transwell实验(整理版)
(完整版)transwell实验原理与步骤
一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 µl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
Transwell Assay
Transwell Assay
一、Transwell侵袭实验
(1)将Transwell小室分别放于24孔板每孔中
(2)在小室上层加入配置好的Matrigel 胶，37℃孵箱孵育聚合30min，吸取上室多余液体，至于超净台中风干1h。
(3)常规消化，离心后收集各组细胞调整细胞密度（用含0.1％BSA的无血清培养基重悬）
(4)每孔上室分别加入200uL（细胞密度为1×105个/mL），根据细胞侵袭能力强弱可适当降低提高细胞密度
(5)下室加入700uL含20％FBS的完全培养液，37℃孵箱孵育24h
(6)24h后取出小室并做好标记
(7)用沾有PBS的棉签轻轻拭去上室未穿过的细胞（把周边也仔细擦净）
(8)PBS浸洗3次
(9)4％多聚甲醛固定30min
(10)三蒸水洗3次，吹干（一定吹干否则可导致不上色）
(11)0.1％结晶紫染色30min
(12)三蒸水洗去浮色，吹干
(13)显微镜观察拍片，200×倍镜下随机选取5个视野，计算穿膜达下室的细胞数，求其均数
二、Transwell迁移实验
（1）将Transwell小室分别放于24孔板每孔中
（2）常规消化，离心后收集各组细胞调整细胞密度（用含0.1％BSA的无血清培养基重悬）
（3）每孔上室分别加入200uL（细胞密度为1×105个/mL），根据细胞侵袭能力强弱可适当降低提高细胞密度
（4）下室加入700uL含20％FBS的完全培养液，37℃孵箱孵育24h
（5）24h后取出小室并标记
（6）其余同侵袭实验。
transwell实验原理与步骤
一、Tran swell 小室制备1. 无基质胶Tran swell 小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。
另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Tran swell 小室制备Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
(完整版)Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
（完整版）transwell实验原理与步骤
（完整版）transwell实验原理与步骤一、Transwell小室制备1. 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。
2. 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
二、制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。
具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。
个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。
个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。
如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。
Transwell小室实验
Transwell小室实验：(1) 在转染前一天，在6孔板内铺上5-8F、HONE1和HNE2细胞，2ml无抗生素完全培养基培养过夜，到转染时使细胞达到60-80%的融合度。
(2) 将pIRESneo3（对照组）和pIRESneo3 Flag-LPLUNC1（过表达组）重组质粒分别溶于50ul Opti-MEM 培基中，加入3ul p3000，混合均匀。
每组设置两个重复孔。
(3) 将适量3ul Lipofectamine 3000溶于50ul Opti-MEM 培基中，混合均匀。
在室温下孵育5min。
(4) 将上述两种混合物混合（总体积约100ul），并在室温下静置10min。
(5) 6孔板中每孔加入100ul的复合物，混合均匀。
(6) 37℃、5%CO2培养箱中继续培养36-48h。
(7) 将冻存于-20℃的BD Matrigel胶取出于4℃过夜，使其融化成液态，稀释胶用的tip、EP管放在-20 ℃过夜已备用。
(8) 基质胶的稀释：取10ul Matrigel胶，加入80ul无血清培养基，充分混匀，(4℃条件下操作)，加入各Transwell板上室中，10ul／室，放入37℃培养箱中，孵育2-3h。
当出现“白色层”时，说明Matrigel胶已经变为固态。
注：基质胶和无血清培养基按1:8 稀释（也有1:2稀释后，10ul/室）(9) 消化转染后的实验细胞，用无血清培基洗涤2 次，再用无血清培基重悬细胞，细胞计数，调整细胞数为2×104 ~ 1×105/ml。
(10) 下腔室中加入800ul含有20％FBS条件培养基，将上室放入不能产生气泡，每孔上室中加入200ul细胞悬液。
37℃培养箱中，孵育约24~48h。
(11) 取出Transwell板，用生理盐水洗两遍，10％甲醛浸洗10min，用清水洗3遍。
(12) 用0.1%结晶紫染色或Giemsa染色，室温5min，生理盐水洗两遍。
(完整word版)Transwell实验原理与操作步骤
Transwell实验原理与操作步骤Trans—这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜,而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12。
0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔.我们将细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响.应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3。
0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3。
0µm以下孔径。
常用0.4、3。
0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
Transwell实验 超详细
