细胞内细胞因子染色法07
FACS 胞内染色教程文件
流式胞内染色实验方法方案A：两步法胞内（细胞质）蛋白染色。
方案B：一步法胞内蛋白染色（细胞核）。
注意：1、不同细胞因子的刺激条件是不同的，比如：LPS刺激活化单核细胞分泌IL-6的培养时间一般是6个小时，而检测IL-10则需要刺激24小时。
2、结合荧光的流式抗体应在4度，避光储存。
3、使用抗体前请低速离心30秒，使贴壁抗体沉底。
不建议斡旋混匀抗体，可用手指轻弹混匀。
4、除非方案中注明，默认的抗体孵育方法是冰上或4度避光。
5、缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
方案A: 两步法胞内（细胞质）蛋白染色实验材料：12×75mm 圆底检测流式管。
[可选]可固定的活度染料eFluor® 450 (eBioscience Cat. No. 65-0863), eFluor® 660 (eBioscience Cat. No. 65-0864)，eFluor® 780 (eBioscience Cat. No. 65-0865)。
胞内抗原的直标抗体。
IC Fixation Buffer (eBioscience Cat. No. 00-8222)。
Permeabilization Buffer (10X) (eBioscience Cat. No. 00-8333)双蒸水稀释成1×。
Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience Cat. No. 00-4222)（可以自己配置）。
实验流程：1、按照流式样品要求制备单细胞悬液。
2、按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。
缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。
斡旋分散细胞。
3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定细胞。
室温避光孵育20min。
4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
5、300g 室温离心5min,弃上清。
细胞因子染色方案(中)
胞内细胞因子染色1.细胞刺激完成后，移去大部分上清液，加200ulFACS或MACS buffer，轻轻混匀。
设计细胞染色的排放位置并记录，根据设计把细胞转移至染色板里，2000rpm,离心2min，甩去上清，在吸水纸上轻轻拍干，使用的位置不可重复利用(下同)。
2.死细胞染色。
加200ul PBS，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min；重复洗涤1次。
此步骤的目的为洗去培养基中残留的蛋白质。
Dead/Live dye (Violet (BV421 channel), Aqua (BV510 channel), or Zombie Yellow (BV570 channel)用PBS 1:1000稀释，每孔加50 ul，轻轻混匀，避光，室温染色30 min。
然后每孔加200ulFACS buffer，轻轻混匀，2000rpm, 离心2min。
3.表面染色。
A.配制表面染色抗体mix。
根据染色方案计算每个抗体加入量，将抗体按照既定的稀释比例溶于FACS buffer里，每个抗体加过后需标记，防止加错。
使用前吹打混匀。
B.每孔加入50ul抗体mix，轻轻吹打混匀。
避光，人细胞室温染色15min；小鼠细胞4℃染色10min。
C.染色后，洗去未结合的多余抗体。
加入200ul FACS buffer 轻轻吹打，2000rpm, 2min离心，甩去上清。
D.如果使用Biotin偶联的抗体，配制Streptavidin-dye至工作浓度。
每孔50ul,轻轻吹打后，4℃避光染色10min。
染色结束后加FACS buffer 200ul,2000rpm, 2min离心，甩去上清。
4.固定破膜。
（BD）A.每孔加入50ul固定破膜液(BD CytoFix/Perm)，轻轻吹打混匀。
避光固定破膜4℃，20min。
B.配制Perm Wash。
10X浓缩液稀释为1X，即1份浓缩液加9份灭菌水。
C.固定破膜完成后，洗涤2次。
细胞内染色的操作步骤
细胞内染色的操作步骤1.准备试剂：•抗凝全血或待测细胞（每测试1×106个细胞）•荧光标记单克隆抗体•FACS溶血素（FACS Lysing Solution，10×）。
使用时，用去离子水1:9稀释为1× FACS溶血素•FACS破膜剂（FACS Permealilizing Solution，10×）。
使用时，用去离子水1:9稀释为1× FACS破膜剂•洗液：含有0.5% BSA和0.1% NaN3的PBS缓冲液•固定液：含有1%多聚甲醛的PBS缓冲液2.试验用具：•12×75 mm FALCON管•涡旋混匀器•离心机•FACS流式细胞仪3.染色步骤：1)12×75 mm FALCON管顺序编号；2)各管加入适量细胞表面标志的荧光标记单克隆抗体（用量见试剂说明书），做细胞表面标记；3)各管加入50 μL—100 μL抗凝全血或1×106个细胞，充分混匀，室温避光反应15—30分钟；4)加入2 mL 1× FACS溶血素溶解红细胞，充分混匀，室温避光反应10分钟；5)500×g离心5分钟，弃上清；6)加入0.5 mL 1× FACS破膜剂细胞打孔，充分混匀，室温避光反应10分钟；7)加入2—3 mL洗液，充分混匀，500×g离心5分钟，弃上清；8)各管加入适量细胞内标志的荧光标记单克隆抗体（用量见试剂说明书），做细胞胞内分析物的标记；9)胞内抗体与细胞充分混匀，室温避光反应30分钟；10)加入2—3 mL洗液，充分混匀，500×g离心5分钟，弃上清；11)各管加入500 μL固定液重悬细胞；12)上流式细胞仪分析。
