第八章定向进化
酶工程课件 5 第八章_酶定向进化
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8.2.2 基因体外随机突变方法--易错PCR技术
易错PCR应用实例
Chen.K和Arnold采用易错PCR对枯草杆菌蛋白酶进行了 体外进化研究。他们通过降低反应体系中dATP的浓度,对 编码该酶从第49位氨基酸到C端的DNA片段进行易错 PCR,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺 (DMF)中酶活性明显提高,其中突变体PC3在60%的DMF 中,酶活力是野生型的256倍。将PC3再进行两个循环的定 向进化,得到的突变体酶活力比PC3还要高3倍。
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生物的自然进化
➢进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
➢进化结果：
基因多样性： 为完成同一功能所表现出的 多个 基因或同一个基因(同源性)
代谢途径的多样性： 同样产物，多条途径 代谢产物的多样性： 同一底物，不同产物
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如何利用相对简单快速的方法对天然 酶的改造或构建新的非天然酶？
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天然酶的局限性
酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足 酶学研究和工业化应用的要求 稳定性差 活性低使催化效率很低 缺乏有商业价值的催化功能
天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。
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现代生物工程对酶的要求
1、能具备长期稳定性和活性 2、能适用于水及非水相环境 3、能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 4、进一步增强酶对多种底物的分解能力
用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排 除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为 控制下进行的
第八章 酶的定向进化
定向进化与自然进化的异同 点
定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸 和应用。 定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化， 使进化朝着人们需要的方向发展。 两者的不同：
•进化动力不同： 保守突变 非保守取代；
•进化方向不同： 适应突变的积累；
•进化速度不同： 非常漫长
•
只需几年、甚至几天； 超越生物学意义的要
定向进化的应用
目标酶
卡那霉素核苷基 转移酶 枯草杆菌蛋白酶
所需功能
热稳定性 作用于有机溶 剂 作用于新底物 有机溶剂中的 底物特异性和 活性
方法
定位诱变+选择 易错PCR+选择
结果
在60-50℃酶半衰期 增加200倍 在60％二甲基亚砜主 仆女冠活力增强170 倍 对cefotaxime的抗性 增加32000倍 活力增加60-150倍
• 优点：简便，随机的定向进化
DNA 重组技术(DNA Shuffling)
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片段复性； 4. 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
• DNA改组具有以下有用的特征： • ①它可以利用现存的有力突变，快速积累不同的 有利突变； • ②重组可伴随点突变同时发生； • ③可以删除个体中的有害突变和中性突变。 • 缺点：DNA改组过程中伴随的较高待点突变频率 会严重阻碍正突变组合的发现。由于绝大多数突 变是有害的，有利突变的重组和稀少有利点突变 会被有害突变的负背景所掩盖。
生物多样性：整个生态系统中的生物
什么是定向进化技术
• 概念提出： • 1993年，美国科学家Arnold F H首先提出 酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶 的改造或构建新的非天然酶。
定向进化的方法
定向进化（Directed Evolution）是一种在试管中模拟达尔文进化过程的方法，通过随机突变和重组，人为制造大量的突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质，实现分子水平的模拟进化。
定向进化的基本步骤包括：
1. 随机突变：在DNA或蛋白质序列中引入随机变化，通常通过使用化学诱变剂或逆转录病毒等。
2. 重组：通过将不同突变体进行基因交换或交叉重组，产生新的变异。
3. 选择压力：根据特定需要和目的，对变异体进行选择，通常通过特定环境下的生存测试或特定酶活性的测定等。
4. 筛选：从大量突变体中筛选出具有期望特征的变异体，通常通过克隆筛选或表型筛选等方法。
定向进化可以在短时间内对蛋白质进行大量改造，是一种非常有效的改善蛋白质性能的方法。
它已经在医药、工业和农业等领域得到广泛应用，例如开发新的药物、生物催化剂和农作物品种等。
第八章 酶定向进化
其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)
图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
酶工程5 第八章_酶定向进化
Stemmer将DNA改组方法引用到酶分子定向进化中，
他用β内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行DNA改组，以逐 渐增加头孢氨00倍的突变体。
酶工程5 第八章_酶定向进化
主要内容
第一节 酶定向进化介绍 第二节 酶基因体外随机突变 第三节 酶突变基因的定向选择 第四节 酶分子定向进化的应用
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第一节 酶定向进化介绍
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获得具有新功能和特性的酶的途径 (1) 从大量未知的生物种系中寻找
(2) 改造现有已知的酶。
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定向进化研究的历史
1 萌芽阶段
首先在分子水平上进行改造单一分子的是Sol Spiegelman。在20世纪60年代,利用RNA噬菌体 Q进行的试验, 证明达尔文的自然选择也可在非细 胞体进行.
