外植 体的褐变程度。
12
（三）防治措施
1、选择合适的外植体：一般来说，最 好选择生长处于旺盛的外植体。 2、合适的培养条件：无机盐成分、植 物生长物质水平、适宜温度、及时继代 培养均可以减轻材料的褐变现象。
组培中常见问题 及解决办法
1
一、污染
（一）定义 是指在培养过程中，培养基
或培养材料上滋生细菌、真菌等 微生物，使培养材料不能正常生 长导致培养失败的现象。
2
（二）常见的菌源 真菌和细菌
3
1、细菌污染一般在接种1-2天后即
可发现，表现为培养基表面出现黏 液状菌斑。
4
2、真菌污染一般在接种3天甚至10天以
4、吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降 低，苗生长缓慢、繁殖系数大为降低，甚至 死亡。
5、生根困难，移栽成活率低。
16
（三）防治措施
1、增加培养基中的溶质水平，以降低培养 基的水势； 2、减少培养基中含氮化合物的用量；
3、增加光照；
17
4、增加容器通风，最好进行CO2施肥，这 对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；
13
3、使用抗氧化剂：在培养基中，使用半胱氨 酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地 避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外 使用0．1％～0．5％的活性炭对防止褐变 也有较为明显的效果。
4、连续转移：对容易褐变的材料可间隔12～ 24小时培养后，再转移到新的培养基上， 这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便 会得到控制或大为减轻。
7
（五）污染原因判断
1、若污染菌类是零星分散在培养 基中，则可确定是人为引起的污染。 若是外植体，菌类从材料培养基以上 部分长起，且发生在5天以后，则说 明是材料带的内生菌。若从培养基以 下开始长菌，发生时间较早，且有从 里向外的趋势，则说明是切口引起的 污染。
8
2、真菌污染后，如果已形成孢子，则 必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌 污染，因此只要及时发现，将材料上 部未感菌的部分剪下转接，材料仍可 以用。
14
三、 玻璃化
（一）定义
在组培过程中，叶片和嫩梢 呈透明或半透明水浸状的培养 物称为玻璃苗。
15
（二）玻璃化苗的特点
1、玻璃化苗植株矮小肿胀、失绿，叶片皱缩成 纵向卷曲，脆弱易碎。
2、叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔， 仅有海绵组织而无栅栏组织。
3、体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、 纤维素和木质素含量低。
9
二、褐变
（一）定义 在组培过程中，培养材料向培养基中 释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色， 培养材料也随之变褐死亡的现象。
10
（二）褐化的主要原因
1、品种：由于多酚氧化酶活性上的差异， 有些品种的外植体在接种后较易褐变，而有 些品种的外植体在接种后不易褐变。 2、生理状态：一般来说，幼嫩的组织在接 种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接 种后褐变程度较为严重。
后才表现出来，主要症状是培养基 上出现绒毛状菌丝，然后形成不同 着色的孢子层。
5
（三）引起污染的原因：
1、培养基灭菌不彻底 2、外植体消毒不彻底 3、操作人员不遵守操作规程 4、无菌室和培养室环境不清洁 5、操作设备及使用工具消毒不彻底
6
（四）预防措施
1、防止材料带菌，材料预培养。 2、严格外植体灭菌。 3、培养基灭菌彻底。 4、严守无菌操作规程。 5、各室保持良好卫生。