人源化抗体的制备策略资料讲解
《生物技术制药》课程笔记
《生物技术制药》课程笔记第一章：绪论一、生物技术的发展史1.1 生物技术概述生物技术是指人们利用微生物、动植物体对物质、能量、信息进行操纵的技术。
它广泛应用于食品、农业、环境保护、能源、医药等领域。
1.2 生物技术的发展简史生物技术的发展可以分为三个阶段：（1）传统生物技术阶段：早在公元前22世纪，中国就开始了酿酒、制酱、制醋等传统生物技术应用。
此后，世界各国也逐渐发展了各自的发酵技术。
（2）现代生物技术阶段：20世纪初，科学家们开始研究酶和微生物，发现了遗传物质DNA和RNA，并逐步揭示了生物体的遗传密码。
这一阶段的代表性成果包括抗生素的发现、遗传工程的创立以及生物制品的生产。
（3）生物技术革命阶段：20世纪70年代末，基因工程技术的发展使生物技术进入了一个新的时代。
基因克隆、基因编辑、基因组学等技术的突破，为生物技术在医药、农业、能源等领域的应用开辟了广阔前景。
二、生物技术药物1.2.1 生物技术药物概述生物技术药物是指利用生物技术方法生产的药物，主要包括蛋白质药物、抗体、疫苗、寡核苷酸药物等。
1.2.2 生物技术药物的特性生物技术药物具有以下特点：（1）高特异性：生物技术药物针对性强，能够精确作用于疾病相关分子。
（2）低毒性：生物技术药物通常来源于自然界中的生物体，毒副作用较低。
（3）复杂性：生物技术药物的结构复杂，生产过程需要严格控制条件。
（4）生产成本高：生物技术药物的生产设备、工艺和原材料成本较高。
三、生物技术制药1.3.1 生物技术制药概述生物技术制药是指利用生物技术方法生产药物的过程。
它主要包括基因工程、细胞培养、蛋白质工程等技术。
1.3.2 生物技术制药特征生物技术制药具有以下特征：（1）生产过程高度自动化、精确化。
（2）药物作用机制明确，针对性强。
（3）生产周期较长，生产成本较高。
（4）药物质量和安全性要求严格。
1.3.3 生物技术在制药中的应用生物技术在制药领域的应用主要包括：（1）生产生物技术药物，如蛋白质药物、抗体、疫苗等。
人源化抗体构建过程中假链的产生及应对策略
·基础研究·人源化抗体构建过程中假链的产生及应对策略葛 彦,陈永井,张学光＊(苏州大学生物技术研究所,江苏苏州215007) 摘要:目的 在人源化抗体构建过程中,采用方便、快捷的分子克隆手段,消除SP2/0内源性畸形轻链转录本以获得正确的轻链cDNA。
方法 在mRNA抽提时,不用常规的T RIZO L法抽提总RNA,而采用经腹腔培养,生长状态良好的杂交瘤细胞,用Q IAGEN公司O ligo tex Direct mRNA Purification Kit,将poly A+的mRN A富集。
可有效减少畸变转录本的含量,提高功能型mRNA的丰度。
利用polyA+RN A,采用RT-PCR,我们成功地克隆到了轻链可变区序列,序列分析证实读码框完全正确,属于轻链可变区基因。
结果 NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征,具有正确的CDR和F R功能区及VJ连接区。
结论 采用poly A+mRNA富集技术,成功克隆获得阻断型抗人CD154mA b(4F1)单克隆抗体的轻链、重链可变区基因,成功地消除了SP2/0内源性畸形转录本对免疫球蛋白功能性轻链基因的影响。
关键词:畸形转录;假基因;杂交瘤中图分类号:R392.1 文献标识码:A 文章编号:1673-0399(2006)06-0911-04A Simple and Rapid Protocol for Cloning of the Functional VKappa Chain from Aberrant-chain-positive Murine HybridomasGE Y an,CHEN Yong-jing,ZH ANG X ue-guang＊(Medical Biotechnology Research Institute of Suzhou University,Jiangsu Suzhou215007,China)Abstract:Objective To eliminate endogenous aberrant kappa chain transcripts from sp2/0-de-rived hybridoma cells by a simple and rapid cloning strategy.Methods In order to eliminate the un-functional V kappa transcripts which m ay hinder o r prevent the amplification of correct V kappa chain,Oligotex Direct mRNA Purification sy stem w as employed to covalently bind polyA+mRNA w ith higher capacity and accuracy to reduce the endogenous abVk contamination.Results The result of NCBI gene data bank evidenced that the cDNA w e got by Oligotex Direct mRNA