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2 奠基阶段
1981年，Hall B G等报道了他们定向改变了大肠杆 菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对 几种糖苷键有水解能力的酶。
天然酶的作用
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界中， 并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物体内 的一系列酶在发挥着作用。
酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应得 以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎所 有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这样 说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养 基上培养．从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳 糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。
第八章酶的定向进化
结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物 来源的天然酶提高270倍，比段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱因与载体重组，再转入 适宜的细胞或包装成重组λ黏粒载体
➢ 转化 ➢ 噬菌粒载体
➢ 转导
2、突变基因的筛选 （1）定向选择环境条件的设定 （2）高通量筛选技术
定向进化的特点 ➢ 适应面广； ➢ 目的性强； ➢ 效果显著。
定向进化的原理 ➢ 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突
变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化 酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。 ➢ 定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 ➢ 定向进化=随机突变+定向选择。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR片段，经过不加引物的 多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引 起基因突变的技术突变频率高，进化速度快。 ➢段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起 突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变 体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。
改变四种底物浓度比等。
2、DNA重排技术为代表的有性进化 定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。 1、突变基因的构建 适用：较小基因的定向进化。
属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。
酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起
蛋白质分子的定向进化
自由能
氨基酸序列与蛋白质空间结构的关系研究源于美 国生物化学家安芬森（C.Anfinsen）。 1961年，他研究了核糖核酸酶的去折叠和重折叠 过程，发现在相同的环境中去折叠的蛋白质都会 恢复到原来的空间结构，认为蛋白质链会以自由 能最低的方式形成三维结构，由此推测蛋白质的 折叠密码隐藏在氨基酸排序中，即所谓的安芬森 原则：蛋白质一级排序决定三维结构。 因为“对控制蛋白质链折叠原理的研究”，安芬 森获得1972年诺贝尔化学奖。
交错延伸PCR
交错延伸(stagger extension process, StEP)PCR是在PCR 反应中把常规的退火 和延伸合并为一步， 缩短其反应时间，从 而只能合成出非常短 的新生链，经变性的 新生链再作为引物与 体系内同时存在的不 同模板退火而继续延 伸。此过程反复进行， 直到产生完整的基因 长度。
E（Glu）G(Gly)
Carlsberg型 S(Ser)
A(Ala)
噬菌体展示技术(Phage Display)
