液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的16种激素

化妆品中激素的检测方法主要有高效液相色谱法”。Ｊ、薄层层析法”Ｊ、分光光度法”Ｊ、气相色谱．质 谱联用法”…、液相色谱一质谱联用法”“等。以往文献报道多为单独对化妆品中的部分糖皮质激素”ｏ或 部分性激素（雌激素、雄激素、孕激素等）…进行检测。本研究建立了同时测定化妆品中糖皮质激素、雌 激素、雄激素、孕激素等各类共１６种化妆品禁用激素物质的液相色谱－申联质谱分析方法，实现了对各 类激素、多组分的同时快速检测。方法准确、简便、快速，能够为化妆品的检验工作和产品质量控制提供 科学依据和技术支持。
国舢公司）；ＫＱ枷Ｂ型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Ｎ一１０００型旋转蒸发仪（日本Ｅｙｅｌａ
公司），配有Ｂｃ．５５型真空冷却系统（日本ＹⅢａｔｏ公司）｝乙腈、甲醇为色谱纯（美国Ｆｉｓｈｅｒ公司）；无水 乙醇、乙酸、氨水为分析纯（北京化工厂），实验用水为经Ｍｉｌｌｉ．Ｑ净化系统（ｏ．２２¨ｍ过滤膜）过滤的去 离子水；氮气、氩气（＞９９．９９９％）。
２实验部分
２．１仪器与试剂 Ａｌｌｉ¨ｃｅ ２６９５高效液相色谱仪、ＱＬｌａｌｔｒ０Ⅱｌｉｃｍ Ａｎ三重四级杆质谱仪（美国ｗａｔ∞公司）；Ｍｍｉ—Ｑ超
纯水器（美国Ｍｉｍｐｏｒｅ公司）；ＣＲ ２ｌＧ型高速冷冻离心机（日本Ｈｉ眦ｈｉ公司）；１２通道半自动同相萃取 装置（美围ｓｕｐｅｌｃｏ公司）；ｏａｓｉｓＨＬＢ固相萃取柱，６０“ｇ（美国ｗａｔ∞公司）；ＡｃｍｄｉｓｃＧＨＰ双性滤膜（美
较了ｃｌｓ ｓＰＥ柱与０鹅ｉｓ ＨＬＢ ｓＰＥ柱的净化效果。结果表明，Ｏ∞ｉｓ ＨＬＢ ｓＰＥ柱的净化效果和回收率更好。 ３．１．３固相萃取淋洗液和洗脱液的选择考察了不同配比的甲醇水溶液淋洗系统（１０％、２０％、３０％、 ４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及１００％甲醇水溶液，用量均为４ ｎｌＬ），对比不同淋洗系统的淋洗效
第３５卷’ ２００７年９月
分析化学（ＦＥＮⅪＨｕＡｘｕＥ） 研究报告 ＣｌＩｉｍ孵Ｊ０ｕｍａｌ ０ｆ Ａｎａｌ州ｃａｌ ｃｈ舢ｉｇⅡｙ
第９期
１２Ｓ７～１２６２
液相色谱．串联质谱法同时测定化妆品中的１６种激素
王超马强’ 王星 武婷 白桦郝楠 王军兵
（中国检验检疫科学研究院工业品检验研究所，北京１０００２５）
ｒ＝５“．８占＋Ｉ．２３
ｒ＝：，．０４ｘ＋４．·ｔ
Ｏ ０４—１０ Ｏ．９９９６
ｏ嗍 ｏ．ｚ—ｔｏ
ｎ８恚昆ｎｅ
ｏ．９９７０：螺ｅ ｙ＝１３８．８＊＋１，００ ｏ．０４。１０
ｙ＝２０３．６石＋９ ４８
ｏ ０４一ｌｏ ｏ ９９９ｌ
Ｄｉ意篡蓝氅ｍｌ
ｙ＝ｌ加９ｘ＋ｏ．１２ ｏ ０４一Ｉｏ ｏ ９９８７
Ｐｍｉ鬻乳帖
２．３质谱条件 电喷雾离子源；毛细管电压３．ｏ ｋＶ；射频透镜电压ｏ．５ Ｖ；离子源温度１０５。ｃ；去溶剂气温度３００℃；
去溶剂气流量３５０ Ｌ／ｈ；锥孔气流量ｌｏ Ｌ／ｈ；碰撞气体为氩气，碰撞气压３．２×１０—３ ｍｂｎ；多反应监测 （ＭＲＭ）模式检测，１６种激素的质谱分析参数见表ｌ。