Transwell侵袭实验总结之欧侯瑞魂创作第一节概念这里想明确两个概念, 一个是Transwell, 另一个是肿瘤细胞侵袭模型.关于Transwell这个词该如何解释, 查了很多资料也未见准确的注解, 我觉得可以这么理解吧, trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思, well有小室的意思, 可以从字面上理解, 这是一类有通透性的杯状的装置, 根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍, 可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters）, 也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）.更准确地说, Transwell应该是一种实验技术, 这项技术的主要资料是Transwell小室（Transwell chamber, Transwell insert）, 其外形为一个可放置在孔板里的小杯子, 分歧厂家对Transwell会有分歧的命名, 而分歧型号也可有分歧形状, 分歧年夜小, 根据实验需要, 可有分歧选择.但无论是何种外形, 其关键部份都是一致的, 那就是杯子底层的一张有通透性的膜, 而杯子其余部份的资料与普通的孔板是一样.这层膜带有微孔, 孔径年夜小有0.1－12.0µm, 根据分歧需要可用分歧资料, 一般经常使用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）.下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中, 小室内称上室, 培养板内称下室, 上室内盛装上层培养液, 下室内盛装下层培养液, 上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔.我们将细胞种在上室内, 由于聚碳酸酯膜有通透性, 下层培养液中的成份可以影响到上室内的细胞, 从而可以研究下层培养液中的成份对细胞生长、运动等的影响.应用分歧孔径和经过分歧处置的聚碳酸酯膜, 就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究.下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择, 固然分歧细胞其体积分歧, 具体选择时要考虑到细胞年夜小.这里主要谈几种年夜家经常使用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下, 细胞不会迁徙通过, 因此, 若研究不涉及细胞运动能力, 不需要细胞穿过聚碳酸酯膜, 则应选择3.0µm 以下孔径.经常使用0.4、3.0µm.我们实验室用的是0.4µm.将细胞A种于上室, 细胞B种于下室, 可以研究细胞B分泌或代谢发生的物质对细胞A的影响.（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0µm膜, 上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室, 计数进入下室的细胞量可反映下室成份对上室细胞的趋化能力.①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室, 细胞B种于下室, 可以研究细胞B分泌或代谢发生的物质对细胞A的趋化作用.②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室, 下室加入某种趋化因子, 可研究该趋化因子对细胞的趋化作用.（3）肿瘤细胞迁移实验经常使用8.0、12.0µm膜, 上室种肿瘤细胞, 下室加入FBS或某些特定的趋化因子, 肿瘤细胞会向营养成份高的下室跑, 计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力.（4）肿瘤细胞侵袭实验经常使用8.0、12.0µm膜, 原理与肿瘤细胞迁移实验类似.上室种肿瘤细胞, 下室加入FBS或某些特定的趋化因子, 肿瘤细胞会向营养成份高的下室跑, 但与肿瘤细胞迁移实验分歧的是, 聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶, 用以模仿体内细胞外基质, 细胞欲进入下室, 先要分泌基质金属卵白酶（MMPs）将基质胶降解, 方可通过聚碳酸酯膜.计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力.用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强《细胞培养》）：2.1 体内癌细胞侵袭模型2.1.1 皮下移植侵袭模型2.1.2 肌肉内移植侵袭模型2.1.3 腹腔内移植侵袭模型2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型2.1.8 视网内界膜侵袭模型2.2 体外癌细胞侵袭模型2.2.1 体外静止器官培养法2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法2.2.2 半体外半体内器官培养法2.2.3 单层细胞器官培养法2.2.4 瘤细胞球体器官培养法2.2.4.1 静止球体器官培养法2.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法2.2.5 单层细胞侵袭实验模型2.2.6 Transwell侵袭小室测定法可见, Transwell与侵袭实验之间其实不能划等号, Transwell有多种应用, 侵袭实验也有多种方法.所谓Transwell 侵袭实验, 其实是指将Transwell这一技术应用于肿瘤细胞侵袭研究的一种实验.由于其简单易行、重复性好, 因而获得了越来越广泛的应用, 但不能认为研究肿瘤侵袭只有Transwell一种方法.第二节 Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验, 其他方面的Transwell应用我不太清楚, 因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验.1.实验用品：① Transwell小室：多种厂家可提供, 论坛里经常使用的是Costar、Corning、BD 生产的小室, 我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列,另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert.这些厂家提供的小室, 有的已铺好基质胶, 买来就可以用, 很方便, 但也比力贵, 我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的, 质量很好, 可是非常贵, 24孔板配套的小室, 每个价格约130元, 不推荐给年夜家.BD也有已包被好的, 价格不清楚.Coster和Corning公司生产的小室, 是论坛里比力经常使用的, 好像是要自己铺胶, 但据说每个小室本钱只有40左右, 应该比力适合中国国情.下面是一些战友提供的价格, 具体建议年夜家联系代办署理商咨询.linanping1979战友提供的价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm, 用于肿瘤的侵袭实验.iceyxy 战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的.