原理：噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目 的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置， 在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下， 使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代 噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或 蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶 分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定 时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体 或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感 染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5 轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体 得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有 期望结合特性的目标噬菌体。
酶定向进化
的过程，以各种细胞为进化对象，通过人工随机
突变，改良细胞的各种特征，主要包括微生物细
胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞
的定向进化等。
分子定向进化
• 分子定向进化是在分子水平上进行定
向进化的过程。通过从细胞内提取或者通
过PCR等方法获得目标分子的基因，在体
• 概念断，经过不加引物的多次PCR循环， 使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突 变的技术过程。
DNA重排技术的基本过程
两条以上正突变基因
酶切
DNA随机片断
无引物PCR
酶切
突变本过程
基因家族若干同源基因 酶切 DNA随机片断 无 酶切
进化酶
DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点
• 相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过 程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物 PCR等步 • 不同点： DNA家族重排技术从基因家族的若干同 源基因出发进行DNA序列的重新排布，而DNA重 排技术则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上 的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。
三、基因家族重排技术
• 概念：又称为基因家族改组技术，是从基 因家族的若干同源基因出发，用酶(DNase Ⅰ)切割成随机片断，经过不加引物的多次 PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排 布而引起基因突变的技术过程。
基因家族：是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两 个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们结构相似、功能相关、进化 上同源。
•
特点
• 基因突变发生在单一分子内，为无性进化。
• 操作简便、随机突变丰用于较小基因
的定向进化。
• 因此要控制好突变率，一般一个目的基因错配碱基数目应 控制在2~5个
第八章酶的定向进化
改进方法
其它改组方法
交错延伸重组( 交错延伸重组 StEP : Stagger extension process) 随机引物体外重组( 随机引物体外重组 RPR: Random2priming in vitro recombination) 临时模板随机嵌合生长( 临时模板随机嵌合生长 RACHITT : Random chimeragenesis on transient templates)
定向进化的历史
1 萌芽阶段 首先在分子水平上进行改造 单一分子的是 Sol Spiegelman在20世纪60年代,利用RNA噬 菌体Q进行的试验,目的是证明达尔文的自然 选择也可在非细胞体进行. 病毒基因组 Q复制酶扩增 DNA突变库 复制快的保留(能被Q酶选择识别的)
2奠基阶段
1981年,Hall B G等报道了他们定向改变了 大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专 一性,开发出对几种糖苷键有水解能力的酶. HallB G等利用lacz缺陷型的菌株为宿主菌, 分别在含有某种碳源的培养基上培养.从酶 的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖, 乳果糖,乳糖酸的突变酶,而野生型的酶不 能水解这些底物.
第八章 酶的定向进化
8.1 简介
通常可通过两条途径获得具有新功能和特性 的酶 一是从大量未知的生物种系中寻找; 二是改造现有已知的酶.
人工改造之定点突变
首先分析蛋白质的三维空间结构,搞清结构 与功能的关系,然后采用定点突变技术改变 蛋白质中的个别氨基酸残基,从而得到新的 蛋白质,理性化设计. 定点突变技术对天然酶蛋白的催化活性,抗 氧化性,底物特异性,热稳定性及拓宽酶反 应的底物范围,改进酶的别构效应等进行了 成功的改造.
实例
Stemmer 等从不同种微生物中选择编码头孢 菌素酶的4 个同源基因, 对它们进行单独进化 和同源重组进化, 来对这两种进化模式进行比 较.在对单基因进化得到的突变酶中, 对头孢 羟羧氧胺的抗性最高的增加了8 倍, 而采用 Family shuffling 的方法使抗性比其中两种微 生物来源的天然酶提高270 倍, 比另两种酶提 高了540 倍.