Purification kit w as correct with typical CDRs and FRs domain and functional VJ recombination site.Conclusion This protocol describes the application of a reverse transcriptase PCR strategy to allow the cloning and sequencing of the functional kappa light chain cDNAs from murine hybridomas co-expressing aberrant endogenous kappa chain m RNAs.Key words:unfunctional transcripts;aberrant chain;hy bridoma 人源化抗体开辟了抗体治疗临床应用的新时代。
生物制药--人源化单克隆抗体
局限性
1.在噬菌体展示过程中涉及细菌转化、噬菌体包装、展示 跨膜分泌，这就大大限制了所建库的容量噬菌体中获得很好的表达，因为 有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合， 导致在体内系统依赖于细胞内基因的表达，所以一 些对细胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很难得到有效表 达和展示。
2002年，的世界首个药物——阿达木单抗上市。人源 化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长， 更有利于治疗。
人源化程度
1.嵌合抗体（Chimeric antibody)
用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由鼠的 可变区和人的恒定区组成的嵌合抗体。 缺点 由于嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体的30%，鼠源 性抗体V区中的框架区（FR)仍残留一定的免疫原性，可 诱导HAMA反应。 解决方案
4.全人单克隆抗体（Fully humaneantibody)
4.1.抗体库筛选技术
4.1.1.噬菌体表面展示技术
它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转 染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单 克隆噬菌体抗体。 在HIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特 的优越性。
鼠源抗体
4.1.2.核糖体展示技术 基本原理和程序
人免疫细胞基因组 体外转录、翻译、偶联 mRNA-核糖体-蛋白质三聚体 构建
基因型和表型联系
RT- PCR核糖体展示的蛋白利用抗原-抗体特异性 筛选所需抗体复合体 EDTA解离 获得特异m亲和力的抗体
Thanks!
单克隆抗体的发展史
第一代：鼠源性单抗 药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。 不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克 隆抗体药物中使用。 第二代：人鼠嵌合性单抗 进行人源化改造，使其人源化程度达到70%左右。 第三代：CDR移植抗体和SDR移植抗体 人源化程度达到95%左右，大大降低了毒副作用。 第四代：全人源化单抗
人源化单克隆抗体研究进展
人源化单克隆抗体研究进展人源化单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的生物药物，通过杂交瘤技术将鼠源单克隆抗体的可变区与人类抗体的恒定区进行交换，以减少免疫原性，提高治疗效果。
近年来，随着科技的不断进步，人源化单克隆抗体研究取得了显著的进展，为肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等治疗领域提供了新的思路和方法。
研究现状：人源化单克隆抗体方法、成果与不足人源化单克隆抗体研究主要包括抗体库的建立、抗体筛选和优化、以及抗体生产等多个环节。
目前，研究人员已成功建立了多种人源化单克隆抗体，并应用于临床试验，取得了一定的疗效。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物能够特异性地识别肿瘤细胞，并通过激活免疫反应来杀死肿瘤细胞。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
研究方法：人源化单克隆抗体研究实验设计与数据分析人源化单克隆抗体研究的实验设计主要包括建立人源化抗体库、筛选和优化抗体，以及进行药效和毒理试验等。
在实验过程中，需要采集和处理大量的实验数据，并进行深入的统计分析和比对，以获得抗体的最佳配对组合和最佳治疗剂量等参数。
成果和不足：人源化单克隆抗体研究的成果与不足人源化单克隆抗体研究在肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等多个治疗领域取得了显著的成果。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物已经成功应用于临床试验，并显示出较好的疗效和安全性。