梅林战友提供的BD价格： 240RMB一块（6.5um,24孔,12instert）, 好像是没胶的.liguofan说国产的boyden30块一个.jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到.平均每个20元不到.Transwell小室依照公司的要求, 都是一次性使用的.不外其实洗洗泡泡还是可以重复用的.我用的Chemicon公司的ECM554, 用完后擦去基质胶, 再用胰酶和75%酒精泡, 可以把膜洗得很干净, 用前用紫外里外都照30min.sword01战友提供的处置方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞, 清水冲刷, 超声清洗, 低挡,30min, 清水3×5min, 蒸馏水3×5min, 室温凉干, 用前紫外线小室正面3h, 反面6h, 微波, 低火10min×2.因为我买的是铺好胶的, 所以没买Matrigel, 二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验.以前的Chemicon ECM550系列, 膜很结实, 擦不坏, 可以反复用很屡次, 但现在的膜已经改用一种很薄很脆的资料, 一般只能重复用一次, 真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的, 年夜家可以试试.victoh战友对Millipore公司的millicell有比力详细的讲解, 链接如下：自己没见过, 有兴趣的可以自己研究一下.另外, 根据论坛战友提供的信息, osmonic公司有专用的膜出售, 鼎国生物代办署理.Transwell小室用过后, 可把原来的膜切下, 贴上osmonic公司的膜, 这样又可以用了, 不外我没用过, 有兴趣的可以试试.maojianwen战友的使用方法： trasnwell小室做一次后, 将原来的膜去失落, 重新泡酸, 泡酒精, 使用前照紫外, 然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上, 剪失落过剩的边缘.再照紫外.② 上层培养液：上层培养液采纳无血清培养基, 为维持渗透压, 需加入0.05%-0.2% BSA.③ 细胞：值得注意的是, 有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验.建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达, 特别是MMP-2的表达.如果不清楚细胞MMPs的表达情况, 就盲目进行Transwell侵袭实验, 可能会造成不需要的浪费, 一次Transwell侵袭实验花钱少则数百, 多则数千, 其实不是笔小数目, 还是小心为妙.另外, 为了让实验结果更明显, 可先撤血清让细胞饥饿12－24h, 再进行实验.④ 基质胶：经常使用的是人工重构基底膜资料Matrigel, 主要成份为层黏连卵白和Ⅳ型胶原, 生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等.CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的, 是一种细胞外基质, 4度时是液体, 在37度会逐渐凝固成胶状, 不成逆.同样的工具在sigma叫ECM.zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右.如果购买的小室是已经铺好基质胶的, 那么Matrigel就不需要购买了.⑤ 下层培养液：下层经常使用含5%－10% FBS的培养基, 具体浓度根据细胞侵袭力而定, 侵袭力弱的细胞可适当提高FBS浓度.下层也可用趋化因子, 有战友将纤维粘连卵白加入下层培养液作为趋化因子, 但个人认为, FBS仍是最合适的.⑥ 细胞培养板：经常使用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等, 以24孔最经常使用.细胞培养板没什么特殊要求, 普通的细胞培养板就可以.但要注意, 细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套.⑦ 另外, 膜的下室面可涂上纤维粘连卵白(fibronectin, FN, Sigma有售), 这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上, 也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）.很多战友认为这不是必需的, 而且我也是不涂的, 细胞照样贴壁很好.如果贴壁欠好的话可以试试看.linanping1979战友认为, 如果培养时间很长（>24h）, 细胞还是会失落到下室里面去, 所以有条件的话, 最好还是在膜下层涂上FN.另外, 值得一提的是, 膜下层涂上FN还有一定的趋化作用.2．步伐2.1 Transwell小室制备2.1.1 无基质胶Transwell小室制备① 包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面, 4℃风干.如果需要在下室面铺FN的话, 可将200ul枪头的尖端剪失落,吸取FN均匀涂抹在小室的下面.用胶原（collagen）的话, 一般配成0.5mg/ml, 直接用枪吸了涂在膜上.② 水化基底膜：吸出培养板中残余液体, 每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液, 37℃, 30min.另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不成太年夜, 以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好), 置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶.2.1.2 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求, 将小室放入培养板中, 在上室加入300µl预温的无血清培养基, 室温下静置15－30min, 使基质胶再水化.再吸去剩余培养液.2.2 制备细胞悬液① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h, 进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必需的.② 消化细胞, 终止消化后离心弃去培养液, 用PBS洗1－2遍, 用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至1－10×105, 个人认为不要超越5×105.具体实验时采纳密度要自己摸索, 因为分歧细胞, 其侵袭能力是分歧的.