高效毛细管电泳法--原理共29页
高效毛细管电泳法PPT课件
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四、柱效和分离度
（一）理论塔板数和塔板高度
引入与色谱相似的处理和表达方法，用理论塔板数n和 塔板高度H表示柱效。n可以直接由电泳图求出
n
5.54
tm W1/ 2
2
16
tm W
2
tm为起点到谱峰最高点所对应的时间，称为迁移时间。因为 毛细管中，没有固定相，不存在组分在固定相中分配和保留。
（2）阴离子的影响
在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中 的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电 渗流下降。
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4. 温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热” 焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量； HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。 温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；
二、电渗和电渗流
ef i i ep
i
1．电渗现象
当固体与液体相接触时，如果固体表面因某种原因带一 种电荷，则因静电引力使其周围液体带相反电荷，当液体两 端施加一定电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动， 我们把这种液体相对于带电固体表面移动的现象叫做电渗。
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目前，高效毛细管电泳大多使用石英毛细管，在内充缓冲 液PH>2时，管壁的硅醇基（－SiOH）开始部分离解成硅醇 基阴离子（－SiO－），使管壁带负电荷，并由此吸引溶液中 的阳离子，在管壁和溶液之间形成双电层。毛细管内壁的双 电层及其电势分布见下图。
毛细管电泳测序原理
毛细管电泳测序原理毛细管电泳测序是一种基于DNA片段长度差异的测序技术，其原理是利用毛细管电泳分离DNA片段，并根据片段移动速度的差异确定序列信息。
首先，需要通过PCR扩增得到目标DNA片段。
PCR是一种体外DNA扩增技术，通过DNA聚合酶的作用，将目标DNA序列扩增至足够数量，以便进行下一步的测序分析。
接下来，将PCR产物加入到含有聚合物的毛细管内，并施加电场。
在电场的作用下，DNA片段会被吸附在毛细管内壁上，并形成一个移动带。
然后，施加电场，并在毛细管两端连接电源，使得电场通过毛细管内的DNA移动带。
不同长度的DNA片段根据其分子量不同，会以不同的速度移动，分离出DNA片段。
在这个过程中，由于DNA片段的质荷比不同，所以在电泳过程中会出现DNA 片段的离子机流效应。
DNA片段的离子机流速度与其质量成反比，因此，越长的DNA片段离子机流速度越慢。
当DNA片段离子机流速度相等时，移动速度以及移动距离的大小就取决于DNA 片段的长度。
因此，通过观察移动带的长度，可以确定DNA片段的长度信息。
为了准确测序，通常还需要将目标DNA分成四份，并分别加入四种带有荧光标记的特异性引物。
这些引物会与目标DNA片段互补配对，并在DNA扩增过程中，序列确定位置为反应产物的末端，引物上的荧光标记用于定位。
接下来，将四种标记的引物混合加入PCR反应混合液中，并进行PCR扩增。
在扩增过程中，引物会进行无模板扩增，因此会得到四种不同长度的扩增产物。
随后，将PCR产物经过毛细管电泳分离，根据DNA片段长度的差异，可以将这些扩增产物分离开来，并观察每一带的荧光信号的顺序。
通过分析荧光信号的顺序，可以得到DNA序列的信息。
由于每一个碱基都分别用不同的荧光色标标记，因此可以通过观察荧光信号的顺序获取DNA序列。
毛细管电泳测序的优点是测序速度快、准确度高，可以同时进行多个样品的测序。
毛细管电泳测序仪器相对简单，操作方便，适用于中小型实验室。
高效毛细管电泳法
2020/6/13
一、高效毛细管电泳基本原理
HPCE是离子或荷电粒子 以电场为驱动力，在毛细管 中按其淌度或/和分配系数 不同进行高效、快速分离的 一种电泳新技术。由于不同 离子所带电荷及性质的不同， 迁移速率不同可实现分离。 粒子在电场中的迁移速度， 除与电场强度和介电性质有 关外，与粒子的有效电荷及 其大小形状也有关。这些因 素构成了电泳分离的基础。
第七章
一、高效毛细管电泳
液相色谱分析法
基本原理
high performance liquid chromatograph
二、仪器装置 三、影响柱效的因素
第五节
高效毛细管电泳
及改进方法 四、主要特点和应用
（high-performance capillary electrophoresis, HPCE）
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（6）毛细管电色谱(CEC)
在毛细管壁上键合涂渍或填充HPLC固定相微粒 ，以试样和固定相之间的相互作用为分离机制，以电 渗流为流动相驱动力的色谱过程。兼具了HPLC和CE的 优点。
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二、仪器装置
• 电压：0～30KV。 • 紫外或激光诱导荧光检测器 （可检测到：10-19～10-21 mol/L）
电渗流控制：电渗流的 大小和方向依赖于毛细 管壁与溶液间电势的极 性和大小。
使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加 NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗 流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。
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四、主要特点和应用
•高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。 •高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。 •高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离 19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质. •试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样 •仪器简单，操作成本低，操作简便： •分析一个试样仅需几毫升流动液，溶剂消耗少，环境污染 小。
高效毛细管电泳法原理
高效毛细管电泳法(简称CE)是一种应用电泳原理的分离技术,适用于分离和测定小分子有机化合物和生物大分子,如氨基酸,肽,核酸和蛋白质等,因其操作简便,分离速度快,分辨率高,样品耗费小等优点而广泛应用于分析技术领域.
