7种常用猪流行性腹泻疫苗临床免疫效果观察和评估

TB 腹泻二联灭活苗组 0.052 0.05 0.053 0.053 0.059 0.051 0.052 0.082 0.066
对照组
0.068 0.051 0.052 0.051 0.049 0.065 0.12 0.06 0.062
2.3 试验猪流行性腹泻病毒排毒情况 采用三重 PCR 进行病原检测，在阴阳性对照
成立情况下，免疫后及攻毒后均未检测到一份阳 只在阳性猪场免疫或母猪产前 27 d 后海穴免疫 1 次，
性。采用 PEDV ORF3 巢式 PCR 检测，免疫后未检 可在一定程度上预防流行性腹泻的发生，但由于其
测到阳性，攻毒后 8 h 到 14 d 都可以检测到阳性， 为后海穴免疫，保定不到位、剂量和位置不准确等都
3.3 检测方法分析
项目
8 h 1 d 3 d 5 d 7 d 14 d
本试验分别在免疫前 1 d、攻毒前 1 d、攻毒后 7 d
HY 腹泻二联灭活苗组
0 1 2 0 0 0 对猪群抗体进行检测，通过临床发病情况观察和病
HL 腹泻二联灭活苗组
114 20 1
TB 腹泻特制二联灭活苗组 1 2 1 3 1 0
比较分析，表明此阳性样本与 PEDV jx 560761 疫 得高水平的 PEDV 母源抗体，防止发病[5]。本试验所
苗 株 同 源 性 达 98.2% ， 证 明 所 分 离 到 的 病 毒 为 采用的仔猪二次免疫，攻毒后至出栏无一头猪死亡，
PEDV。
证明此免疫程序在临床上具有一定的参考价值。
表 4 试验猪攻毒后流行性腹泻病毒检测结果（ORF3） 头
胃肠炎-猪流行性腹泻-猪轮状病毒三联苗。 1.1.3 病毒来源 本试验攻毒所用的病毒液来自金 光公司保存的阳性病料—7 日龄仔猪肠道及内容
通讯作者：黄伟坚，教授.E-mail:huangweijian-1@163.com
物，多重 RT-PCR 检测为 PEDV 阳性，加入青霉素、
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
仔猪、架子猪和肥育猪的发病率可达 100%[1]，尤其 机选取 6 周龄健康仔猪 40 头，随机分为 8 组，每组
是哺乳仔猪受害最严重，具有发病地区多、发病率和 5 头，相互分栏隔离饲养管理。母猪于产前 27 d 免
死亡率高的特点，给养猪业造成巨大经济损失。由 疫 TB 腹泻二联灭活苗。
于猪流行性腹泻危害严重，国内外学者研制出猪流 1.1.2 试验用疫苗 本试验所用的 7 种疫苗均从市
ZY 腹泻二联灭活苗组
011 21 0
SDLD 腹泻三联弱毒苗组 1 1 2 1 0 3
HS 腹泻二联冻干灭活苗组 1 0 3 5 2 5
TB 腹泻二联灭活苗组
123 13 3
对照组
113 22 4
总计
6 9 19 16 9 16
注：攻毒后 8 h 采集 27 头有腹泻症状猪粪便检测，其余均 为全群（共 40 头，每组 5 头）检测。
粪，但未见食欲不振、呕吐、消瘦、脱水等状况；攻毒
后 2 d 达到高峰，随后趋于好转，7 d 已完全正常，至 出栏无 1 头试验猪出现流行性腹泻临床症状和死 亡，具体情况见表 2。
表 1 接种疫苗后试验猪腹泻情况
头
项目
样
首免
二免
本 数 1d 2d 3d 4d 5d 1d 2d 3d 4d 5d
HY 腹泻二联灭活苗组 5 0 0 0 1 2 0 1 0 0 0
HL 腹泻二联灭活苗组 5 0 0 0 1 0 0 3 0 0 0
TB 腹泻特制二联灭活苗组 5 0 0 0 0 2 0 3 0 0 0
ZY 腹泻二联灭活苗组 5 0 0 0 0 3 0 1 1 0 0
SDLD 腹泻三联弱毒苗组 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
HS 腹泻二联冻干灭活苗组 5 0 0 0 2 2 0 2 2 0 0
ZY 腹泻二联灭活苗组 0.057 0.063 0.054 0.051 0.056 0.045 0.054 0.051 0.059
SDLD 腹泻三联弱毒苗组 0.054 0.057 0.053 0.047 0.049 0.048 0.051 0.051 0.046
HS 腹泻二联冻干灭活苗组 0.067 0.055 0.055 0.053 0.048 0.054 0.049 0.055 0.059