个人经验, 细胞量过多, 穿过膜的细胞会过多过快, 如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话, 可能还没到检测的时间点, 所有的细胞都已穿过, 因此最少也要保证在收样的时候, 上室内还要有一定量的细胞存在.个人认为, 对比组和处置尽量不要分开计数, 因为细胞数目的不同会严重影响实验结果.如果需要对细胞预处置而不能不分开计数, 那么计数一定要多重复几次, 力求准确, 尽量保证对比组和处置组细胞密度一致.2.3 接种细胞① 取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室, 分歧公司的、分歧年夜小的Transwell小室对细胞悬液量有分歧要求, 请参考说明书.24孔板小室一般200µl.② 24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培养基,分歧的培养板加的量有分歧要求, 具体请参考说明书.这里要特别注意的是, 下层培养液和小室间常会有气泡发生, 一旦发生气泡, 下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了, 在种板的时候要特别留心, 一旦呈现气泡, 要将小室提起, 去除气泡, 再将小室放进培养板.③ 培养细胞：惯例培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）.时间点的选择除要考虑到细胞细胞侵袭力外, 处置因素对细胞数目的影响也不成忽视.以我的课题为例, 我使用的药物不单会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制.我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50.用这个浓度处置细胞, 24h内对细胞增殖并没有明显抑制, 但24h后, 抑制作用就开始呈现了.所以, 用这个浓度来做Transwell, 处置时间也必需限定在24h内, 否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡, 使处置组细胞数目少于对比组, 那么就难以肯定穿过膜的细胞比对比组少, 究竟是由于侵袭被抑制引起, 还是处置后细胞数目自己就比对比组少而引起的了.时间过长不成以, 同样, 过短也不成, 因为细胞内会有一定量的MMPs贮存, 短时间内可能侵袭能力不会有太年夜改变.同时从药物被吸收进去, 进而发挥作用, 影响MMPs表达, 到最后释放到培养基中, 还需要一个过程.时间点的选择可尽量长点, 也可选择多个时间点研究时间依赖效应, 但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变动.另外, 我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态, 而是圆形的, 仍是悬浮时的形态, 不外会聚集成团, 所以看到细胞不正常贴壁也没关系张, 是正常现象在培养过程中, 膜下会逐渐有少量小气泡发生, 这是正常现象, 可不予处置, 但我遇到过培养一段时间后, 膜下呈现了年夜气泡, 幸亏及时发现, 否则后果将非常严重.因此, 个人建议, 最好接种细胞后1－2h把培养板从培养箱里拿出来看看, 确信没有年夜气泡发生.2.4 结果统计检测穿过的细胞数有两种方法：2.4.1 直接计数法2.4.1.1 “贴壁”细胞计数这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后, 可以附着在膜的下室侧而不会失落到下室里面去.如下图：通过给细胞染色, 可在镜下计数细胞① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 染色：经常使用的染色方法有结晶紫染色、台肦蓝染色、Giemsa染色、苏木精染色、伊红染色等.个人推荐采纳0.1%结晶紫染色, 这种方法有如下优势：(1). 不需要固定细胞, 直接染色即可.(2). 配制简双方便.(3). 染色后可以用33%醋酸脱色, 将结晶紫完全洗脱下来, 洗脱液可在酶标仪上570nm 测其OD值, 间接反映细胞数.个人认为这是结晶紫染色最年夜的优势所在.因为, 虽然经过准确的细胞计数, 往往穿过膜的细胞数仍难以准确控制, 可能某一批实验穿过的细胞会特别多, 以致细胞成堆, 这种情况下就难以计数了, 这种情况下就可以用醋酸脱色后用酶标仪检测.使用结晶紫染色要注意, 染色前要将膜风干, 否则可能会染不上.③ 细胞计数：我们使用的是Leica DC 300F正置显微镜进行观察和拍照, 把Transwell小室反过来底朝上就可清楚看到小室底膜上下室侧附着的细胞.也有很多人用手术刀将膜切下后染色, 再贴在玻片上, 滴二甲苯, 再盖上盖玻片, 就可以长期保管, 可是这样做小室就成了一次性的了, 未免有点浪费.取若干个视野计数细胞个数.论坛里一般采纳3－5个视野, 也有人用10个, 都是随机选取, 个人认为这样选择的视野带有很年夜的偶然性, 也会掺进人为影响, 特别是计数视野较少的时候.我选取16个视野, 不是随机选择, 而是有固定的位置.我们使用的显微镜所看到的视野的直径刚好是Chemicon公司的ECM550系列小室底面膜的直径的1/4.如图, 蓝色部份暗示膜的年夜小, 白色圆形暗示视野的年夜小, 绿色方形则暗示拍照时所能拍下的视野的中心部份.这样, 每个小室都拍摄如下图的16个视野进行计数, 这样获得结果是比力客观和准确的.2.4.1.2 “非贴壁”细胞计数由于某些细胞自身的原因或某些膜的关系, 有时细胞在穿过膜后不能附着在膜上, 而是失落进下室.如下图：2.4.2 间接计数法间接计数法主要用于穿过细胞过多, 而无法通过计数获得准确的细胞数所采纳的方法, 与经常使用的MTT实验是同样的原理.2.4.2.1 MTT法① 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞② 24孔板中加入500µl含0.5mg/ml MTT的完全培养基, 将小室置于其中, 使膜浸没在培养基中, 37℃ 4h后取出.③ 24孔板中加入500µl DMSO, 将小室置于其中, 使膜浸没在DMSO中, 振荡10min, 使甲臜充沛溶解.取出小室, 24孔板于酶标仪上测OD值.2.4.2.2 荧光试剂检测这类方法一般是与Transwell小室一起出售的, 其原理与MTT 法类似, 是用一种荧光染料染细胞, 再将细胞裂解, 检测荧光值.Chemicon的ECM554即属于这类.2.4.2.3 结晶紫检测上文已说过, 这里不再赘述, 原理与MTT法也是类似的.但结晶紫染色还有个优点, 就是染色和脱色的过程其实不影响膜上细胞, 在脱色后还可重新染色.这是用正置显微镜拍摄的图, 结晶紫染色, 进行细胞计数.第三节 Transwell的其他应用的实验步伐1．Transwell肿瘤细胞迁移实验过程与Transwell侵袭实验基本一致, 分歧的只是不需要铺Matrigel.个人认为, 由于没有基质胶的阻挡, 细胞穿过膜的速度较侵袭实验明显加快, 所以细胞量要更年夜.我做侵袭实验的细胞密度是1×105, 而迁移实验的密度是1×106.另外, 下层培养液的FBS浓度也可适当下调, 我做侵袭实验的浓度是5%, 迁移实验的浓度是2.5%.2．