上机前，样本可4°C避光保存24小时。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
细胞因子检测方法
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细胞培养和刺激的基本方法
人IFN-γ：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时
人TNF-α：使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激６小时
人IL-2：人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时
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mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
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小结
生物学检测法比较敏感，又可直接测定生物学功能， 是最可靠的方法，适用于各种实验目的，是科研部门 最常用的技术，但需要长期培养依赖性细胞株，检测 耗时长，步骤繁杂，影响因素多，不容易熟练掌握。
免疫学检测法比较简单，迅速，重复性好，但所测定 的只代表相应细胞因子的量而不代表活性，同时敏感 度也低于生物活性检测法（约低10～100倍）。
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免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
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ELISPOT
Enzyme-linked Immunospot Assay
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ELISPOT发展历史
1963年：Jerne等人创立的溶血空斑技术(hemo-lytic plaque forming cell assay ,HPF),这项技术可用于检测并计数单个抗体形成细胞。
快速 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：在同一细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也 可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚群； 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境 更准确反映了体内状况。
医学知识之细胞染色
细胞染色一).瑞特(Wright)染色法：为发观察细胞内部结构，识别各种细胞及其异常变化，血涂片必须嘲行染色。
血涂片的各种染色方法大多是罗氏染色法衍变来的。
目前常用瑞特染色法。
(1)瑞特染料是由酸性染料伊红和碱性染料亚甲蓝组成有复合染料。
亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。
通常为氯盐，即氯化美蓝。
美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。
市售美蓝中部分已被氧化为天青。
伊红通常为钠盐。
即伊红和伊混合后，产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀，即瑞特染料。
(2)细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。
因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质;细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质;中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
(3)PH对细胞染色有影响。
细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红;在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。
因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。
配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。
新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待染料成熟，主要是美蓝逐渐转变为天青B后才能使用，贮存时愈久，染色效果愈好。
EAM GILLILAND等采用吸光度比值作为顼特染液的质量规格。
rA测定方法如下：取瑞特染液15-25μl(视染液浓度而定)，加甲醇10ml稀释，混匀后以甲醇为空折管，分别以波长650nm和25nm比色。
Ra=a6 50/a525.因为美蓝吸收峰小组长为650nm，伊红吸收峰波长为525nm ;天青B吸收峰也为650nm但吸光度A约为美蓝的一半。
细胞内细胞因子染色
细胞内细胞因子染色胞内细胞因子(INF-gamma)染色方法是在单细胞水平分析淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，细胞内细胞因子（干扰素-γ）染色法是用来分析在单细胞水平淋巴细胞的功能。
通过结合表面染色和细胞内细胞因子染色，此法可以获得在一定数量群体中，能够释放细胞因子细胞的百分比，而这些是无法用酶联免疫斑点法检测方法所获得的。