定向进化的原理和步骤
定向进化的原理和步骤•定向进化的原理是利用人工手段产生基因多样性和选择压力，从而筛选出具有期望特征的蛋白质或核酸。
•定向进化的步骤一般包括以下几个方面：o选择初始目标蛋白或核酸：根据研究目的和需求，选择一个具有潜在功能或改造空间的蛋白或核酸作为进化的起点。
o构建突变体文库：利用不同的方法对目标蛋白或核酸的编码基因进行突变或重组，创造出大量的序列变异，形成一个多样性的文库。
突变或重组的方法可以分为随机进化、半理性进化和理性进化三种策略，根据对目标蛋白或核酸的结构和功能信息的不同程度，选择合适的方法。
o表达和筛选突变体：将突变体文库导入合适的表达系统，使之转化为蛋白或核酸，并通过高效的筛选方法，从文库中挑选出具有改进或新颖特征的突变体。
筛选方法可以根据目标特征的不同，选择不同的指标和条件。
o重复进化过程：将筛选出来的优良突变体作为下一轮进化的模板，重复上述步骤，直到达到预期的目标或无法继续改进为止。
定向进化的应用和前景•定向进化是一种有效的改造和创造生物分子功能的方法，它在生物催化、生物医药、合成生物学等领域有着广泛的应用和前景。
•在生物催化领域，定向进化可以用于改善或创造新型的酶催化剂，提高其活性、稳定性、特异性、耐受性等性能，从而实现高效、环保、经济的生物转化过程。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有工业价值的酶催化剂，如抗溶血素B、绿色荧光蛋白、聚合酶等。
•在生物医药领域，定向进化可以用于改善或创造新型的药物分子，提高其效力、选择性、安全性、递送性等性能，从而实现更有效、更个性化、更靶向的治疗方案。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有临床价值的药物分子，如抗体、疫苗、基因治疗载体等。
•在合成生物学领域，定向进化可以用于改善或创造新型的生物模块，提高其功能、可靠性、兼容性等性能，从而实现更复杂、更灵活、更智能的人工生命系统。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有创新意义的生物模块，如开关、计数器、振荡器等。
什么是定向进化？
什么是定向进化？定向进化是一种生物进化理论，也被称为领域进化、方向进化、目标进化等，指的是生物种群在进化中受到某些环境因素的限制，从而出现个体特征的偏向性。
在生物进化的过程中，自然选择是起到决定性作用的因素。
而定向进化则是一种受到环境因素联系的选择策略。
比如当被捕食者仅挑选某一种外表特征的猎物时，这种外表特征和生存能力之间的关联就被强化了，进而导致定向进化的出现。
那么定向进化具体是如何进行的呢？1. 针对某种环境压力的选择策略生物在进化过程中，会根据环境变化，发生适应性进化，以适应外部压力。
而当环境压力呈现一定的趋势，生物自然也会发生相应的变化，以适应环境压力，并逐步形成定向进化。
例如，若某个地区食物素来不足，那么生物就会发生相应的进化，以适应缺乏食物的环境，食物占份额大的物种会发展体积较小的个体，而易于把握食物的物种会发展具有灵活性的身体构造，以保证其生存。
2. 人为选择人类的文化活动也能影响到生物的进化，比如养殖业中根据需求，人们通过生产力的选择来繁殖具有特定特征的生物。
在产业化的所谓小包装时代里，鸡的产蛋能力就是个明显的例子，而奶牛乳量、肉鸭重量等就更加显而易见。
3. 基因漂变及突变基因漂变及基因突变是定向进化中的两个常见现象。
因为基因漂变及基因突变都代表了基因发生了一些不可逆转的变化，这些变化可以反映出环境及生物的进化历程。
基因漂变在定向进化中的表现是某些群体具有特定的基因型，并随着环境的变化而逐渐被其他群体所替代；基因突变表现为新型群体的突然出现和有继承关系的新特征。
生物的个体变异异千差万别，会产生各种各样的特征，有利于其迅速地适应新情况，进而形成新的物种。
总结定向进化是解析生物进化过程的重要工具之一。
尽管对于生物的进化在研究中还存在一些难题，但定向进化已经成为了理解及预测生物进化的一个重要论据。
在未来的研究过程中，定向进化将在许多领域发挥更加重要的作用。
定向进化 合成生物学
定向进化合成生物学
定向进化和合成生物学是当今生物科学领域中备受关注的两个重要概念。