cathywxy战友的Transwell上皮细胞培养步伐做了一段时间的原代细胞培养, 把经验拿出来跟年夜家分享一下吧, 请有关战友共同探讨：(1) 将雄性wistar年夜鼠麻醉, 开胸, 将气管取出, 置于4℃含0.1％胰卵白酶XIV (Sigma), 100 U/ml青霉素和100ug/ml链霉素（Gibco-BRL）、无Ca 2＋、Mg2＋, 无血清的MEM.(2) 用无菌的细胞刮棒刮气管内壁, 将所得溶液离心后获得游离细胞.(3) 离心后立即用新鲜的上述MEM溶液（含10％胎牛血清）清洗3次, 以中和胰卵白酶, 再用含5％胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 ug/ml 链霉素的LHC-8 medium (Biofluids)冲刷一次.(4) 冲刷过后, 将获得的细胞悬液用台盼兰测定活力, 若存活率年夜于90％, 则将细胞以106/cm2密度接种于可通透的多聚碳滤膜上（12 mm SNAPWELL, Costar）, 以37°C 5％CO2-95% 空气含5% 胎牛血清(Gibco-BRL) and 100 U/ml 青霉素and 100ug/ml链霉素的LHC-8 medium孵育6~10天.(5) 孵育后, 经测定跨上皮电阻在1000~2000Ω之间, 即可用于电生理试验.显微镜下气管上皮细胞形细胞呈铺路石状, 圆形核位于中央, 生长时常彼此紧密连接成单层细胞片链接：3. metastasis战友的Transwell B16细胞的体外迁移实验我以前用 costar的Transwell做过B16细胞的体外迁移实验, 具体是这么做的：首先把Transwell颠倒, 在Transwell的PVPF 膜（0.8 um）的下概况涂一层fibronectin(10 ug/ml, 50ul),37度2小时, PBS洗一遍后, 放入预先每孔加有600ul的培养基（含10%血清）的24孔板内, 后在Transwell的内室加入细胞（100ul,用含0.1%血清的培养基稀释好自己所需密度）, 放入培养箱, 12-18小时后, 取出Transwell, 用棉签擦去PVPF膜靠近内室那一面的细胞, 另一面的细胞用甲醛室温固定30分钟, 结晶紫染色20分钟, 用清水洗3遍以上, 后在显微镜下观察细胞, 记数.链接：4．mci战友的内皮细胞HMEC-1迁移实验1%明胶处置的transwell经无血清的MCDB131培液于培养箱中平衡1小时后, 上室加入100µl用serum-free MCDB131稀释的5*104/孔的HMEC及分歧浓度的药物, 下室加入0.6ml serum-free 的MCDB131培液及20%FCS安慰迁移,同时设置相应阴性及阳性对比, 置于CO2培养箱中作用8小时, 然后弃去孔中培液, 用90%酒精常温固定30分钟, 0.1%结晶紫常温染色10分钟, 清水漂净, 用棉签轻轻擦失落上层未迁移细胞, 显微镜(Olympus, DP50, Japan).下观察并拍照, 最后用10%乙酸100µl/孔抽提10分钟, 于600nm处测定OD值.抑制率计算公式为：抑制率（%）=[(OD值给药组-OD值无安慰阴性对比)/（OD值不加药阳性对比- OD值无安慰阴性对比)] ×100%.。
Transwell
Transwell实验：小室，24孔板，基质胶，无血清培养基，有血清培养基，单独的细胞，黄枪头，蓝枪头，大枪头
1.取出基质胶置于冰上，待其融化（时间较长）。
2.每个小室内加50ul基质胶，但领的胶是5*的，铺在小室内的是1*的，所以要用无血清培养基稀释，即10ul胶+40ul无血清培养基，提前在EP管中配好，稍多配点，加入小室，注意胶是否铺满小室底部，注意不要戳破小室膜，加完后置于37℃培养箱2h，待胶凝固。
3.2h后将无血清培养基加热，吸200ul无血清培养基加入小室，水化基质胶，置于37℃培养箱30min,其间消化细胞，用无血清培养基吹打，计数，准备每个小室加10的5次方个细胞。
4.30min后将小室中的培养基吸出，将细胞加入小室，总量200ul，不足量用无血清培养基补齐，如果量太大则只能加200ul，（细胞数计好后，少加20-50ul左右）。
5.加完后，从小室的侧孔加500ul有血清培养基，加入下室。
加完后置于37℃培养箱24-36h 后处理。
6.约30h后，将小室取出用PBS洗2遍，放入干净孔中，再用4%多聚甲醛（上室加100ul,下室加500ul）固定1h。
7.1h后用PBS洗涤2遍，再放入孔中，加结晶紫染色90min（上室加100ul,下室加500ul）。
8.90min后，取出用PBS洗涤，再用显微镜拍照，用棉签将上室膜轻轻拭去，拍出的照片即为侵袭过去的细胞。
细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。
细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化。
2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。
调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
transwell实验(整理版)
第一节概念这里想明确两个概念，一个就是Transwell，另一个就是肿瘤细胞侵袭模型。
1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室得意思，可以从字面上理解，这就是一类有通透性得杯状得装置，根据Corning公司得Transwell说明书中得介绍，可以认为这就是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为就是一种有通透性得支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该就是一种实验技术，这项技术得主要材料就是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里得小杯子，不同厂家对Transwell会有不同得命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
Fig1但无论就是何种外形，其关键部分都就是一致得，那就就是杯子底层得一张有通透性得膜，而杯子其余部分得材料与普通得孔板就是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0、1－12、0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用得就是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图就是一个Transwell装置得纵切面Fig2将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞，从而可以研究下层培养液中得成分对细胞生长、运动等得影响。
Fig3应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。