材料和试剂I. 抗体1. PE 鼠单抗IFN-γ (BD Bioscience 554412)2. PE鼠IgG1 κ 同型对照(BD Bioscience 554685)注意: 以上抗体经作者验证可以被其他抗体代替II. 其他材料：1. BD Cytofix/Cytoperm TM Fixation/Permeabilization液体试剂盒，BD GolgiStop TM (BD Bioscience 554715)2. 1X Phosphate Buffered Saline 磷酸缓冲液(PBS)3. FACS staining Buffer: 1X PBS, 2% FBS.4. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (Sigma 79346)5. Ionomycin (Sigma I9657)仪器1. BECKMAN 离心机和转头(BECKMAN)步骤1. 刺激细胞：1) 为刺激细胞使IFN-gamma从T细胞中释放，加入PMA (5ng/ml)和Ionomycin (500ng/ml)用37℃6h来培养和孵育细胞2) 每6ml培养细胞加入4 μl BD GolgiStop TM，充分混匀。
（推荐BD GolgiStop TM在细胞液中的时间不超过12h）2. 收集细胞:1) 1500rpm 离心3 minutes来收集细胞2) 收集细胞用PBS.重悬两次3) PBS含 2%FBS溶液将细胞稀释到. 1x107细胞/mL4) 在96孔板中加入100μl细胞液(1x106)5) 4℃ 800 x g, 3min 将板自旋6) 8)用预冷PBS 洗三次，如地7步自旋3. 细胞表面抗原染色1) 将细胞重选在100 Fc封闭液中（推荐稀释倍数：1:1000 PBS/2% FBS），冰上孵育10min,离心。
免疫学方法测定细胞因子
免疫学方法测定细胞因子免疫学方法是一种用于测定细胞因子含量和活性的重要手段。
细胞因子是一类分泌蛋白质，对于调节和协调免疫反应非常重要。
免疫学方法可以通过测定细胞因子的浓度来评估免疫反应的状态，从而对免疫功能进行分析和研究。
常见的免疫学方法包括酶联免疫吸附实验（ELISA）、流式细胞术和免疫组织化学等。
下面将对这些方法进行详细介绍。
首先是ELISA。
ELISA是一种非常常见的免疫学方法，可以测定细胞因子的浓度。
该方法利用对特异性抗体的相互作用来检测目标物质。
通常情况下，可以使用针对目标细胞因子的特异性抗体来修饰可溶性蛋白或固定在基质上，形成检测物的捕获体。
然后，添加细胞因子样品，通过特异性抗体的结合来测定目标物质的浓度。
最后，可以使用一种辅助检测物质，如酶标记抗体或荧光标记抗体，来标记抗原抗体复合物，从而通过测定检测物质与辅助检测物质之间的相互作用来分析细胞因子的浓度。
其次是流式细胞术。
流式细胞术是一种广泛应用于细胞学研究的技术。
通过使用荧光标记的抗体或荧光标记的细胞因子，可以在单个细胞水平上分析细胞因子的表达和活性。
流式细胞术可以直接测定细胞因子的含量，也可以通过测定细胞因子与特异性抗体的结合来分析细胞因子的活性。
此外，流式细胞术还可以用于分析不同细胞中细胞因子的表达差异。
最后是免疫组织化学。
免疫组织化学是一种病理学研究中常用的方法，可以分析细胞因子在组织和器官中的分布和表达。
免疫组织化学利用特异性抗体与目标分子结合的原理，通过对组织进行染色来分析细胞因子的位置和数量。
该方法可以通过显微镜观察并定量细胞因子的表达情况，从而研究细胞因子在免疫反应中的作用。
总结起来，免疫学方法是一类重要的实验手段，可以用于测定细胞因子的含量和活性。
在免疫学研究中，ELISA、流式细胞术和免疫组织化学是常用的免疫学方法。
这些方法可以提供有关细胞因子在免疫反应中的角色和机制的重要信息，对于了解免疫功能的调节和疾病发生发展具有重要意义。
细胞内因子染色
文章编号:1007-8738(2005)S -0062-03流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展钱 莘综述 施 明,王福生3审阅(解放军第302医院生物治疗研究中心,北京100039)收稿日期:2004-05-07; 修回日期:2004-07-05作者简介:钱 莘(1979-),女,陕西西安人,硕士生.3Corres ponding author,Tel:(010)66933332Email:fs wang@public .bta .net .cn[关键词] 细胞内细胞因子;流式细胞术[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A 细胞因子作为细胞间信号传导的分子,主要介导和调节免疫应答及炎症反应,刺激造血细胞生成和组织损伤的修复等。
正常情况下,细胞因子的表达和分泌受到机体严格地调控。
在病理状态下,细胞因子会出现异常表达。
因此,检测细胞因子对于某些疾病的诊断、治疗具有重要价值。
当前,仅对细胞进行定量及活性检测已不能满足需要,在单细胞水平研究细胞因子的表达更加重要。
随着流式细胞术(fl owcyt ometry,FC M )在临床、科研中的广泛应用,利用FC M 与细胞内细胞因子(intracellular cyt okine,I CK )染色技术相结合,可提供一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法[1]。
本文主要就FC M 检测I CK 的研究进展作一综述。
1 FC M 检测I CK 的基本原理用FC M 检测I CK 是通过体外多克隆激活剂,如佛波酯(phorbol 2122m irystate 2132acetate,P MA )和离子霉素(i onomy 2cin )或特定的抗原激活细胞,同时用莫能霉素(monensin,MN )或布雷菲德菌素A (brefeldin A,BF A )阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运,抑制细胞因子释放到细胞外,从而便可使产生的细胞因子在细胞质内蓄积,信号增强。