在自身免疫性疾病和神经系统疾病治疗领域的人源化单克隆抗体药物也在研发和试验阶段。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
同时，抗体药物的生产成本较高，限制了其在临床上的广泛应用。
尽管人源化单克隆抗体研究取得了一定的成果，但仍存在许多问题需要进一步解决。
未来，研究人员需要进一步探索人源化单克隆抗体的作用机制和优化方法，以获得更高效、安全、低成本的药物。
同时，需要加强抗体药物的工艺研究，提高生产效率和降低生产成本。
人源化单克隆抗体的构建技术
人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。
其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。
抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。
本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。
关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。
单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。
然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。
因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。
随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。
人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。
【精】人源化抗体的制备策略
目录
一、 嵌合抗体 二、CDR 移植的人源化抗体
三、完全人源化抗体
1. 抗体库技术 2. 转基因小鼠技术
一、 嵌合抗体
应用 DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重 组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物, 选用适当 的抗生素或制剂进行筛选, 再用与传统技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的 细胞株。
库获得的抗体亲和力不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不足以涵盖一些动物的抗体多样 性等。 因此, 大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键。
2 转ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ因小鼠技术
通过基因敲除技术使小鼠自身的基因失活并导入新基因, 创造出携带人体抗体重、轻链基因 簇 ,而 自 身 抗 体 基 因 失 活 的 转 基 因 小 鼠 。 这 种 转 人 抗 体 基 因 小 鼠( human antibody mouse, HuMab) 所携带的人 DNA 片段具 有 完备的功能, 可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟。
二、 CDR 移植的人源化抗体
鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化 抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。 为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即 除 了 3 个 CDR 是 鼠 源 的 外 , 其 余 全部是人源结构, 又称 CDR 移植抗体( CDR- grafted antibody) 或改型抗体 ( reshaped antibody) 。
应通用过基DN因A敲重除组技技术术使将小小鼠鼠自抗身体的基基因因上失的活可并变导区入与新人基抗因体,基创因造的出恒携定带区人重体组抗,体再重将、重轻组链后基的因基簇因导,而入自骨身髓瘤抗细体胞基中因表达失。活 的 转 基 因 小 鼠 。 因由此于,它大发容生量于抗体体外库, 是因获此得不高依亲赖和体力内抗体原和识针别对和稀提有呈抗系原统抗, 在体理的论关上键可。以产生抗任何物质的抗体。
浅论人源化抗体的制备技术
江苏教 育学 院学报 （ 自然科 学）
Ｊｕ ｏ ｍ￣ｏ ａ ｇｕＩｓｔｔ ｏ ｄ ｃｔ ｎ（ ａ ｒｌ ｃｅｃｓ ｆ ｉ ｓ ｎｔｕｅ ｆ ｕａｉ Ｎ ｔ ａ Ｓｉｎｅ ） Ｊｎ ｉ Ｅ ｏ ｕ
Ａｐ ． ２ ０ ｒ ， ０１
Ｖ Ｉ ２ Ｎｏ ４ ｏ ．６ ．
体药物 的未来奠定 了坚实的基础． 中， 其 大容量噬 茵体抗体库技术的不断改进使得 快速 高通量 的不 经免疫即可获得各