其原理主要是利用电荷作用力和电流作用力共同作用于被分离物质,在快速流动的毛细管内进行分离,不同的物质根据其理化性质差异,在电场力的作用下,快速分离并达到最终的分析结果.
具体分离过程可分为三步:1.预处理:通过对样品进行一些必要的化学或物理处理,如蛋白的
脱盐,核酸的降解等,使之达到最佳测定条件.2.分离和检测:样品被注入高压,在毛细管内被电场引导向阳极(或阴极)并被快速分离,经过检测器检测,得出分析结果.3.定量分析:基于标准品,定量分析被分离物质的浓度.
在实际应用中,高效毛细管电泳法可通过改变分离毛细管的材料、加入胶体、调整电场强度等方式,进一步提高分离效率和分辨率,并能够与其他分析技术结合使用,如质谱法、光谱法等.
综上,高效毛细管电泳法是一种快速、高效、准确的分离技术,具有广泛的实际应用价值,在
企业管理和生物学等领域都有着广泛的应用前景.。
高效毛细管电泳法在药物分析中的运用课件
拓展高效毛细管电泳法在生物样品分析中的应用 ，如血样、尿样等。
05
高效毛细管电泳法在药物分
析中的实际案例
案例一：中药材中有效成分的分析
总结词
高效毛细管电泳法在中药材分析中具有高分离效能、高灵敏 度和高分辨率的特点，能够快速准确地测定中药材中的有效 成分。
详细描述
高效毛细管电泳法能够将中药材中的多种有效成分进行分离 ，如黄酮类、皂苷类、生物碱类等，通过紫外可见光谱或质 谱检测器进行检测，实现对中药材的质量控制和药效成分的 定量分析。
通过高效毛细管电泳法，可以研究药 物在体内的代谢动力学，了解药物在 体内的分布、转化和消除过程。
代谢产物鉴定
通过高效毛细管电泳法结合质谱等检 测手段，可以鉴定药物代谢产物的结 构和性质，有助于了解药物的代谢途 径和机制。
03
高效毛细管电泳法在药物分
析中的优势与挑战
优势
高分离效率
高效毛细管电泳法具有极高的分离效 率，能够快速、准确地分离复杂药物 混合物中的各个组分。
分离手性药物
对于手性药物的分离，高 效毛细管电泳法具有独特 的优势，能够实现对手性 药物的拆分和纯化。
分离药物中的杂质
通过高效毛细管电泳法， 可以有效地分离和去除药 物中的杂质，提高药物的 纯度和质量。
药物成分的检测
检测药物浓度
通过高效毛细管电泳法结 合光谱或电化学检测器， 可以实现对药物浓度的快 速、准确检测。
高效毛细管电泳法在 药物分析中的运用课 件
• 高效毛细管电泳法简介 • 高效毛细管电泳法在药物分析中
的应用 • 高效毛细管电泳法在药物分析中
的优势与挑战
目录
• 高效毛细管电泳法在药物分析中 的最新研究进展
《高效毛细管电泳仪》课件
contents
目录
• 高效毛细管电泳仪简介 • 高效毛细管电泳仪的组成与结构 • 高效毛细管电泳仪的操作与使用 • 高效毛细管电泳仪的性能指标与评价 • 高效毛细管电泳仪的发展趋势与展望
01
高效毛细管电泳仪简介
定义与特点
定义
高效毛细管电泳仪是一种基于毛 细管电泳技术的分离分析仪器， 主要用于分析生物、化学、医学 等领域中的各种物质。
检测系统
总结词
检测系统的功能是对分离后的样品进行检测和信号转换，以 便对样品进行分析和数据处理。
详细描述
检测系统通常包括光电倍增管、紫外可见光检测器、电化学 检测器等部件。这些检测器能够将样品中的组分转化为可测 量的电信号或光信号，便于后续的分析和数据处理。
数据处理系统
总结词
数据处理系统的功能是对检测系统获得的信号进行采集、处理、分析和显示，以便对样品进行定性和定量分析。
详细描述
进样系统通常包括注射器、进样阀和 进样针等部件。它能够实现样品的定 量和定时注入，确保样品在电泳过程 中的准确性和稳定性。
分离系统
总结词
分离系统的功能是利用电场作用对不同成分的样品进行分离，是电泳仪的核心部 分。
详细描述
分离系统主要包括毛细管、电源和电解槽等部件。毛细管作为电泳通道，能够使 带电粒子在电场作用下进行迁移和分离。电源提供电场，而电解槽则作为电泳仪 的容器。
详细描述
数据处理系统通常包括数据采集卡、计算机和相关软件等部件。数据采集卡能够实时采集检测系统的信号，计算 机则对这些信号进行处理、分析和显示。相关软件能够对电泳图谱进行解析，提供定性和定量分析结果。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
03
毛细管电泳的基本原理及应用(图文参照)
毛细管电泳的基本原理及应用摘要：毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。
该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。
可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，比HPLC 分析高效、快速、微量。
关键词：毛细管电泳原理分离模式应用1概述毛细管电泳(Caillary Electrophoresis)简称CE，是一类以毛细管为分离通道，以高压直流场为驱动力的新型液相分离分析技术。
CE的历史可以追溯到1967年瑞典Hjerten最先提出在直径为3mm的毛细管中做自由溶液的区带电泳(Capillary Zone Electro-phoresis，CZE)。
但他没有完全克服传统电泳的弊端[1]。
现在所说的毛细管电泳(CE)是由Jorgenson和Lukacs在1981年首先提出，他们使用了75mm的毛细管柱，用荧光检测器对多种组分实现了分离。
1984年Terabe将胶束引入毛细管电泳，开创了毛细管电泳的重要分支: 胶束电动毛细管色谱(MEKC)。
1987年Hjerten等把传统的等电聚焦过程转移到毛细管内进行。
同年，Cohen 发表了毛细管凝胶电泳的工作。
近年来，将液相色谱的固定相引入毛细管电泳中，又发展了电色谱，扩大了电泳的应用范围。
毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一样，同是液相分离技术，因此在很大程度上HPCE与HPLC可以互为补充，但是无论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细管电泳都显示了一定的优势毛细管电泳（C E）除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外，其仪器结构也比高效液相色谱（HPLC）简单。