定向进化是一种通过人为干预和引导生物进化过程的技术，旨在创造特定的生物体或生物产物。
这一技术的核心思想是利用遗传变异和选择的原理，通过实验室条件下的人为干预来加速生物进化，以达到特定的目的。
定向进化技术的应用范围非常广泛，涵盖了医药、农业、环境保护等多个领域。
例如，可以利用定向进化来改良微生物菌株，使其具有更高的产酶产物能力，或者用于合成特定的化合物。
合成生物学是一门新兴的交叉学科，旨在设计和构建新的生物系统、生物部件或生物产物，以解决现实生活中的问题。
合成生物学的核心理念是将工程学的原则应用于生物学领域，通过设计和组装生物体内的基因、代谢途径等来创造新的生物功能。
这一领域的研究内容涉及基因编辑、合成基因组、人工代谢途径设计等多个方面。
合成生物学的应用潜力巨大，可以用于生物能源生产、药物合成、环境修复等诸多领域。
从科学角度来看，定向进化和合成生物学都是在生物学领域中具有前瞻性和创新性的研究方向。
它们为人类社会的可持续发展和
健康福祉提供了新的可能性和机遇。
然而，同时也需要注意其潜在的风险和伦理问题。
在推动这些技术的发展和应用过程中，需要严格遵循科学伦理原则，确保其安全性和社会责任感。
总的来说，定向进化和合成生物学代表了生物科学领域的前沿技术和理念，它们的不断发展必将为人类社会带来更多的福祉和进步。
同时，我们也需要在推动这些技术应用的过程中保持谨慎和审慎，以确保其发展方向符合社会的整体利益和长远发展。
定向进化怎么解释
定向进化怎么解释
定向进化是植物和动物为适应它们所处的环境而发生的改变的过程。
它通过在一个时间段
内积累的突变和选择的结果，最终导致特定的性状与环境的联系，从而产生不断变化的群体。
许多有关定向进化的研究发现，生物体通过不断继承和形成新基因来表现突变和选择，从而适应新环境，进而达到种族改良的目的。
定向进化是基因演化的一个重要过程。
在特定环境中，生物体可能会遭受不良条件的影响，比如温度过低或饥饿等。
这些不良条件会导致现有的性状发生变化，进而在性状的变化中
引起某些不利的性状。
通过这种机制，定向进化就可以进行，以抵抗这些不利的影响，同时也会带来有利的优化改进。
定向进化的研究也非常重要，因为它可以帮助我们了解特定物种的进化史，探索它们是如
何通过突变和选择来形成某些性状，从而使它们能够具有更好的适应性。
定向进化也可以
帮助我们分析引起它们性状变化的因素，从而更好地有效地管理生物资源。
因此，由定向进化的研究，我们可以深入了解动物和植物的进化史，从而更好地了解它们
是如何适应环境的变化，以及分析影响它们性状变化的原因。
定向进化名词解释
定向进化名词解释
定向进化（ directed evolution）是一种被称为有效突变的遗传机制，该机制使得能产生所需要后代特征变异型个体数量增加。
与其他可以用来改良生物性状的有害基因不同；由于导致疾病发作或死亡风险提高而受到限制，但仍然具备理论价值和实际应用潜力且在现阶段尚未研究清楚之前无法排除掉这类干扰。
例如，患有神经纤维瘤的人群会表达出一些常染色体显性的标记基因，通过有目的地对这样的细胞中基因进行筛选就可以找到少量患者并治愈相关疾病。
- 1 -。
定向进化的原理
定向进化的原理定向进化是一种生物进化的过程，它是指在特定环境下，个体或种群为了适应环境的要求而发生的进化方向的改变。
这种进化是有目的的，通过遗传变异和选择的作用，使个体或种群适应环境的要求。
以下将从遗传变异和选择两个方面来阐述定向进化的原理。
遗传变异是定向进化的基础。
遗传变异是指个体或种群在繁殖过程中产生的基因或染色体的突变。
这种突变可能会导致个体在形态结构、生理功能、行为习性等方面发生改变，从而在适应环境的过程中产生优势或劣势。
例如，某种昆虫在原始环境中以黄色为主要色彩，但由于突变导致个体出现了部分绿色的变异个体。
在环境发生变化，植物的颜色也发生了变化后，这些绿色的昆虫能够更好地融入环境，避免了天敌的侦测，从而获得了生存的优势。
这种基因突变的遗传传递可以通过繁殖来传递给下一代，进而使种群整体发生改变。
选择是定向进化的推动力。
选择是指个体或种群根据环境要求对突变个体进行筛选和选择，选择适应环境的个体或种群。
选择过程中有两种类型，一种是自然选择，另一种是人工选择。
自然选择是指环境对个体或种群进行的选择，通过适应环境的能力来决定个体或种群的存活和繁殖能力。