种特异性抗体成为可能 ， 为抗体药物的重新兴起 带来 了新 的希望． ［ 关键词 ］ 抗体 ； 人源化抗 体 ； 噬茵体抗体库； 大容量抗体库
［ 中图分类号 ］ Ｒ ４ ９５
抗体 ， 鼠 Ｍｃ ｂ进 行人 源 化 ， 括恒 定 区人 源 化 的 对 Ａ 包
从 人外 周血 、 脾或 骨髓淋 巴细 胞 提取 总 Ｒ Ａ， 用逆 Ｎ 利 转 录． 聚酶链反 应 （ ＴＰ Ｒ） 法扩 增 抗 体 的全 套 多 Ｒ ．Ｃ 方 可 变 区基 因 ， 随机组 合 后转 染 大肠 杆菌 ， 过 噬菌 经 通 体表 面展 示 技 术 ， 把抗 体 Ｆｂ段 或 单链 抗 体 表 达 在 ａ 噬 菌体表 面 ， 建 人 源 抗 体库 Ｊ ’噬 菌体 抗 体 可 构 （ ． 以将 基 因型 和表 型统 一 于 一体 ， 有 强 大 的筛 选 能 具 力， 因为 能将 选 择 能力 和扩 增 能力 偶联 起 来 ， 故能 够 在体外 模 拟体 内 的抗 体 生 成 过 程 ． 免疫 系 统 内 的 在
一
人 源 化抗 体 的制 备 技 术 有 一 个 漫 长 的 发 展 过
、
一Leabharlann 二 、 体 制 备 的历 史 抗［ 收稿 日期］２ ０ ０ ９—１ ２ ２— １
人源化单克隆抗体制备工艺
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上 进行改进建立了核糖体展示技术。
基本ne,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金 矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体 药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销 售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发 有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治 疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症 患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日 等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药 物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据 来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。
抗体的人源化
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五、单域抗体和分子识别单位
（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区组成的，只有 抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特 异结合能力也强。
（2）分子识别单位（MRU）:是由单个CDR区构成的 小分子抗体，亲和力较低。
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多功能抗体及其制备
一、双功能抗体
二、多功能抗体 三、抗体融合蛋白
抗体的人源化
基因工程抗体
基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为 平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对 人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从 而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因 此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备 抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
6
Ig分子的结构模式图
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原理： 抗体同抗原结合的功能：决定于抗体分子的可变区 （V） 同种性免疫源性：决定于抗体分子的稳定区（C）。
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一、人—鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
在基因水平上将鼠源单 克隆抗体可变区和人抗 体恒定区连接起来并在 合适的宿主细胞中表达， 这种抗体称为人－鼠嵌 合抗体
Fv
ScFvPage Fra bibliotek1515
三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
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（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