细胞化学染色步骤及要求
×100%
细胞化学染色步骤和要求
临床评价： 1、鉴别白血病类型 急单 急粒 急性早幼粒细胞白血病（强阳性，不
被抑制） 急性粒单细胞白血病
细胞化学染色步骤和要求
其他脂酶染色
氯乙酸AS-D奈酚脂酶染色 几乎仅出现在粒细胞、特异性高。
M7 PAS(+)
细胞化学染色步骤和要求
细胞化学染色步骤和要求
细胞化学染色步骤和要求
α-醋酸萘酚酯酶染色
原理 α-醋酸萘酚
PH中性 α-醋酸萘酚酯酶
α-萘酚+重氮盐(坚牢蓝B) (黑色或灰黑色)
细胞化学染色步骤和要求
正常血细胞的染色反应
单核细胞、粒细胞、淋巴细胞（均可+） 单核细胞的阳性可被氟化钠抑制。
显示
偶氮偶联法 联苯胺法 普鲁士蓝反应 雪夫反应 金属沉淀法
细胞化学染色步骤和要求
复染
目的：使各种细胞显示出来便于观察 染核：中性红、甲基绿、苏木精、核
固红、沙黄等 染浆：伊红、刚果红、光绿等
细胞化学染色步骤和要求
四、种类
过氧化物酶染色、苏丹黑染色、 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 过碘酸-雪夫反应 α-醋酸奈酚酯酶染色 酸性磷酸酶染色 铁染色
细胞内铁： 用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞浆
中含有蓝色铁粒的细胞(铁粒幼红细胞)的百分率。 根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和
颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型： I 型：幼红细胞内含铁粒1--2粒； Ⅱ型：幼红细胞内含铁粒3-5粒； Ⅲ型：幼红细胞内含铁粒6—10粒； Ⅳ型：幼红细胞内含铁粒>10粒。
细胞化学染色步骤和要求
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测
细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。
在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。
目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而ELISPOT及单细胞PCR技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。
随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。
下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－ )与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。
近来，Jung与Picker采用了monensin、PMA等药物预孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin 阻断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
因为自然状态下，T淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。
在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。
这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。
在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。
且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。
胞内因子染色 protocol
BD胞内因子染色操作流程本流程适用的固定破膜试剂盒：实验流程：A.刺激细胞：体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。
多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。
此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28 的抗体）注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。
PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。
1.）使用BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤每6ml细胞培养基中加入4μl BD GolgiStop™并充分混匀。
BD GolgiStop™在培养基中不应超过12小时。
2.）使用BD GolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤每1ml细胞培养基中加入1 μl BD GolgiPlug并充分混匀。
BD GolgiPlug在培养基中不应超过12小时。
BD GolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。
B. 样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色1. 细胞培养用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。
细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。
在染色及储存过程中细胞需避光保存。