下面参考guxuefeng战友与cosmosci战友得帖子具体来谈谈孔径得选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用得实验：(1)、共培养体系：小于3、0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3、0µm以下孔径。
Transwell实验-超详细
Transwell侵袭实验总结第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1.Transwell关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
transwell实验(整理版)
第一节概念这里想明确两个概念，一个就是Transwell，另一个就是肿瘤细胞侵袭模型。
1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室得意思，可以从字面上理解，这就是一类有通透性得杯状得装置，根据Corning公司得Transwell说明书中得介绍，可以认为这就是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为就是一种有通透性得支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该就是一种实验技术，这项技术得主要材料就是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里得小杯子，不同厂家对Transwell会有不同得命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
Fig1但无论就是何种外形，其关键部分都就是一致得，那就就是杯子底层得一张有通透性得膜，而杯子其余部分得材料与普通得孔板就是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0、1－12、0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用得就是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图就是一个Transwell装置得纵切面Fig2将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞，从而可以研究下层培养液中得成分对细胞生长、运动等得影响。
Fig3应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。
下面参考guxuefeng战友与cosmosci战友得帖子具体来谈谈孔径得选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用得实验：(1)、共培养体系：小于3、0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3、0µm以下孔径。
Transwell实验
Transwell实验Transwell是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放臵在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B 分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。
（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。
Transwell小室实验
Transwell小室实验Transwell小室实验：(1) 在转染前一天，在6孔板内铺上5-8F、HONE1和HNE2细胞，2ml无抗生素完全培养基培养过夜，到转染时使细胞达到60-80%的融合度。
(2) 将pIRESneo3（对照组）和pIRESneo3 Flag-LPLUNC1（过表达组）重组质粒分别溶于50ul Opti-MEM 培基中，加入3ul p3000，混合均匀。
每组设置两个重复孔。
(3) 将适量3ul Lipofectamine 3000溶于50ul Opti-MEM 培基中，混合均匀。
在室温下孵育5min。
(4) 将上述两种混合物混合（总体积约100ul），并在室温下静置10min。
(5) 6孔板中每孔加入100ul的复合物，混合均匀。
(6) 37℃、5%CO2培养箱中继续培养36-48h。
(7) 将冻存于-20℃的BD Matrigel胶取出于4℃过夜，使其融化成液态，稀释胶用的tip、EP管放在-20 ℃过夜已备用。
(8) 基质胶的稀释：取10ul Matrigel胶，加入80ul无血清培养基，充分混匀，(4℃条件下操作)，加入各Transwell板上室中，10ul ／室，放入37℃培养箱中，孵育2-3h。
当出现“白色层”时，说明Matrigel胶已经变为固态。
注：基质胶和无血清培养基按1:8 稀释（也有1:2稀释后，10ul/室）(9) 消化转染后的实验细胞，用无血清培基洗涤2 次，再用无血清培基重悬细胞，细胞计数，调整细胞数为2×104 ~ 1×105/ml。
(10) 下腔室中加入800ul含有20％FBS条件培养基，将上室放入不能产生气泡，每孔上室中加入200ul细胞悬液。
37℃培养箱中，孵育约24~48h。
(11) 取出Transwell板，用生理盐水洗两遍，10％甲醛浸洗10min，用清水洗3遍。
(12) 用0.1%结晶紫染色或Giemsa染色，室温5min，生理盐水洗两遍。
(完整word版)细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)
迁移实验（cell migration assay）实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
实验步骤：1材料准备：可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell 迁移实验的细胞培养板24孔板.细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，（1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步骤和流程2。
1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。
使用前进行基底膜水化.2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。
但这一步并不是必须的。
②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬.调整细胞密度至5×105/ml。
2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
Transwell试验方法