表１激素的质谱分析参数 坠Ｍｅ ｌ Ｉ垡Ｍｓ／ＭｓⅣ１ｒａｍ武ｍ ｆｏｒ ｈｏ工ｍｏｎｅｓ蚰ａｌｙ８ｉ８
ｙ＝６６．８９石＋３ ７ｌ
Ｏ
４
８
１２
１６
２０
２４
２８
加ｂ
图ｌ １６种激素的ＭＲＭ色谱图
ｎｌ－导曲１安西Ｍ龙Ｒ（Ｍ衄ｉｃｒｈｌ咖ｄ加ａ佃ｅ）；舒２哪．０雌ｆ１三６醇ｌＩ（ｏ黜咖一ｏｄｎ）帕；３．拨尼松龙
（ｐｒｄｎｉ舯ｂｎｅ）；４．氢化可的松（ｈｙｄ硼Ⅲ曲·－）；５．泼尼松
（ｐ州ｎｉ鲫ｅ）１６可的橙（ｃ嘣ｉ８０Ⅱｅ）；７ ６ｄ－ｍｔＩ－ｙ】舯ｅｄｎｊ帅ｌｏｎｅ
Ｉ￡／Ｍｓ／Ｍｓ多反应监测模式下的定性及定量分析。其中糖皮质激素、雄激素和孕激素采用正离子扫描方式．
雌激素采用负离子扫描方式进行质谱分析。１６种激素的方法检出限为ｌ—１３∥ｋｇ，在１０一
１００峙／ｋｇ的３个添加水平范围内的平均回收率为７２．８％一９３．４％，相对标准偏差均小于ｌｏ．２％。
关键词液相色谱一串联质谱，化妆品，激素，固相萃取
２．４样品处理 准确称取化妆品试样Ｏ．５００ ｇ于５０ｍＬ具塞三角烧瓶中，加入ｌＯｍＬ甲醇，超声提取２０ｍｉｎ后，以
１２０００ ｒ／ｍｉｎ离心ｌＯ ｌＩＩｉｎ，收集上清液于５０ ｍＬ鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于加℃水浴浓缩至近干，用Ｎ： 缓慢吹干后，准确加入２ ｍＬ ３０％甲醇水溶液（体积分数，下同）溶解残渣，溶液用于固相萃取。Ｏ＊ｉｓ ＨＬＢ固相萃取柱依次用５ ＩＩｌＬ甲醇活化、５ ｍＬ水平衡后，将试样溶液过柱，先用４ ｍＬ ３０％甲醇水溶液淋 洗，再用４ｍＬ ８０％甲醇水溶液洗脱。收集洗脱液，用Ｎ：缓慢吹干后，准确加入ｌ ｍＬ流动相（２８％乙腈 水溶液）溶解残渣，过０．２０斗ｍ微孔滤膜后，Ｍ／ＭＳ／Ｍｓ测定。
离方式下，可获得较高丰度的［Ｍ＋Ｈ］＋母离子，雌激 素在离子源ＥｓＩ一电离方式下，可获得较高丰度的［Ｍ
—Ｈ］一母离子。根据欧盟２００２／６５７／Ｅｃ指令““规
定对于质谱确证方法必须达到４个确证点的要求，
低分辨液相色谱－质谱联用仪检测应在确定母离子的
基础上选择两个以上的子离子。在确定各激素的母 离子后，采用子离子扫描方式对子离子进行了优化 选择，确定了定量离子和辅助定性离子。通过优化 毛细管电压、一级锥孔电压、二级锥孔电压、射频透 镜电压、碰撞能量及质谱分辨率等质谱参数，使每种 激素的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度 达到最大，将液相色谱和三重四级杆质谱仪联机，对 离子源温度、去溶剂气温度及流量、锥孔气流量进行 优化，使样液中每种激素的离子化效率达到最佳。 １６种激素的ＭＲＭ色谱图见图１。 ３．２线性范围和检出限
ｙ＝４６４．艄＋３３．３７
ｙ＝６９８ ｏｘ＋８２１１ ｙ＝ｚ：，。ｘ—ｏ．ｓｏ
０．０４一ｌＯ ０．９９９０ ０．０４～１０ Ｏ．９９２５ ０．４—１０ ０．９９８５ Ｏ．０４一１０ Ｏ．９９７７ ｏ．０４—１０ ｏ ９９７５ ｏ ０４一·ｏ ｏ．９９７６
雌ｉ醇 Ｅ８ｔ打ｏｌ 氢化可的松 Ｈｖｄｍｃｏｎｉ舯ｎｏ
第３５卷
