代谢工程在工业微生物育种中的应用

代谢工程在工业微生物育种中的应用

摘要：传统的诱变育种仍是目前发酵工业菌种选育中最常用的育种技术，以基因工程技术为主的多元化育种方式的发展，为代谢途径操作引入了全新的理念和方法，使代谢工程得以发展。代谢工程是对细胞代谢网络的代谢流量及代谢控制进行定量地、系统地分析，并通过DNA重组技术和相关的遗传学手段对微生物细胞进行代谢改造，提高其目的产物代谢量。本文论述了微生物代谢工程的理论基础及其在发酵工业微生物育种中的应用现状。

关键词：代谢工程；代谢途径；菌种选育

发酵工业自20世纪40年代发展至今，在青霉素等抗生素的发酵生产、赖氨酸等一系列氨基酸的发酵生产以及核苷酸、有机酸等物质的发酵产业发展中起了极其重要的作用。在工业微生物育种的过程中，对个别基因进行改造的经典基因工程技术不能保证对微生物代谢网络结构和功能的准确分析和高效利用，影响了相关行业的生产效率的稳定和经济效益的提高。目前，几乎所有重要工业微生物模式菌种的基因组全序列已经或即将公布，转录组、蛋白质组、代谢组、通量组等数据资源正在迅速扩展。充分利用组学数据中包含的有用信息，可以更有效地改造和控制细胞性能、提高底物利用以及产品的产率、改善微生物工业适应性，促进工业生物技术发展[1]。

菌种筛选和持续不断的改良贯彻于发酵生产过程的始终，以基因工程为核心的现代生物技术正越来越显示出其在菌种改良上的魅力，将最终成为微生物育种的主导技术[2]。建立在重组DNA技术基础之上的代谢工程技术，可以更容易地选择菌种的改良靶点，构建具有新的代谢途径的微生物细胞，提高其发酵性能，生产特定目的产物，从而可以推动发酵工业的发展。

一、代谢工程概述

代谢工程（Metabolic engineering），又称途径工程（Pathway engineering），是指利用生物学原理，系统地分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径，通过遗传修饰，完成细胞特性改造的应用性学科。1974年，Chakrabarty在假单胞菌属的两个菌种中分别引入几个稳定的重组质粒，从而提高了对樟脑和萘等复杂有机物的降解活性，这成为代谢工程技术的第一个应用实例。代谢工程的概念是1991年由生化工程专

家James E. Bailey首次提出的。

生物体的代谢过程在不打破其平衡的情况下，都是以满足自身生长发育为基础的，利用调控网络经济划算地生成代谢产物。如果需要积累某种代谢产物，就要打破生物体原有的代谢平衡状态，从代谢网络着手改变细胞的代谢途径，代谢网络是将细胞的生化反应以网络整体来考虑。代谢工程的设计主要是在对细胞的整个代谢网络代谢流进行定性、定量分析的基础上，改变代谢流、扩展代谢途径、构建新的代谢途径。由于代谢工程的核心内容是对细胞代谢网络进行功利性修饰，所以要完成这一过程，首先要对细胞的分解代谢和合成代谢中的多步级联反应进行合理设计，然后利用重组DNA技术强化和(或)灭活控制代谢途径的相关基因。从这一点上来说，代谢工程也是基因工程的一个重要分支，而且通常是一个多基因的基因工程[2]。

近年来，随着组学（基因组、蛋白质组、代谢组等）和高通量筛选技术的大幅发展，让人们可以逐渐了解细胞内错综的次级代谢调控网络。大量微生物全基因组序列的测定和功能基因组学技术的涌现，能够从整体上认识微生物代谢网络；从基因、RNA、蛋白质、代谢物、代谢通量等多个层次系统地分析微生物代谢，极大地推动了代谢工程和微生物发酵工业的发展。代谢工程的发展主要体现在高通量组学分析技术的产生，基因组水平代谢网络模型的建立。代谢工程技术目前已经发展到可以从全局的角度分析改造细胞、设计合成新的生物元件，并且能够改造已经存在的生物系统。

二、代谢工程设计策略

代谢工程的主要目标是识别特定的遗传操作和环境条件的控制，以增强生物技术过程的产率及生产能力，或对细胞性质进行总体改造。在代谢工程发展的初期，代谢工程首先从分析细胞代谢网络结构着手，依据已知的生化反应找到代谢过程中的节点；然后采取合适的分子改造方法进行遗传改造，从而调整细胞的代谢网络；最后对改造后的细胞生理、代谢等状态进行综合分析，确定后续代谢工程的相关工作。

经典的系统代谢工程的策略有以下3个步骤：

1、构建起始工程菌。分析了局部代谢网络结构后，对其代谢途径进行改造，优化细胞生理性能等。

2、基因组水平系统分析和计算机模拟代谢分析。通过高通量组学分析技术的使用，

可以将能提高细胞发酵性能的基因和代谢途径有效地鉴定出来。基因组水平代谢网络模型的构建，也可以模拟分析出另外一些靶点基因。

3、对工业水平发酵过程进行优化，使目的产物代谢达到较高的工业化生产水平[3]。

三、代谢工程在发酵工业中的应用

随着对微生物代谢网络研究的深入及DNA重组技术的日趋完善，通过基因克隆技术改变微生物代谢途径的某些关键步骤，大大提高了产物产率；通过基因重组技术改变微生物的代谢途径，还生产出传统发酵工业无法获得的新产品。微生物基因组学和代谢组学的快速发展，对代谢工程有极大的推动作用[4]。代谢工程在工业微生物育种领域的应用，主要体现在以现代基因工程技术为优化手段，对微生物进行定向的改造，集中于细胞代谢流的控制，以提高目的代谢物的产量或产率。根据微生物的不同代谢特性，代谢工程的应用主要表现在以下三个方面：

1、扩展代谢途径

在宿主细胞中引入外源基因，使原来的代谢途径向后延伸，产生新的末端代谢产物，或是使代谢途径向前延伸，能利用新的原料合成代谢产物，提高产量。张勤等[5]从自然样品中筛选分离得到一株能在pH 2.5的培养基中生长且不利用乳酸的酵母菌，将外源的乳酸脱氢酶编码基因ldhA插入含有G418抗性基因的酵母穿梭载体，构建重组质粒，导入后筛选获得一株具有产L-乳酸能力的重组菌株；通过发酵实验表明，该重组菌产L-乳酸的最适pH为3.5，并在pH 2.5时能正常发酵产乳酸。从自然界筛选的耐高浓乳酸的耐酸酵母菌，并以此为宿主菌构建了具有生产L-乳酸能力的耐酸重组酵母，成功地为以耐酸酵母菌高产L-乳酸进行探索。该耐酸酵母菌株不能利用乳酸，采用代谢工程技术，在耐酸酵母中表达乳酸脱氢酶基因，使原来的代谢途径向后延伸，增加了乳酸合成代谢途径，代谢葡萄糖生成乳酸。

2、重新分配代谢流

如果要利用微生物细胞内的脂肪酸以及脂肪酸代谢中间产物生产生物柴油，中断其β-氧化降解途径是必要的。在大肠杆菌中，编码β-氧化降解途径第一步的脂酰辅酶A合成酶的基因被称为fadD。敲除fadD，脂肪酸的产量能大大提高。此外，敲除编码β-氧化降解途径第二步的脂酰辅酶A脱氢酶的基因fadE，对脂肪酸的合成也有很大的影。因此，