例如，在某个地区，由于气候变暖，使得原本需长毛的动物开始脱毛，只有少数个体保留了长毛的特征。
在这种情况下，长毛的个体就具有了更好的保暖能力，能够更好地生存和繁殖，从而逐渐成为主导。
人工选择是指人类根据自己的需要对个体或种群进行的选择，通过人为的干预来改变物种的性状。
例如，人类通过选育，使家禽的体型、肉质、蛋产量等方面发生了巨大的改变，以满足人类的需求。
定向进化的原理可以解释很多生物现象。
例如，众所周知，长颈鹿的颈椎比较长，这是因为在环境中，食物资源比较稀缺，长颈鹿需要通过长颈椎来获取更高处的食物。
在长时间的进化过程中，颈椎逐渐变长，以适应环境的需要。
又如，某种鱼类在水中繁殖时，为了保护自己的鱼卵，雄性鱼会在卵上产生特殊的粘液，形成“鱼窝”，以防止卵被其他鱼类吃掉。
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• • 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用
第一节 定向进化简介
• • • • 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶
一．理论来源
• 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生 物进化过程
– 化学进化 – 生物进化
二．概念
• 酶分子改造,基于序列的合理化设计， sequential rational design
– 化学修饰，定点突变
• 定向进化，非合理设计 irrational design
酶分子的合理设计： 酶分子的合理设计： • 利用各种生物化学，晶体学，光谱学等方 法对天然酶或其突变体进行研究，获得酶 的分子特征、空间结构、结构和功能之间 的关系以及氨基酸残基功能等方面的信息， 以此为依据对酶分子进行改造。 酶分子的非合理设计： 酶分子的非合理设计： • 不需要准确的酶分子结构信息而通过随机 突变，基因重组，定向筛选等方法对其进 行改造。
• functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purification
Model Chiral Reaction Catalyzed by Lipase B52
酶分子存在进化潜力的原因
1.天然酶在生物体内存在的环境和酶实际应 用的环境的不同。如非水相作为筛选压力。 2.生命体内的单个酶的进化受到整体调节， 进化机会有限。 3. 非生物体内所涉及的酶或蛋白质的性质， 如蛋白类药物改造消除其副作用。
三．定向进化的选择策略
定向进化=随机突变 正向重组 选择（或筛选） 定向进化 随机突变+正向重组 选择（或筛选） 随机突变 正向重组+选择 – 关键：突变和筛选 – 突变，采用回交法消除不利突变和中性突变 – 筛选，筛选方法必须灵敏，至少与目的性质有 关。 例：蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X 光片消化分析，44000个突变株筛选
O OH OH O
lipase lipB68
R R
O
+
R
R=CH3, and CH2CH3
O
Reaction system contained: 0.5mmol of racemic α-phenylethanol or α-phenylpropanol dissolved in 10ml toluene containing 1mmol of vinyl acetate, with 0.5g immobilized enzyme added. Samples taken at 120hour and subjected to GC analysis.
Zhengbing Jiang, Yitao zheng, Yu Luo, Gang Wang, Hongping Wang, Yushu Ma and Dongzhi Wei*. Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52. Molecular Biotechnology. 2005 ( 31), 095-102.