C E只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。
毛细管电泳具有分析速度快、分离效率高、试验成本低、消耗少、操作简便等特点，因此广泛应用于分子生物学、医学、药学、材料学以及与化学有关的化工、环保、食品、饮料等各个领域[2]。
5.4 高效毛细管电泳
粒子在缓冲溶液中的迁移速度υep与电泳迁移μep（淌度）和 电场E成正比：
υep= μepE 淌度μep：单位电场强度下的平均电泳速度,取决于带电粒子 和介质两者的性质。
5. 带电粒子在CE中的迁移速率：
υ =（ υ电渗流+υ离子）
阳离子：和电渗方向一致，电泳速度与电渗速度之和。
一、毛细管区带电泳（CZE）
（一）分离原理
毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳, 这种 电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带 电粒子的迁移速度是电泳和电渗流速度的矢量和。
阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出。 中性粒子：无电泳现象，随电渗流同行，在阳离子后 流出。但不同结构的中性分子无法相互分离。 阴离子：两种效应的运动方向相反，ν电渗流 >ν电泳,阴 离子在负极最后流出。
十二烷基三甲基氯化铵（DTAC）
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十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）
15
十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）
3.5
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）
0.92
•41
•42
三、毛细管凝胶电泳（CGE）
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成一个细长的网状 多孔凝胶，其具有多孔性，类似分子筛的作用。电荷/质量 比相等但大小不同的分子，在电场力的作用下发生迁移，其 运动速度受到凝胶网状结构的阻碍。大分子受到的阻力大， 移动速度慢，小分子受到的阻力小，移动速度快，从而使它 们得以分离。
特点： （1）进样不均：淌度大的离子比淌度小的进样量大； （2）离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进 不去； （3）特别适合粘度大的试样。
2. 压力进样
（1）进样端加压 （2）出口端抽真空 （3）虹吸进样
《毛细管电泳原理》课件
分离的程度。
分辨率
02
分辨率是指毛细管电泳谱中相邻两峰之间的分离程度，分辨率
越高，分离效果越好。
检测限
03
指在毛细管电泳谱中能够检测到的最小样品浓度，检测限越低
，灵敏度越高。
定量分析
标准曲线法
通过绘制标准曲线，将毛细管电泳谱中的峰高或峰面积与样品浓度进行线性回归 分析，从而进行定量分析。
内标法
通过在样品中加入内标物，利用内标物与样品中各组分的分离度和响应因子相同 的特点，进行定量分析。
数据分析方法
峰高法
通过测量毛细管电泳谱中各组分的峰高，利用峰高与样品浓 度的线性关系进行定量分析。
峰面积法
通过积分毛细管电泳谱中各组分的峰面积，利用峰面积与样 品浓度的线性关系进行定量分析。
05
毛细管电泳的优缺点与展望
优点与缺点
高分离效能
毛细管电泳具有极高的分离效率，可 实现复杂样品的快速分离。
药物分析
毛细管电泳在药物分析中 可用于药物成分的分离和 检测，以及药物代谢产物 的分析。
食品安全
毛细管电泳可用于食品安 全检测，如食品添加剂、 农药残留等的检测。
02
毛细管电泳的仪器与实验条
件
仪器介绍
毛细管电泳仪的基本构成
检测器的选择
包括高压电源、进样系统、毛细管电 泳柱、检测器和数据采集系统等部分 。
配制电解质溶液
按照所需的浓度和比例，配制 电解质溶液。
数据处理与分析
采集实验数据，进行数据处理 和分析，得出结论。
03
毛细管电泳的分离模式与分
离机制
分离模式
毛细管区带电泳（CZE）
胶束电动色谱（MEKC）
毛细管凝胶电泳（CGE）
毛细管电泳分析方法的工作原理介绍
毛细管电泳分析方法的工作原理介绍毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE), 是近年来发展最快的分析方法之一。
1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75μm内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。
1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。
1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。
1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。
短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。
CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。
CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。
二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快；对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl 级, 流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。
CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。