2. 阻断Fc受体阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。
a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。
在100μl Staining Buffer（货号：554656）中加入1 μg BD Fc Block/10^6细胞，4°C孵育15分钟。
随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer 适当稀释）。
胞内因子染色 protocol
BD胞内因子染色操作流程本流程适用的固定破膜试剂盒：实验流程：A.刺激细胞：体外刺激细胞因子的产生有很多种方法。
多克隆抗体激活剂在诱导细胞因子产生过程中尤为重要。
此类激活剂主要包括以下物质：佛波酯加钙离子载体或离子霉素，植物凝血酶，葡萄球菌肠毒素B，以及直接针对TCR/CD3复合物的单克隆抗体（加或不加针对共刺激受体如CD28 的抗体）注意：已报道单独的PMA刺激会导致小鼠T细胞表面CD4的表达降低。
PMA与钙离子载体共同刺激则使CD4表达降低更多，同时也会导致小鼠CD8胸腺细胞及小鼠和人外周血T淋巴细胞减少。
1.）使用BD GolgiStop™蛋白转运抑制剂（含莫奈霉素）的操作步骤每6ml细胞培养基中加入4μl BD GolgiStop™并充分混匀。
BD GolgiStop™在培养基中不应超过12小时。
2.）使用BD GolgiPlug™（含布雷菲德菌素A）蛋白转运抑制剂（含BSA）的操作步骤每1ml细胞培养基中加入1 μl BD GolgiPlug并充分混匀。
BD GolgiPlug在培养基中不应超过12小时。
BD GolgiPlug™中含有DMSO，4°C时会结晶为固体。
B. 样本处理：细胞表面及胞内因子的多色染色1. 细胞培养用蛋白转运抑制剂体内刺激组织样本或者体外刺激培养基细胞以制备活的细胞群。
细胞分离后重悬于染色培养基中，计数并转移至免疫荧光染色的塑料管或微孔板中。
在染色及储存过程中细胞需避光保存。
2. 阻断Fc受体阻断Fc受体的试剂可降低非特异性免疫荧光染色。
a．小鼠中，用特异性针对FcγII/III受体的2.4G2纯化抗体（BD Fc Block™，货号：553142）封闭荧光抗体Fc受体引起的非特异性染色。
在100μl Staining Buffer（货号：554656）中加入1 μg BD Fc Block/10^6细胞，4°C孵育15分钟。
随后清洗细胞，加入细胞表面抗原的特异性荧光抗体（提前用stain buffer 适当稀释）。
细胞内细胞因子的流式检测讲解
刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和
刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN-γ 则可选择 PMA 和Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的
CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，
4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析。
当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的
免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表减少非特异性的背景染色，保证结
果的准确性
① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在
小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig 或血清。
② 表面结合的细胞因子的阻断 ：使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体，
阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。
荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4时，应选用PE或APC
Monensin Brefeldin-A(BFA) 6、固定剂
固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含4%的多聚甲醛PBS溶液
7、破膜剂
将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含1％皂甙、0.05％NaN2的Hanks溶液/HBBS
标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记
细胞内IL-1β的细胞内染色结果
未使用阻断剂
使用阻断剂
阴影部分代表的是同型对照染色结果； 黑色代表的是未使用破膜剂的染色 结果； 灰色代表的是使用破膜剂的染色结 果。
细胞内细胞因子的检测
细胞内细胞因子的检测细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。
研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。
早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。
尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如Th1(IL-2，IFN-γ)与Th2(IL-4，IL-5，IL-10)，但这些研究很难推广，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还不清楚。