• 定向进化：突变 定向进化：
筛选
突变位点是随机的，不确定的； 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。
4. 外显子改组 在许多基因中，一个外显子编码一个折叠结 构域，内含子间的重组可使独立的外显子 组装成编码新蛋白质的基因，此过程即为 外显子改组，可导致蛋白质的快速进化。 外显子独立编码的模块组装。 外显子独立编码的模块组装。
5.计算机辅助设计 减少由于盲目随机突变形成的突变库容量过大而造 成的筛选困难。 6.突变库的构建和应用 例：噬菌体表位随机序列多肽库（phage display random peptide library) 合成随机序列寡核苷酸片段，克隆入表达载体表 达，表达产物以融合蛋白的形式呈现在活的丝状 噬菌体表面。肽库中包含了所有可能序列组分， 每一个噬菌体呈现一种肽段，库容量极大，易于 筛选和扩增。通过亲和筛选，可得到较高特异性 和亲和力的理想的目的肽段。
• p-nitrophenyl caprate as substrate. • Optimal temperature as 20°C ，50% activity at 0°C。
Relative Actity of lipB68
Model Reaction：Chiral resolution of α-phenylethanol and α-phenylpropanol via esterification.
成功实例
Lipase genes (lipB52, lipB68) isolated from Pseudomonas fluorescens B52、B68 B52、 AY623009、 Genbank Accssion number AY623009、AY694785
成功实例
Lipase gene (lipB52）expressed in Pichia pastoris KM71 lipB52）
定向进化示意图
随机突变+定向选择＝目标突变体 随机突变+定向选择＝ 最适生长温度提高了！ 最适生长温度提高了！
诱发突变 的因素
细菌
50 C培 养
0
最适生长温度 为37 C
0
突变体 库
选择压 力（温 度）
温度耐受型 突变体
Strategies for the development of effective enzymes
• 定点突变： 定点突变：
突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 PCR技术为基础的 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。
Production of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B68
•Yield to 92% at 20°C and 24 ° hours with immobilized lipB68. •The lowest temperature reported previously.
Production of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B52
Transesterification between soybean oil and methanol. Conversion ＞90% at 40oC for 35 hours
酶分子的定向进化 directed evolution
– 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解 酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的 进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基 因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并 定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
澄清一个事实：定向进化不是定点突变 不是定点突变 澄清一个事实：定向进化不是
回交育种
回交是指两个亲本杂交后，杂种后代与亲 回交是指两个亲本杂交后， 本之一再次进行的杂交。 本之一再次进行的杂交。
A×B ↓ F1×A A称为轮回亲本、 B称为非轮回亲本 A称为轮回亲本、 称为轮回亲本 ↓ 受体亲本 供体亲本 BC1F1×A ↓ BC2F1×A ↓ ： ↓ BCnF1
回交育种是改进现有品种个别性状的一种方法。 回交育种是改进现有品种个别性状的一种方法。 当甲品种有许多优良性状，而存在个别缺点时， 当甲品种有许多优良性状，而存在个别缺点时， 可选择具有甲品种所需性状的乙品种与甲杂交， 可选择具有甲品种所需性状的乙品种与甲杂交， F1及以后各代均用甲进行一系列回交和选择， F1及以后各代均用甲进行一系列回交和选择， 及以后各代均用甲进行一系列回交和选择 使甲品种的原有性状得以恢复，同时获得了需 使甲品种的原有性状得以恢复， 要改进的性状。 要改进的性状。
Characterization of a psychrophilic lipase from Pseudomonas fluorescens strain B68
Hydrolyzation activity of lipase lipB68
120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperature (゜C)
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02, lipJ03) expressed in Pichia pastoris KM71 (lipJ02, lipJ03)
Functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates
Production of biodiesel from soybean oil by immobilized lipB68
Lipase R&D from uncultured microorganism
—— Lipase genes (lipJ02, lipJ03) isolated from environmental sample (lipJ02, lipJ03) Cloned with Genome-Walking. Genbank Accssion number AY673674、AY700013 、