抗体的人源化
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抗体导向酶-前药疗法 为了解决对恶性肿瘤化疗特异性差易对正常组织造 成破坏的问题而提出。 选用单抗导向原理，与前药专一性活化酶交联并选 择性地结合于肿瘤部位，使前药可区域特异性地在 肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，有效增加肿瘤 部位浓度降低正常组织中浓度。
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抗体治疗药物
目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的 应用阶段 障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达 到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应
一，放射性同位素标记的抗体治疗药物
二，抗癌药物偶联的抗体药物
三，毒素偶联的抗体药物
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抗体诊断试剂
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一、血清学鉴定用的抗体试剂
血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型， 主要用于疾病病原菌诊断和血型鉴定。包括： 鉴定病原菌的抗体试剂 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)的反向被动血 凝诊断试剂 妊娠诊断试剂
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一、放射性同位素标记的抗体治疗药物
优点：操作简便，用量少，能观察到药物在体内的 分布和药物动力学。放射性同位素标记抗体杀伤范 围较大，相对分子质量又小，更容易穿透到达肿瘤 部位。
缺点：有些同位素来源困难，需放射线保护和污物 处理。
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二、抗癌药物偶联的抗体药物
常用的抗癌药物：氨甲喋呤（methotrexate, MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM) 丝裂霉素 (mitomycin, MMC)、环磷酰胺 (cyclophosphamide, CTX) 、新抑癌蛋白 (neocarzinostatin, NCS) 、正定霉素 (doxorubicin, DOX)等。
人源化单抗
穿上披风 我们开溜！
❖ 诱发人抗小鼠反应、降低抗体效果甚至造成 人体损伤、半衰期较短、较快被清除而影响 疗效、在人体中常不能有效激活补体和Fc受 体相关的效应系统。
❖ 它不禁具有较长的半衰期，低免疫原性，还 能与天然效应因子相互作用，
人源化抗体的构建相关技术
❖ 嵌合体制备技术 ❖ 噬菌体表面展示技术 ❖ 核糖体展示技术 ❖ 转基因技术
转基因技术
❖ 全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫 方法获得。 产生一免疫反应的基因工程敲 除鼠，然后用杂交瘤技术使小鼠的脾细胞 或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。通过灭活 内源 性的小鼠抗体基因，然后引进人源抗 体基因片段，当对人源抗体免疫的时候就 可以在小 鼠体内产生全人抗体分子。
❖ 另一种方法是将人抗体基因微位点转入小鼠 体内细胞，转染 色体小鼠的免疫抗原基因环 境和人类非常相似。 还有一种不同的方法是 向免疫供体或混 合性严重免疫缺陷的小鼠注 入人源淋巴细胞， 通过抗原免疫使小鼠脾细 胞融合骨髓瘤细 胞
子的表达。因而更多的是用来高效表达Fv、 Fab及ScFv等功能片段。
2 酵母表达体系
主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、 甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母表达系统 使用最广泛。巴斯德毕赤酵母系统作为甲醇酵 母系统之一，使用得最多，也最广泛。
3 昆虫杆状病毒表达系统
昆虫杆状病毒表达系统是一种优良的真核基 因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广，比 较经济，而且具有正确完成蛋白质翻译后加 工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应 于外源基因的表达。
我国人源化抗体药物
上海中信国健药业有限公司历时5年，自主 研发的抗体类新药“注射用重组人Ⅱ型肿瘤 坏死因子受体－抗体融合蛋白”（商品名为 “益赛普”），获得国家食品药品监督管理 局颁发的《药品ＧＭＰ证书》，成功上市。
详细介绍抗体的生产制备
添加 标题