总之, CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度, 常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol；高分辨率, 其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万；高速度, 最快可在60s内完成, 在250s内分离10种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子；样品少, 只需nl (10-9 L)级的进样量；成本低, 只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。
毛细管电泳法
数据处理 检测器 电极 缓冲液
进样方法
1、电动进样 也称电迁移进样.
方法:将毛细管的进样端插入装有试样溶液的 试样管中，试样管中插入电极，与检测端 的缓冲液间施加进样电压，并维持一定时 间，试样溶液在电泳和电渗流作用下进入 毛细管，然后再将试样溶液换成载体缓冲 液，电泳即可进行。
电渗流的意义
电泳过程中，伴随着电渗现象 2. 电渗流的速度比电泳速度快5－7倍 3. 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向 同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中 同时完成正、负离子的分离分析 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数 控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分 离的效率、重现性、分离度。
毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板 凝胶电泳的优点 : 1. 电泳峰尖锐，柱效极高 2. 短柱上实现极好的分离 3. 试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短 已成为分离分析生物大分子如蛋白质、 多肽、核 酸、DNA等强有力的工具。 例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相 结合，用于DNA序列快速分析。
电泳溶液硼砂30 mmol.L-1 (pH 9.43),检测波长295 nm,34 kPa.s压力进样，17 kV恒压电泳，电泳时间10 min，电泳温度 20℃，进样分析溶液中均含硼砂3.0 mmol.L-1 (pH=9.43)。 为消除进样等因素所引起的误差，采用内标定量法。实验 发现p-NBA出峰时间在LIG与FA之间，在优化条件下样品中杂 质对其无干扰，峰形好，用它作内标可明显改善分析精密度， 故选定p-NBA为内标，在进样分析溶液中浓度为60 μg.mL-1。
若某一区带的离子进入前一区带， 由于 电场强度变小而减速，由若进入到下区 带，由于电场强度变大而加速， 都退回 到原区带, 结果导致各区带形成鲜明的 界面.
高效毛细管电泳的理论基础
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2.HPCE中的电渗现象与电渗流
石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管 内壁带负电荷，形成双电层。
在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴 极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中
• 平流是空气水平方向的运动
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5. HPCE中电渗流的作用
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；
各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
ν+ =ν电渗流 + ν+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；
ν- =ν电渗流 - ν-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；
ν0 =ν电渗流
中性粒子运动方向与电渗流一致；
q E 6π
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二、电渗现象与电渗流
electroosmosis and electroosmotic flow
1.电渗流现象
当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电 荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界 面形成双电层，二者之间存在电位差。
当液体两端施加电压时， 就会发生液体相对于固体表面 的移动，这种液体相对于固体 表面的移动的现象叫电渗现象。
（2）阴离子的影响
在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中 的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电 渗流下降。
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4. 温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热”；
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Hale Waihona Puke 谢谢11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
高效毛细管电泳法--原理
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。