反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量

实验一反相高效液相色谱法测定茶叶中咖啡因的含量

一．实验目的

1. 熟悉液相色谱仪的基本构造和操作方法

2. 学会利用外标法对物质进行色谱定量分析

二．仪器与试药

仪器：

高效液相色谱仪（日本岛津10AVP型）、溶剂过滤器、样品溶液过滤器、微量进样器

试药：甲醇、乙腈、超纯水、咖啡因对照品

三、色谱条件

色谱柱：C18（250×4.6，5um）

流动相：甲醇-乙腈-水=45：10：45 （v/v）

检测器及检测波长：紫外检测器280nm

流速：0.6ml/min

四、实验操作

1．对照品溶液的配制：准确称取咖啡因对照品适量，用乙腈：水（1:1）混合溶剂配制成1.0mg/mL 咖啡因储备液；分别移取10μL、20μL、30μL、40μL咖啡因储备液，用超纯水定容至5mL，配制成浓度为2.0μg/mL、4.0μg / mL、6.0μg /mL、8.0 μg/mL的一系列对照品溶液，备用。

2. 样品溶液的配制：准确称取0.035g茶叶, 加乙腈：水（1:1）混合溶剂8mL，超声提取10min，用超纯水定容至10mL，过滤并稀释20倍，备用。

3. 调用或创建咖啡因测定方法并运行方法

4. 测定：待基线平稳后，分别吸取25μL对照品溶液和样品溶液进样。

五、数据处理及计算

以对照品溶液峰面积与对应含量绘制工作曲线，根据样品溶液峰面积在曲线上查出其进样时含量，并计算得到茶叶中咖啡因的百分含量。

六、思考题

1．液相色谱与气相色谱相比较有哪些不同？

2. 如果用液相色谱法测定可乐中咖啡因，样品应该如何处理？

附：岛津10AVP型高效液相色谱仪操作

一、开机

1．打开计算机。

2．开启高效液相色谱仪各部件电源开关（脱气机→A泵→B泵→检测器→柱温箱→主控器）。

3．待高效液相色谱仪各部件自检完毕，在计算机上启动化学工作站ClassVP 并点击Instrument ，输入用户名和密码，点击确定。

二、实验参数的设置

在Method下，进行操作：

1．单击溶剂瓶图标，设置所用溶剂瓶中溶剂量后，点击OK；单击高压泵图标，设置泵流速0.6mL·min-1，梯度洗脱溶剂B（水）0%，最高柱压设为2.0×107 Pa。

2．单击色谱柱图标，设置柱温箱温度为25℃。

3．单击检测器图标，设置检测波长为280nm，，数据采集时间7min。

四、运行样品

1．打开Purge阀。

2．运行Instrument菜单下System On命令启动系统（或单击各图标的on图标启动系统）。

3．待废液管中无气泡流出，关闭Purge阀。

4．待基线稳定之后，单击single run, 进行样品信息编辑。

5. 用微量进样器进样后，扳动手动进样阀至Inject位置，仪器自动开始纪录。

6．待测物出峰完全后，按F8停止采集数据。

五、实验数据处理

1．定性、定量分析参数的设定

（1）一级校正表的建立

①在Data Analysis界面下，点击File菜单下的Load Signal，调用低浓度标样的实验结果。

②优化谱图：打开Graphics菜单，选择Signal Options选项，进入Signal Option编辑框，在Range选择中选择Use Range，输入适当的参数。

③优化积分：在Data Analysis 界面下，单击Integration菜单，选择Integration Event，选择适当的参数，编辑积分项目。

在积分事件表中，输入合适的积分参数，然后单击积分事件表左上角带对号的图标。

④建立一级校正表：单击Calibration菜单，选择New Calibration Table，选择默认参数，单击OK。

⑤在校正表中输入化合物名称及浓度。在输入浓度之后，相应化合物的校正曲线会显现出来。

⑥单击OK键。

（2）二级校正表的建立

①调用第二个标样色谱图。

②按照一级校正表建立过程中所涉及的内容，优化谱图，优化积分参数。

③单击Calibration菜单，选择Add Level，编辑二级校正表，单击OK。

④在校正表中，输入第二个标样的浓度。输入浓度后，相应化合物的校正曲线会显现出来。

⑤单击OK键，完成二级校正表的编辑。

（3）校正表参数及报告的设定

①校正表参数设定。单击Calibration菜单，选择Calibration Setting，在Calibration Setting 编辑框中输入浓度单位、时间窗口、校正曲线类型。

②报告的设定。单击Report菜单，选择Specify Report，进入Specify Report编辑框，输入打印目的地，选择定量方法ESTD。

2．未知样品的定性、定量分析

（1）调用未知样品数据文件。

（2）优化谱图显示，优化积分参数。

（3）点击报告图标，显示定性、定量分析结果。

（4）选择Report菜单下Print Report命令，打印定量结果。