抗体的人工进化技术的流程：抗体的人工进化技术包括抗体基因的突变、重组、表达、筛选和选择等步骤。 通过这些步骤可以获得具有更高亲和力、更低免疫原性、更稳定等特性的抗体。
添加 标题
抗体的人工进化技术的应用：抗体的人工进化技术广泛应用于药物研发、生物治疗、诊断试剂等领域。通过 该技术可以获得针对特定疾病靶点的抗体用于治疗和诊断疾病。
随着肿瘤免疫疗 法、自身免疫性 疾病等领域的快 速发展抗体药物 的需求量将进一 步增加。
抗体药物的研发 和生产技术不断 创新为抗体药物 的产业化发展提 供了有力支持。
抗体药物的国际 市场竞争激烈国 内企业也在逐步 崛起未来发展前 景广阔。
抗体药物的生产工艺和质量控制
抗体药物的细胞 培养技术：介绍 细胞培养的基本 原理、培养基的 选择与优化、细 胞培养的过程控 制等方面的知识。抗体药物的来自发和注册审批流程添加 标题
抗体药物的研发：从靶点发现到临床试验阶段需要经过大量的实验和验证以确保药物的安全性和有效性。
添加 标题
注册审批流程：新药在进入市场前需要经过国家药品监管部门的注册审批。这一过程需要提供大量的数据和 资料包括药效、安全性、生产质量等方面的信息。
添加 标题
抗体药物的产业化：随着技术的不断发展抗体药物的生产已经实现了产业化。产业化可以大大提高生产效率 和降低成本使更多的患者能够受益于抗体药物的治疗。
02 抗体的生产过程
抗体的来源和制备方法
抗体的来源：动物免疫血清、单克隆抗体 制备方法：杂交瘤技术、基因工程、噬菌体展示技术等
免疫原的制备和免疫动物的接种
免疫原的制备：将抗原物质与佐剂混合形成免疫原以增强免疫反应。 免疫动物的接种：将免疫原注射到动物体内刺激动物产生特异性抗体。 接种途径：可采用皮下、皮内、肌肉注射等多种途径进行免疫接种。 接种剂量：根据动物种类、免疫原性质等因素确定适当的接种剂量。
人源化单克隆抗体的制备方法
人源化单克隆抗体的制备方法人源化单克隆抗体的制备方法1. 引言人源化单克隆抗体作为一种重要的生物药物，在医学诊断和治疗上发挥着重要的作用。
它们能够通过特异性结合目标物质，如病毒、癌细胞等，以识别、中和或破坏它们，具有广泛的应用前景。
人源化单克隆抗体通过将小鼠源的初始抗体进行改造和人源化，弥补了小鼠抗体在人体内产生反应的缺陷，进而提高了其临床应用的安全性和有效性。
2. 人源化单克隆抗体的制备方法2.1 选择目标抗原在制备人源化单克隆抗体之前，首先需要明确目标抗原。
这是指研究人员要制备对特定疾病或病原体具有高度特异性的抗体。
目标抗原的选择对于后续的实验设计和结果分析至关重要。
2.2 制备小鼠源的初始抗体为了制备人源化单克隆抗体，通常需要使用小鼠或其他动物作为初步制备抗体的源头。
研究人员通过免疫注射小鼠来激发其免疫系统产生特定抗原的抗体。
之后，从小鼠体内提取抗体进行初步鉴定和筛选。
2.3 克隆筛选通过克隆和筛选的过程，选择那些对目标抗原具有高度特异性的抗体克隆。
这一步骤的目的是从小鼠源的初始抗体中挑选出性能最佳的抗体克隆，为后续的人源化操作打下基础。
2.4 人源化改造人源化改造是将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体。
在这一步骤中，研究人员会通过基因工程技术将小鼠源抗体的大部分小鼠特异性区域替换为人源的同源区域，以减少人体对外源蛋白的免疫反应。
这可以通过重组DNA技术，将人源抗体的DNA序列嵌入到小鼠源抗体的DNA序列中，使其具有人源性。
2.5 生产和纯化经过人源化改造的抗体需要进行大规模的生产和纯化。
这通常通过基因工程的方法，在合适的细胞系中表达和生产抗体。
随后，使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析等，将抗体从混合物中纯化出来，以获得高纯度的人源化单克隆抗体。
3. 个人观点和理解人源化单克隆抗体的制备方法是一项复杂的过程，其中涉及到多个关键步骤和技术。
通过人源化改造，可以将小鼠源的初始抗体转化为具有人源特性的抗体，从而提高其在人体内的安全性和有效性。
人源化抗体的制备
通过细胞实验和动物实验，验证了人源化抗体能够特异性地识别并结合目标抗原，从而发 挥相应的生物学功能。
探讨了人源化抗体的应用前景
人源化抗体在疾病治疗、诊断和预防等领域具有广泛的应用前景，如肿瘤免疫治疗、自身 免疫性疾病治疗、抗感染治疗等。
对未来研究的建议
深入研究人源化抗体的作用机制
稳定性与安全性评价
稳定性评价
在不同温度、pH值及缓冲液条件下，测定抗体的稳定性及半衰期，以评估抗 体的储存及应用稳定性。
安全性评价
通过体内外毒性试验、免疫原性试验等，评估抗体的安全性及潜在毒性。
数据统计与分析方法
数据统计
采用描述性统计方法，对实验数据进行整理、归纳和可视化展示，如平均数、标 准差、箱线图等。
抗体。
B
C
D
体外重组技术
利用体外重组技术将抗体基因片段进行拼 接、优化和表达，制备出具有特定功能的 人源化抗体。
B细胞永生化技术
从人类B细胞中提取抗体基因，将其转入 永生化细胞系中表达，获得人源化抗体。
02 人源化抗体的基本原理
抗体结构与功能
抗体的基本结构
抗体是由两条重链和两条轻链组成的 Y字形蛋白质，具有识别和结合抗原 的能力。
完全人源化抗体阶段
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利用噬菌体展示技术、转基因小鼠等技术制备出完全人源化抗
体，实现了抗体的全人源化。