原检测结果分析，抗体检测的结果并不具备临床参 考价值，它的准确性有待进一步研究，这也局限了疫 苗免疫效果的整体评价标准。由于 PEDV 适应细胞 培养难度大、制备全病毒抗原存在潜在排散危险，现 有的诊断方法仅限于实验室应用阶段而未能大量应 用于临床实践，因而急需研制一种安全、稳定、快速、 易于制备、特异性和重复性均高的新型诊断试剂以 用于大批次试样的检测[6]。
TB 腹泻特制二联灭活苗组 5 0 4 2 3 2 1 1 1 0 0
ZY 腹泻二联灭活苗组 5 0 3 3 3 0 2 0 0 0 0
SDLD腹泻三联弱毒苗组 5 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0
HS腹泻二联冻干灭活苗组 5 0 4 4 1 1 2 0 1 2 0 TB 腹泻二联灭活苗组 5 0 2 2 2 2 2 0 0 1 0
表 3 试验猪免疫前及攻毒前后流行性腹泻抗体检测结果
项目
首免前 1 d 攻毒前 1 d 攻毒后 7 d
阳性对照
*2.243 *2.312 *2.243 *2.165 *2.220 *2.123
阴性对照
0.057 0.064 0.06 0.068 0.054 0.064
空白对照
0.046
0.058
0.052
TB 腹泻二联灭活苗组 5 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
对照组
5 0 0 0 1 10 11 0 0
总计
0 0 0 5 12 0 11 4 0 0
表 2 攻毒后试验猪腹泻情况
头
项目
样攻
攻毒后
本毒
数 前 8 h 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 14 d
HY腹泻二联灭活苗组 5 0 4 1 5 1 2 1 2 0 0 HL腹泻二联灭活苗组 5 0 3 1 2 3 1 1 0 1 0
且攻毒后 3 d 阳性率最高，达 47.5%，攻毒后 14 d 易导致免疫失败从而无法预防发病。韩国政府建议
阳性率仍高达 40%（表 4）。应用 DNAStar 软件包将 对母猪实行 3 次接种（活苗-死苗-死苗）或 4 次接种
所得基因序列与 GenBank 上发表的基因序列进行 （活苗-活苗-死苗-死苗），以使哺乳仔猪从初乳中获
行性腹泻灭活和弱毒疫苗，应用于猪流行性腹泻的 面购买，分别为 HY 腹泻二联灭活苗、HL 腹泻二联
免疫预防。本试验通过评价国内不同厂家生产的 7 灭活苗、TB 腹泻特制二联灭活苗、ZY 腹泻二联灭活
种腹泻疫苗对猪的免疫保护效果，为免疫防控该病 苗、SDLD 腹泻三联冻干弱毒苗、HS 腹泻二联冻干
提供参考。
灭活苗、TB 腹泻二联灭活苗。二联苗均为猪传染性
胃肠炎-猪流行性腹泻二联苗，三联苗为猪传染性
收稿日期：2013-01-16 基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻 1123007） 作者简介：陈 静（1987-），女，河南开封人，在读硕士研究生，主要 从事动物传染病与分子免疫学研究.E-mail:386795728@qq.com
链霉素研磨，使其终浓度为 1 000 U/mL，加入到 30%甘油生理盐水中，-20 ℃保存备用。 1.1.4 检测试剂 taq DNA 聚合酶为 TaKaRa 公司 产品，dNTP、苯酚、DNA Marker 购自上海生工。本研 究所用引物为猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-猪 轮状病毒三重 PCR 检测引物[2]和 PEDV ORF3 的 2 对检测引物[3]。 1.2 试验方法 1.2.1 试验前准备 试验开始前给猪标耳号、称重， 观察猪只采食量、粪便及精神状况等，做好相关记 录。采用 RT-PCR 方法对猪瘟、猪繁殖与呼吸综合 征、猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒基 因进行检测，确定为阴性。 1.2.2 疫苗接种 对 7 组共 35 头试验猪按使用方 法后海穴注射疫苗 1 mL/头，对照组 5 头不做疫苗 免疫。