细胞内细胞因子染色法07

检测信号
双参数点图
标本制备
标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300 目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标 10 /ml-外周血白细胞计数， 本需PBS PBS稀释 本需PBS稀释 抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检 测。 溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度：26~27ºC，室温避光。 室温避光。
重悬细胞， ℃放置几小时或过夜。 重悬细胞， 4℃放置几小时或过夜 加入荧光标记抗体, ℃避光30分钟 洗涤。 分钟， 加入荧光标记抗体 4℃避光 分钟，洗涤 缓冲液2重悬，流式细胞记数仪检测。 缓冲液 重悬，流式细胞记数仪检测。 重悬 结果分析
需要的缓冲液
1. 1×PBS 1升（洗细胞用） × 升 洗细胞用） 2. PBS +0.1%BSA+NaN3 0.05% 500ml(用于 用于 染色后FACS前) 染色后 前 3. PBS+BSA+NaN3 +0.1%Saponin 250ml(封 封 闭染色后用) 闭染色后用 4. PBS +BSA+NaN3+Saponin+5%milk 40ml
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
激发光源与荧光标记物
前向角散射光信号
Laser
FALS Sensor
侧向角散射光信号
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
FALS Sensor
Freq
F百度文库uorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4)
结果示范
1.56
0.25
8.23
0.26
左图显示在抗原刺激前， 细胞中能产生IFN-γ的细胞占 的细胞占PBMC的 左图显示在抗原刺激前，CD4+和CD4-细胞中能产生 和 细胞中能产生 的细胞占 的 0.25%和1.56% 和 右图显示在抗原刺激后， 细胞中能产生IFN-γ的增加到 的增加到8.23%，提示该 右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生 细胞中能产生 的增加到 ， 抗原能促进CD4-细胞分泌 细胞分泌IFN-γ 抗原能促进 细胞分泌
方法特点
1. 单细胞水平计数 简单、快捷、 2. 简单、快捷、灵敏 3. 实验结果客观
实验过程
取淋巴细胞，刺激剂作用， ℃孵育1小时 取淋巴细胞，刺激剂作用，37℃孵育 小时 加入BFA继续培养 小时，用PBS洗涤。 继续培养5小时 洗涤。 加入 继续培养 小时， 洗涤 4%多聚甲醛室温固定 分钟后，PBS洗涤。 多聚甲醛室温固定8分钟后， 洗涤。 多聚甲醛室温固定 分钟后 洗涤
细胞内细胞因子染色法
中山医学院免疫学教研室
实验原理
细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA， 细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA，使新产生 BFA 细胞因子滞留在细胞内； 细胞因子滞留在细胞内； 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内， 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并 可以检测相应细胞因子； 可以检测相应细胞因子； 流式细胞记数技术可以记数细胞， 流式细胞记数技术可以记数细胞，分析 相应细胞的质和量。 相应细胞的质和量。
流式细胞仪（FLOW CYTOMETER，FCM） ， ）
对于处在流动状态的细胞或生物颗粒进 行多参数的快速的定量和分析的技术。
检测仪器：流 检测仪器 流 式 细 胞 记 数 仪
FCM结构组成部分
液流系统; 液流系统;
–
将细胞引导至检测位点
光学系统; 光学系统;
– 产生并收集光学信号
电子系统; 电子系统;
– 将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分 将光信号转换成电信号,使之数字化,
析。
细胞分选系统。 细胞分选系统。
FLOW CELL(流动室 流动室) 流动室
Injector Tip
鞘液
荧光信号
聚焦的激光光束
荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后 会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定 的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测) 这些光学信号