活化的T细胞可分泌多种细胞因子至细胞外，而流式细胞仪仅能检测细胞内的抗原，所以应阻断细胞因子分泌至细胞外，方法为破坏高尔基体，因细胞因子（即各种蛋白）在合成后需经高尔基体的加工和转运，才能到达细胞膜，然后通过高尔基体膜与细胞膜的融合作用将细胞因子分泌至细胞外。
因此破坏高尔基体即可切断细胞因子的转运途径，干扰其分泌。
近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。
这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
胞内细胞因子染色与传统的检测可溶性蛋白的方法如ELISA相比，具有显著优越性。
该法从单个细胞水平检测内多个细胞因子的同时，还可标记各种细胞表面分化抗原以及活化分子、趋化因子受体和黏附分子等，从而区分表达特定细胞因子的细胞亚群及其表型特征。
使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。
早在1986年，Mosmann等应用Th细胞克隆技术和细胞因子产生的不同，发现小鼠CD4细胞是一个不均一的亚群，可分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
后来在人类的CD4细胞群中也发现了Th1和Th2细胞亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应，在抗胞内病原菌感染中发挥重要作用；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10，其主要功能是刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫有关。
细胞内细胞因子染色法07
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4)
检测信号
双参数点图
标本制备
标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300 目过滤) 制成单细胞悬液
标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标 本需PBS稀释
抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检 测。
溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度：26~27ºC，室温避光。
结果示范
1.56
0.25
8.23
0.26
左图显示在抗原刺激前，CD4+和CD4-细胞中能产生IFN-γ的细胞占PBMC的 0.25%和1.56%
右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生IFN-γ的增加到8.23%，提示该 抗原能促进CD4-细胞分泌IFN-γ
– 产生并收集光学信号
电子系统;
– 将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分 析。
细胞分选系统。
FLOW CELL(流动室)
Injector Tip
鞘液
荧光信号 聚焦的激光光束
荧光 并激发后 会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定 的发射波长.
实验原理
细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA，使新产生 细胞因子滞留在细胞内；
破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并 可以检测相应细胞因子；
流式细胞记数技术可以记数细胞，分析 相应细胞的质和量。
方法特点
1. 单细胞水平计数 2. 简单、快捷、灵敏 3. 实验结果客观
实验过程
取淋巴细胞，刺激剂作用，37℃孵育1小时 加入BFA继续培养5小时，用PBS洗涤。 4%多聚甲醛室温固定8分钟后，PBS洗涤。
细胞内细胞因子染色用FITC标记抗马-干扰素单抗的研制及应用
细胞内细胞因子染色用FITC 标记抗马γ-干扰素单抗的研制及应用白宇，张维军，童铁钢，吴东来*(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001)摘要：本研究制备细胞内细胞因子染色用FITC 标记抗马-干扰素单克隆抗体，建立马IFN-γ细胞内细胞因子染色方法，为马传染病的免疫学研究提供新方法。
利用荧光素FITC 对纯化后的抗马IFN-γ单克隆抗体(SB10)进行标记，对马外周血单核细胞进行胞内细胞因子IFN-γ单染色的流式细胞术检测，并且与商品化的FITC 标记抗牛IFN-γ单克隆抗体(CC302)进行对比试验，结果表明FITC 标记的单抗能够有效的对刺激的马外周血单核细胞进行细胞内流式检测。
制备FITC 标记的抗马IFN-γ单克隆抗体为建立马细胞免疫学研究方法奠定物质基础，马IFN-γ胞内染色方法的建立为监测机体免疫状态和研究机体免疫机制提供技术平台。
关键词：马伽玛干扰素；细胞内细胞因子染色；荧光素标记单抗基金项目：国家高科技发展计划(863)项目(2006AA10A203)；黑龙江省自然科学基金重点项目(ZJN-0602-01)作者简介：白宇(1979～)，男，吉林白城人，博士研究生，研究方向为分子免疫学.*通讯作者：E-mail ：dlwu@细胞因子检测在临床上有广泛的用途，如评估机体免疫状态、检测疾病的预后和治疗、病理变化和损伤机理的研究以及辅助诊断等。
目前，检测细胞因子的方法很多，主要有生物活性测定法、免疫学测定法和利用核酸标记技术检测细胞因子mRNA表达等[1]。
随着单克隆抗体技术的发展，流式细胞仪检测技术已经广泛应用在基础和临床实践的各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等领域，对许多学科的发展发挥了重要作用。