司）；可的松、倍他米松（日本ＴｃＩ公司）；泼尼松、醋酸泼尼松龙（美国Ｆ１ｕｋａ公司）；地塞米松、醋酸氢化 可的松、氢化可的松（美国Ａｈ Ａｅｓａｒ公司）。 ２．２液相色谱条件
Ａ舀Ｉｅｎｔ ｚＯＲＢＡｘ ｘＤＢ－ｃ８色谱柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５叫ｎ）；流动相：乙腈（Ａ）和水（Ｂ），梯度洗脱：
果。根据洗脱曲线，不同浓度的甲醇水溶液对１６种激素的淋洗能力随着甲醇浓度的升高而增加。３０％
及更低甲醇浓度的甲醇水溶液作为淋洗液时，１６种激素仍将பைடு நூலகம்留在同相苹取柱上，不会被洗脱下来。
因此，选用３０％甲醇水溶液作为淋洗液以净化固相萃取柱的固定相，去除样品基质中的杂质干扰。
８０％甲醇水溶液可将１６种激素完全洗脱下来，获得了最佳的回收率和净化效果。进一步对洗脱液的洗 脱体积进行了考察，结果表明，洗脱液的体积为４ ｍＬ时，１６种激素可完全从固相萃取柱上洗脱下来。
１引 言
化妆品与人们的生活密切相关，已成为必不可少的消费品之一。与此同时，化妆品的安全性已经日 益成为广大消费者关注的问题。研究表明，糖皮质激素可以抑制纤维细胞增生，减少５．羟色胺形成，因 而添加糖皮质激素的化妆品对皮肤具有一定的嫩白作用。但如果长期使用，会引发血糖升高、高血压、 骨质疏松、免疫功能下降及肥胖等危害”１。化妆品中添加雌激素、雄激素、孕激素等性激素，在短时间 内能促进毛发生长，防止皮肤老化，有除皱、增加皮肤弹性等作用。但长久使用会导致色素沉积，皮肤萎 缩变薄，对肝功能、心血管系统等均有不良影响，甚至具有致癌性，引发细胞癌、乳腺癌、卵巢癌等疾 病“１。我国”’及欧盟化妆品规程（ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｄｖｅ ７６／７６８／ＥＥｃ）”１中均明确规定，糖皮质激素、雌激 素、雄激素、孕激素等激素为化妆品组分中禁用物质。
３．１．２固相萃取柱的选择据文献报道”２’１…，激素化合物在ｃ。ｓＰＥ柱上表现出良好的反相色谱保留 行为，萃取效果较好。此外，Ｏａｓｊｓ ＨＬＢ ｓＰＥ柱是一种新型的基于反相色谱保留机理的固相萃取柱，它具 有比ｃ，。ｓＰＥ柱更高的吸附容量和更宽的ｐＨ适用范围等优点，对激素物质净化效果理想”ｏｔ…。实验比
万方数据
第９期
王超等：液相色谱一串联质谱法同时测定化妆品中的１６种激紊
１２５９
３结果与讨论
３．１实验条件的优化选择 ３．１．１ 样品提取方法的优化 实验采用超声提取方式对样品进行提取。分别考察了不同提取溶剂
（甲醇、无水乙醇、２８％乙腈水溶液、水）和不同提取时间（１０、１５、２０、２５及３０Ⅱｌｉｎ）等条件下的提取效果。 结果表明，以甲醇为提取溶剂，超声提取２０ ｍｉｎ的提取效率最高，可实现对测定成分提取完全。
可的松 Ｃ０ｎｉ鲫ｎｅ
倍他米橙 Ｂｅｌｍｎｅｌ｝Ⅲ∞ｎｏ
Ｐ—醋ｎｌ酸ｓｏ溲Ｉ…尼ａ松ｃｅ龙ｔａｔ６
口差ｉ：‰
ｙ＝１９．９５工＋５．３８
０ ２—１０ Ｏ．９９５２
ｒ＝３ｌ ２７Ｘ十２．２６
０．４—１０ ０．９９１４
ｒ＝２２６ ７Ｊ一２４∞Ｏ．１—１０ Ｏ．９９６４
ｙ＝８５３．竹＋８３研 ０ Ｉ）４—１０ ０ ９９６６