Transwell细胞侵袭实验与移动实验一、试剂和耗材1)细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10%FBS的RPMI1640培养基及无血清RPMI1640培养基。
2)10×PBS (pH7.0)：Na2HPO4·12H2O （MW 358.4） 2.87gKH2PO4（MW 136.09）0.2gNaCl（MW 58.44）8.0gKCl（MW 74.55）0.2g去离子水至100 ml高压灭菌后，室温保存。
使用液为1×PBS(用无菌水进行1：9 稀释)。
3)冰乙酸:甲醛（1:3）4)Transwell小室(BD, Bioscience)5)Matrigel基质胶（BD, Bioscience，50ug/ml）：商品化，保存-20°。
6)各种规格的枪头、1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml的离心管于-20o C预冷，备用。
7)5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf），TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad）8)细胞计数板、6孔板二、实验步骤（一）侵袭实验1.润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min。
2.细胞准备：在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml无血清培养基，常规培养24h。
3.细胞的接种：1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37℃培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1min以内。
3)弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；4)弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细胞密度大于1.5×105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；5)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25×105/ml；6)将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400μl（含5×104细胞）逐滴加入小室；取500μl含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。
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第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。
1．Transwelltrans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。
更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。
Fig1但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。
这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。
下图是一个Transwell装置的纵切面Fig2将Transwell小室放入培养板中，小室称上室，培养板称下室，上室盛装上层培养液，下室盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。
我们将细胞种在上室，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。
Fig3应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。
这里主要谈几种大家常用的实验：(1).共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0µm以下孔径。
常用0.4、3.0µm。
我们实验室用的是0.4µm。
Fig4将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代产生的物质对细胞A的影响。
(2).趋化性实验可用5.0、8.0、12.0µm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。
①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代产生的物质对细胞A的趋化作用。
②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。
(3).肿瘤细胞迁移实验常用8.0、12.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
(4).肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0µm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。
Fig5上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，但与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。
计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。
第二节 Transwell侵袭实验我的课题涉及Transwell侵袭实验和Transwell迁移实验，其他方面的Transwell应用我不太清楚，因此这里主要谈谈Transwell侵袭实验。
1．实验用品：Fig6① Transwell小室：多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的是Chemicon公司的ECM550系列，另有Boyden chamber、Millipore公司的millicell和雕弓满月射天狼战友介绍的Thincert。
这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。
BD也有已包被好的，价格不清楚。
Coster和Corning公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。
下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。
linanping1979战友提供的价格：coster 的24孔板的transwell的价格是456元RMB,8µm，用于肿瘤的侵袭实验。