首免与二免间隔 7 d，观察记录猪只体重、采 食量、排便情况等以及疫苗是否存在不同程度的副 作用、灭活苗是否灭活彻底、对照是否仍然成立等影 响因素。 1.2.3 攻毒 首免后 21 d 对 8 组试验猪进行攻毒， 剂量为 5 mL/头，方法为口服。攻毒后观察记录猪只 采食量、精神状态、排便、发病、死亡等情况。 1.2.4 抗体检测 首免前 1 d、攻毒前 1 d 及攻毒后 7 d，每组随机采集 3 头试验猪血清采用酶联免疫吸 附试验检测猪流行性腹泻抗体水平。样品 OD450 nm 值>2，判为阳性；OD450 nm 值介于 1~2 之间，判为可 疑；OD450 nm 值<1，判为阴性。 1.2.5 病原检测 首免及二免后 1~5 d、攻毒后 8 h 及 1、3、5、7、14 d 采集试验猪粪便检测排毒情况。 具体检测方法：用 10 mmol/L PBS 缓冲液将粪样稀 释 10 倍，在涡旋仪上振荡混匀 20 min 后，12 000 r/ min 离心 10 min，取上清液采用常规方法提取总 RNA，采用三重 PCR 及 PEDV ORF3 巢式 PCR 进行 病原检测，检测到的阳性产物从 1%琼脂糖凝胶中 切下，用上海生工 DNA 胶回收试剂盒纯化回收后， 连接到 pMD18-T 载体中，转化 DH5α 感受态细胞， 由天地扬生物工程（大连）有限公司进行测序，获得
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（PEDV） 1 材料与方法
引起的一种高度接触性急性肠道传染病，常导致病 1.1 试验材料
猪水样腹泻、呕吐、脱水，消化道黏膜发炎、出血及糜 1.1.1 试验猪 本试验于 2012 年 7—12 月在广西
烂。不同年龄、品种和性别的猪都能感染发病，哺乳 农垦永新畜牧集团金光有限公司 XY 猪场进行。随
目的基因序列。 2 结果 2.1 试验猪临床发病情况
从试验开始至结束，免疫组与对照组猪群食
欲、精神状况、体重均无明显变化。首免 3 d 后，个别Βιβλιοθήκη Baidu猪开始表现轻微拉稀症状，二免后 3 d 症状已趋于 好转，具体情况见表 1。
攻毒后 4 h，试验猪开始出现症状，主要表现为 拉稀，小猪屁股周围被粪便污染，猪舍地面散布稀
本试验中，口服的病毒剂量足以导致试验猪出
3 分析与讨论
现腹泻症状，但从攻毒开始至试验结束，采用三重
我国猪群感染猪流行性腹泻相当普遍，截至 PCR 常规检测方法均未检测到 PEDV 阳性猪，采用
对照组
5 0 4 3 5 3 30 0 0 0
总计
0 27 16 21 12 13 3 4 4 0
2.2 试验猪流行性腹泻抗体水平 结果显示，虽然阴阳对照成立，但空白对照和样
本之间无明显差别，包括攻毒组和对照组在内的 72 份检测样本均为阴性（表 3）。此结果与临床症状及 病原检测情况不符，采用该试剂盒检测的结果准确 性有待进一步验证。
HY 腹泻二联灭活苗组 0.053 0.052 0.056 0.061 0.054 0.05 0.051 0.161 0.049
HL 腹泻二联灭活苗组 0.055 0.056 0.059 0.061 0.54 0.049 0.062 0.125 0.052
TB 腹泻特制二联灭活苗组 0.055 0.064 0.055 0.052 0.046 0.045 0.068 0.056 0.052
7 种常用猪流行性腹泻疫苗临床免疫效果观察和评估
陈 静1，刘德清2，张 宁2，蒋振南2，郭 旋1，龙 凤1，刘 磊1，黄伟坚1 （1.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530001；2.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，南宁 530042）
摘 要：鉴于猪流行性腹泻危害严重，且国内常用的疫苗免疫效果不一，本试验随机选取广西金光 国有化猪场 6 周龄猪 40 头，分别免疫常用的 7 种国产腹泻疫苗，并在首免后 21 d 进行攻毒试验。 通过观察猪只的发病情况、监测猪只的抗体水平及排毒情况，对疫苗的免疫效果进行评估，为猪场 筛选合适的疫苗、制定合理的免疫程序提供参考。 关键词：猪流行性腹泻；疫苗；免疫效果；攻毒试验