制备技术概述
转基因小鼠技术
通过基因工程手段将人类抗体基因转入小 鼠基因组中，使小鼠能够产生人源化抗体。
A 噬菌体展示技术
将抗体基因片段插入噬菌体外壳蛋 白基因中，使抗体片段展示在噬菌 体表面，通过筛选获得高亲和力的
人源化抗体的制备
人源化抗体：构建的核心原则与策略
人源化抗体：构建的核心原则与策略第一代人源化抗体是通过将鼠源McAb的可变区与人抗体的恒定区相结合，形成了一种嵌合抗体。
尽管这两部分在空间结构上相对独立，使得其独特的抗原亲和力得以保持，但由于嵌合抗体中仍然包含鼠源McAb的可变区，因此在应用时仍可能引发强烈的HAMA反应。
为了克服这一问题，科学家们进一步进行了改进，将鼠源McAb可变区中的相对保守的骨架区（Framework region,FR）替换为人的FR，而仅保留抗原结合部位的互补决定区（Complementarity-Determining region,CDR）。
这种改进使得抗体真正实现了人源化。
然而，FR作为抗体的脚手架，不仅为CDR提供了空间构象环境，有时还参与抗体结合位点正确构象的形成，甚至与抗原的结合。
因此，简单的CDR移植往往会导致原抗体亲和力的丧失或降低。
为了解决这一问题，目前科学家们已经探索出了四种策略，旨在优化FR和CDR之间的相互作用，以恢复或提高人源化抗体的亲和力。
这些策略的实施将有助于进一步提升抗体人源化的效果，为医学研究和治疗提供更多的可能性。
人源化抗体构建原则与策略1.模板替换在使用与鼠对应部分有较大同源性的人抗体FR替换鼠FR时，通常有两种途径可供选择。
第一种途径是采用同一个（或少数几个）具有已知晶体结构数据的人源抗体可变区框架（如VH中的NEW、KOL，VL中的REI等）作为基本模板，通过序列比较与分子模建，确定人、鼠间存在种源差异的氨基酸残基，特别是与鼠CDR密切作用的氨基酸残基，在替换过程中予以保留。
为了确保CDR的空间构象得以维持，需要特别关注原来抗体CDR下方的堆积残基以及周围的残基。
这种方法的优势在于，已知的人源FR晶体结构为残基替换提供了明确的信息。
然而，其不足之处在于可能难以保持鼠CDR的天然构象，从而可能导致抗体亲和力的降低或丧失。
第二条途径是在已有的抗体序列库中搜索与鼠McAb FR具有最大同源性的人源FR进行替换。
人源化单抗
6 转基因动物表达系统
利用转基因动物制药具有生产成本低、 利用转基因动物制药具有生产成本低、投资周 期短、表达量高、与天然产物完全一致、 期短、表达量高、与天然产物完全一致、分离 纯化容易的优势，尤其适合于一些使用量大、 纯化容易的优势，尤其适合于一些使用量大、 结构复杂的血液因子，如人血红蛋白、 结构复杂的血液因子，如人血红蛋白、人血清 白蛋白、蛋白C、纤维蛋白原和抗体等。 白蛋白、蛋白 、纤维蛋白原和抗体等。
昆虫杆状病毒表达系统是一种优良的真核基 因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广， 因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广，比 较经济， 较经济，而且具有正确完成蛋白质翻译后加 工和糖基化修饰等诸多优越性， 工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应 于外源基因的表达。 于外源基因的表达。 但该系统也存在不足之处， 但该系统也存在不足之处，即病毒感染会引 起细胞的死亡， 起细胞的死亡，因此大批量生产有一定的困 难。
人源化抗体简介
目录
一、人源化抗体的发展历程 二、人源化抗体的定义及分类 三、人源化抗体的优点 四、人源化抗体的表达体系 五、人源化抗体的临床应用 六、人源化抗体展望
一、人源化抗体发展历程
世纪70年代英国学者 从20世纪 年代英国学者 世纪 年代英国学者Milstein和德国学者 和德国学者 Kohle利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆 利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆 抗体以来，单克隆抗体在医学、生物学、 抗体以来，单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等 诸多学科中发黑了巨大的作用。 诸多学科中发黑了巨大的作用。单克隆抗体可用于 分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的机构关 系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于 还可用于分离、纯化特定分子抗原， 临床疾病的诊断和治疗等。 临床疾病的诊断和治疗等。 1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗 等首次构建了抗体基因库， 年 等首次构建了抗体基因库 体研究从细胞水平进入到分子水平， 体研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第三 代抗体-基因工程抗体技术的发展 基因工程抗体技术的发展。 代抗体 基因工程抗体技术的发展。
人源化抗体和全人源化抗体