iceyxy战友提供的价格：Millipore的8µm的50个1760RMB,0.4µm的2000多,是一次性的。
梅林战友提供的BD价格： 240RMB 一块（6.5um,24孔,12instert），好像是没胶的。
liguofan说国产的boyden30块一个。
jjyy提供的价格是：corning cat No.3422. 6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950人民币不到。
平均每个20元不到。
Transwell小室按照公司的要求，都是一次性使用的。
不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。
我用的Chemicon公司的ECM554，用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。
sword01战友提供的处理方法：用棉签轻轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min，清水3×5min，蒸馏水3×5min，室温凉干，用前紫外线小室正面3h，反面6h，微波，低火10min×2。
因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel，二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移实验。
以前的Chemicon ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在的膜已经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costar和Corning也是可以重复用的，大家可以试试。
victoh战友对Millipore公司的millicell有比较详细的讲解，如下： /bbs/actions/archive/post/2082166_1.html本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。
另外，根据论坛战友提供的信息，osmonic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。
Transwell小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmonic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用过，有兴趣的可以试试。
maojianwen战友的使用方法： trasnwell小室做一次后，将原来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的）将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。
再照紫外。
②上层培养液：上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，需加入0.05%-0.2% BSA。
③细胞：值得注意的是，有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。
建议实验前先用酶谱法检测MMPs的表达，特别是MMP-2的表达。
如果不清楚细胞MMPs的表达情况，就盲目进行Transwell侵袭实验，可能会造成不必要的浪费，一次Transwell侵袭实验花钱少则数百，多则数千，并不是笔小数目，还是小心为妙。
另外，为了让实验结果更明显，可先撤血清让细胞饥饿12－24h，再进行实验。
④基质胶：常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，生产厂家有BD、美国Collaborative Rsearch公司等。
CaoY战友的帖这么说的：Matrigel是BD公司生产的，是一种细胞外基质，4度时是液体，在37度会逐渐凝固成胶状，不可逆。
同样的东西在sigma叫ECM。
zhangyong1036战友提供的价格：BD公司的matrigel 1500左右。
如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。
⑤下层培养液：下层常用含5%－10% FBS的培养基，具体浓度根据细胞侵袭力而定，侵袭力弱的细胞可适当提高FBS 浓度。
下层也可用趋化因子，有战友将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子，但个人认为，FBS 仍是最合适的。
⑥细胞培养板：常用于Transwell侵袭实验的细胞培养板有6孔板、12孔板、24孔板等，以24孔最常用。
细胞培养板没什么特殊要求，普通的细胞培养板就可以。
但要注意，细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套。
⑦此外，膜的下室面可涂上纤维粘连蛋白(fibronectin，FN，Sigma有售)，这样做的目的是使穿过膜的细胞更好地附着在膜上，也可用胶原（collagen）或明胶（gelatin）。
很多战友认为这不是必须的，而且我也是不涂的，细胞照样贴壁很好。
如果贴壁不好的话可以试试看。
linanping1979战友认为，如果培养时间很长（>24h），细胞还是会掉到下室里面去，所以有条件的话，最好还是在膜下层涂上FN。
另外，值得一提的是，膜下层涂上FN还有一定的趋化作用。
zhangyong1036战友提供的价格： sigma的fibronectin，价格在1500左右。
2．步骤2．1 Transwell小室制备2．1．1 无基质胶Transwell小室制备①包被基底膜：用50mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。
如果需要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。
用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。
②水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。
另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9ug/ul) 60-80µl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37℃ 30min使Matrigel聚合成凝胶。
2．1．2 有基质胶的Transwell小室制备Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300µl预温的无血清培养基，室温下静置15－30min，使基质胶再水化。
再吸去剩余培养液。
2．2 制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。