由于流式细胞术可以补充ELISA 和ELISPOT 检测的不足，因此在检测细胞因子中得到了广泛的应用。
细胞染色方法总结
Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色.Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！染色步骤PI(PropidiumIodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。
但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。
但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
AnnexinV用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。
JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。
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方法特点
1. 单细胞水平计数 简单、快捷、 2. 简单、快捷、灵敏 3. 实验结果客观
实验过程
取淋巴细胞，刺激剂作用， ℃孵育1小时 取淋巴细胞，刺激剂作用，37℃孵育 小时 加入BFA继续培养 小时，用PBS洗涤。 继续培养5小时 洗涤。 加入 继续培养 小时， 洗涤 4%多聚甲醛室温固定 分钟后，PBS洗涤。 多聚甲醛室温固定8分钟后， 洗涤。 多聚甲醛室温固定 分钟后 洗涤
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
激发光源与荧光标记物
前向角散射光信号
Laser
FALS Sensor
侧向角散射光信号
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4)
检测信号
双参数点图
标本制备
标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300 目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标 10 /ml-外周血白细胞计数， 本需PBS PBS稀释 本需PBS稀释 抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检 测。 溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度：26~27ºC，室温避光。 室温避光。
流式细胞仪（FLOW CYTOMETER，FCM） ， ）
对于处在流动状态的细胞或生物颗粒进 行多参数的快速的定量和分析的技术。
检测仪器：流 检测仪器 流 式 细 胞 记 数 仪
FCM结构组成部分
液流系统; 液流系统;
–
将细胞引导至检测位点
光学系统; 光学系统;
– 产生并收集光学信号
电子系统; 电子系统;
细胞内细胞因子染色法
中山医学院免疫学教研室
实验原理
细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA， 细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA，使新产生 BFA 细胞因子滞留在细胞内； 细胞因子滞留在细胞内； 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内， 破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并 可以检测相应细胞因子； 可以检测相应细胞因子； 流式细胞记数技术可以记数细胞， 流式细胞记数技术可以记数细胞，分析 相应细胞的质和量。 相应细胞的质和量。
– 将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分 将光信号转换成电信号,使之数字化,
析。
细胞分选系统。 细胞分选系统。
FLOW CELL(流动室 流动室) 流动室
Injector Tip
鞘液
荧光信号
聚焦的激光光束
荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后 会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定 的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测) 这些光学信号
结果示范
1.56
0.25
8.23
0.26
左图显示在抗原刺激前， 细胞中能产生IFN-γ的细胞占 的细胞占PBMC的 左图显示在抗原刺激前，CD4+和CD4-细胞中能产生 和 细胞中能产生 的细胞占 的 0.25%和1.56% 和 右图显示在抗原刺激后， 细胞中能产生IFN-γ的增加到 的增加到8.23%，提示该 右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生 细胞中能产生 的增加到 ， 抗原能促进CD4-细胞分泌 细胞分泌IFN-γ 抗原能促进 细胞分泌
重悬细胞， ℃放置几小时或过夜。 重悬细胞， 4℃放置几小时或过夜 加入荧光标记抗体, ℃避光30分钟 洗涤。 分钟， 加入荧光标记抗体 4℃避光 分钟，洗涤 缓冲液2重悬，流式细胞记数仪检测。 缓冲液 重悬，流式细胞记数仪检测。 重悬BS 1升（洗细胞用） × 升 洗细胞用） 2. PBS +0.1%BSA+NaN3 0.05% 500ml(用于 用于 染色后FACS前) 染色后 前 3. PBS+BSA+NaN3 +0.1%Saponin 250ml(封 封 闭染色后用) 闭染色后用 4. PBS +BSA+NaN3+Saponin+5%milk 40ml