细胞实验设计

原生质体的分离培养与融合

一、实验目的

1、了解植物原生质体分离、融合基本原理。

2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。

二、实验原理

植物原生质体最方便的来源是叶片，因为叶片中可以分离出大量的比较均一的细胞，而又不致使植物遭到致命的破坏。由于叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易达到细胞壁。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法。

PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。

三、实验用品

材料

植物叶片（菠菜叶片）

仪器

倒置显微镜，离心机，过滤筛（100目），漏斗，烧杯，吸管，长注射针，注射器（5—10ml）三角瓶、离心管、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸。

试剂

纤维素酶2% ，果胶酶1%（在0.65mol甘露醇，0.05M氯化钙和0.1%MES 中，pH调至5.6—6.0），0.16M氯化钙溶液（内含0.1%MES）Ph5.6，22%蔗糖溶液，30%聚乙二醇（PEG）溶液，高pH高钙洗脱液（Ph=9）：

0.1M氯化钙、0.1M梨酶醇、0.5ml/100ml 1molTris，0.24M氯化钙

四、实验过程

（一）原生质体的分离收集

1.取菠菜叶片撕去下表皮，称0.2g,切成小块放到10ml酶液中，在26℃下酶解4—5小时，或含酶量减半过夜，期间轻轻摇动几次。

2．用100目的过滤筛过滤。

3.用与滤液等体积的0.16mol氯化钙溶液冲洗过滤筛，使冲洗液冲入过滤液。

4.滤液用离心机100—300rpm，离心5分钟，弃上清液。

5.沉淀中加入0.16mol氯化钙溶液1—2ml于沉淀，轻摇使之悬浮，用带长针头的注射器自离心管底部轻轻地加入6—8ml 22%蔗糖溶液，使之形成界面。

6.静置待原生质体形成一条带时弃去上、下液及残渣，用吸管收集原生质体。

7.用.0.24Mmol氯化钙溶液洗涤一次，离心吸取上清液。

8.沉淀中加入1—2ml.0.16mol氯化钙溶液悬于沉淀，用血球计

数板计数，使原生质体密度为200000个/ml。

9.取一滴于载玻片上，低倍镜观察原生质体的纯度和完整性，也可用荧光显微镜检查。

(二)原生质体的培养

1 原生质体培养基配方

无机盐：大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度

有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。激素：NAA、IAA、BA与2,4-D

渗透压：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。

原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗

2 原生质体培养方法

1）液体浅层培养

将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。

优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。

缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。

2）液体－固体双层培养

在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。

优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，

如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。

缺点：不易观察细胞的发育过程

3）固体平板培养

即琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30℃融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。

优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。

缺点：操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。

4）琼脂糖珠培养

将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。

这种方法由于改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成。

（三）原生质体融合操作

如下图操作

1.取上述原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置10分钟，使原生质体沉淀在载玻片上。

2.在两滴悬液之间加一滴30%聚乙二醇（PEG）溶液，使3滴溶液相连，室温下（15℃—20℃）。作用5—10分钟，在显微镜下观察原生质体粘连情况。

五、实验记录

两细胞融合现象通常分为五个阶段：①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。六、实验结果

用光学显微镜观察2-3个细胞靠近或融合的过程。（观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五个阶段。①两细胞膜接触，粘连；②细胞膜形成穿孔；③两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一

体；⑤细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。）