摘要建立了同时测定化妆品中糖皮质激索，雌激素，雄激素、孕激素等各类共１６种激素的液相色谱．串联 质谱分析方法。不同形态的化妆品样品以甲醇为提取溶剂进行超声提取，样品提取液高速离心处理，上清液
以。舾ｉ８ＨＬＢ固相萃取柱净化，经Ａ列ｅｎｔ ｚｏＲＢＡｘｘＤＢ—ｃ８（２５０Ｉ岫ｘ４．６删，５岬）反相色谱柱分离后进行
Ｈ…激素ｎｏ
线性方程
德潞紫一熊 ‰ｉ愁ｍ“一“。激。素
线性方程 Ｌｊｎｅ盯
ｅｑｕⅢｌｏｎ
镶琴熊德
嚣嚣ｍ濂－ｅｎｔ
曲安西尼 Ｔ而呷ｄｎｄｏｎｏ
泼尼松龙
ｍｄｎｉ∞ｉｏｎｏ
泼尼检
Ｐ吲ｉ∞∞
甲蕈泼尼松龙 ６口，Ｍｅｔｈｙｌｐ呲ｉＨｌ蝴ｏｎｃ
Ｄ慧煮誊鉴。
Ｈ盛氅慧璺要盟氅。。
ｙ＝１９６．６置＋７．５３ ｙ＝１２３ ６置一７．７２ ｙ＝１３０ ８置一２．ｓ２
分别配制一系列标准工作溶液，在选定的色谱
和质谱条件下进行测定，１６种激素的线性方程、线性范围和线性相关系数见表２。以信噪比为３估算检
出限（ＬＤＤ），１６种激素的检出限为１．Ｏ一１３。Ｏ彬ｋｇ。
万方数据
１２６０
分析化学
第３５卷
表２ １６种激素的线性方程、线性范匍和相关系数 ！些！！三坚！！竺望！生！！！：！！竺竺竺！壁！！型！！旦：壁！！！！竺竺！！：苎！型！皇皇！竺！！竺
实验还分别比较了中性甲醇水溶液与酸化甲醇水溶液（添加２％ｃＨ，ｃｏＯＨ酸液）与氨化甲醇水溶液
（添加２％ＮＨ。ＯＨ碱液）的淋洗效果，未见显著差异。
３。ｌ。４色谱条件的优化分别对色谱柱、流动相、梯度洗脱条件、柱温等色谱条件进行了优化。实现了 １６种激素理想的分离效果”１。
３．１．５质谱条件的优化根据１６种激素化合物的化学电离性质，分别选用ＥｓＩ＋和Ｅｓｌ。作为离子化 模式，采用流动注射泵连续进样方式进行质谱条件的优化。在正离子和负离子模式下分别进行全扫描 以选择适当的电离方式和分子离子峰。实验结果表明，糖皮质激素、雄激素和孕激素在离子源ＥｓＩ＋电
０～ｌＯ ｎｌｉｎ，２８％Ａ；ｌＯ一１０．１ ｍｉｎ，２８％Ａ～３８％Ａ；ｌＯ．１一１８ ＩＩｌｉｎ，３８％Ａ一４５％Ａ；１８～２０ １１Ｉｉｎ，４５％Ａ
～５０％Ａ；２０“２３ ｍｉｎ，５０％Ａ一８０％Ａ；２３～２８ ｎｌｉｎ，８０％Ａ；２８—３０ ｍｉｎ，８０％Ａ～２８％Ａ；流速
１．Ｏ ｍＩ／ｍｉｎ；柱温２５℃；进样量１０乩；分流比１：４。
曲安西龙、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、雌三醇、雌二醇、雌酮、已烯雌酚、睾酮、孕酮（美国ｓｉｇｍａ公
２０昕．０１一１１收稿；２００７．０３．２０接受 本文系国家质量监督检验检疫总局科技计捌资助项目（Ｎｏ ２００５Ⅸ００８．２∞６Ⅸ１４７） ·Ｅ－ｍ越ｌ：删ｌｑｉａｎｇｌｌ２９＠ｙａｈ∞ｃ咖咖
万方数据
分析化学
（甲基泼尼松龙）；８．倍他米松（ｋ锄埘ｈ蚴ｅ）；９．地塞米松
（ｄｅＨ啪ｄＩ删）；Ｉｏ醋酸泼尼松龙（ｐ枷。山ｎｃ－。Ｈ批）；
Ｉｌ醋酸氢化可的钕（ｈｙｄ帆吼ｉＢ蛐ｅ ａｃ出ｋ）；１２雌二酵
‘争ｅ曲ｄｉ０１）；１３．睾酮（ｔ鹧咖Ｉ哪帕）；１４．雌酮（嘲Ⅱ帅ｅ）；
１５．己烯雌酚ｆｄｊｄｈｙｌｓｔｉｌｂｅＢｌｒ０１）；１６．孕酮（Ｐ晔咖呻岫）。