鼠源单抗人-鼠嵌合单抗人源化单抗完全人源化单抗1.“不务正业”的化学诺奖又颁给了生物学，2018年10月3日，诺贝尔化学奖授予了格雷格•温特(GregoryP．Winter)等3位科学家，以表彰他们在酶的定向进化，肽类和噬菌体展示技术等方面的成绩。
噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
请根据材料回答下列问题：（1）噬菌体的遗传物质是________，如噬菌体外壳蛋白展示胰岛素蛋白原，构建基因表达载体时，胰岛素基因前还要插入________。
（2）将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因中，需要用到的工具酶有________。
噬菌体外壳蛋白结构基因用EcoRⅠ切割后产生的片段如图：图示末端为________，为使外源蛋白DNA序列能与其相连，外源蛋白DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种酶切割，该酶必须具有的特点是________。
（3）从物质基础来看，不同生物之间能够进行基因重组，原因是________。
（4）雷格•温特发明了“拟人化”和全拟人化的噬菌体展示技术，并开发了制造人源化抗体以及在细菌中重组表达人源抗体的技术，这一技术解决了单克隆抗体传统的制备过程中需要将________和________相融合的需求。
单克隆抗体常应用于分子靶向治疗，其特点是________。
2.噬菌体抗体库技术是指将人的全部抗体基因插入噬菌体的基因组中，然后让该噬菌体感染大肠杆菌，最终使抗体以复合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成含有人的全套抗体的噬菌体抗体库。
回答下列问题：（1）获得人抗体基因的途径之一是从________细胞中提取mRNA，逆转录成cDNA，再通过PCR技术扩增出抗体基因。
扩增抗体基因的前提是________，扩增过程中需使用的酶是________。
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二、 CDR 移植的人源化抗体
鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化 抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。 为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即 除 了 3 个 CDR 是 鼠 源 的 外 , 其 余 全部是人源结构, 又称 CDR 移植抗体( CDR- grafted antibody) 或改型抗体 ( reshaped antibody) 。
谢 谢 T
H A N K
Y O U
人源化抗体的制备策略有哪些
目录
一、 嵌合抗体 2. 转基因小鼠技术
一、 嵌合抗体
应用 DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重 组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物, 选用适当 的抗生素或制剂进行筛选, 再用与传统技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的 细胞株。
转基因小鼠制备的人抗体, 其功效优于其他技术生产的抗正常人体蛋白单抗。 小鼠识别抗 原和动员抗原的抗体系统仍保持完整, 容易把人体蛋白识别为异物。 此外, 由于抗体是体内 产生的, 经历了正常装配和成熟过程, 从而保证成品具有较高的靶结合亲和力。 但转基因小 鼠也存在一些缺陷, 即转基因通常有体细胞突变和其他独特的序列, 导致不完整的人序列; 而 且, 由 于抗体是在小鼠体内装配, 因而产生的单抗具有鼠糖基化的模式,所以这些单抗最终并 不是全人源化的。
2 转基因小鼠技术
通过基因敲除技术使小鼠自身的基因失活并导入新基因, 创造出携带人体抗体重、轻链基因 簇 ,而 自 身 抗 体 基 因 失 活 的 转 基 因 小 鼠 。 这 种 转 人 抗 体 基 因 小 鼠( human antibody mouse, HuMab) 所携带的人 DNA 片段具 有 完备的功能, 可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟。
三、 完全人源化抗体
1. 抗体库技术 噬菌体抗体库技术的产生依赖于 3 项实验技术的发展: 一是 PCR 技术的发展使人们可以用一组引物 ( 免疫 球蛋白可变区中骨架部分的保守序列) , 通过 RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA 克隆出全套免疫球蛋白可变 区基因, 从而使抗体库的构建简单易行; 二是噬菌体展示技术( 即将抗体通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在 噬菌体的表面, 进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体) 的建立, 实现了基因型和表型的统一, 提供 了 高效率的筛选系统, 这是噬菌体抗体库技术的核心; 三是从大肠杆菌分泌表达有结合功能的免疫球蛋白 分子片段。