生物化学与分子生物学进展：PCR技术及应用
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可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的 序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的 插入DNA；建立基因组步移文库。
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
3. 多重PCR（复合PCR）
在同一PCR反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份DNA样 品中几个不同靶区域的DNA片段，这一过程称为多重PCR。可 用于检测特定基因序列的大小、缺失、突变是否存在。
1983年
94℃变性
55℃退火
5’
5’ 3’
XX℃延伸（DNA聚合酶）
5’ 3’
5’
94℃
55℃
37℃
?
三、PCR技术的改进和发展
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术，大大 提高了PCR的效率。
PCR技术的发展
Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus)
（PE，1989）
三个加热块 ＋ 机械手
（Strategene，1994）
半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf）
空气加热 (Roche)
梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪
Lab-on-chip式的PCR仪(芯片PCR)
普通PCR仪、梯度PCR仪
全新4通道实时荧光定量PCR仪
1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文 ，Mullis是共同作者；
1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始 学习PCR的方法。
有关PCR反应
• PCR反应体系 • PCR过程 • PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 Taq DNA聚合酶
缓冲液（Mg2+ ）
模板DNA
各200μmol/L 各0.1～1.0 μmol/L 0.5 ～ 2.5U 1.5～ 2.0mmol/L 1μg
有关PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的基本原理
Mullis 有关PCR反应
的构思
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的基本原理
比喻1989年为PCR爆炸年。 1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
PCR仪的变迁
三个水浴锅，用手移动
（Mullis等人当时用的）
电加热块 ＋ 自来水冷却
（PE，1988）
电加热块 ＋ 内置循环液冷却
Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足 够多的模板DNA而烦恼
1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下来自百度文库墅的路 上……
PCR从构想成为现实
1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp 长度的第一个PCR片段；
1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利 号4,683,202 ），Mullis是第一发明人；
过程
变性
退火
1st cycle
2nd cycle
3rd cycle
延伸
经典循环参数（500bp以内）
94℃
94℃ 55 ℃ 72 ℃ 72℃
4℃
5min
30s 45s 1min 7min
×30次
forever
PCR技术的特点
灵敏度高
1. 30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝） 2. 将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 3. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 4. 病毒检测的灵敏度可达3个PFU 5. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制 性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR)
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已 知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
生物化学与分子生物学进展
目录
PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的类型 PCR的应用
神奇而又简单的PCR
染色体
PCR 可以在3小时内把 特定的基因指数放大
PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
PCR技术的创建
一、最初的理论描述—Khorana
Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经 DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物， 并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”
特异性强
引物序列与模板结合的特异性
快速简便
一次性加好反应液，2～4小时即可完成扩增
PCR的类型
1）不对称PCR 2) 反向PCR 3）多重PCR 4）LP-PCR 5）锚定PCR 6）PCR固相分析法 7) 原位PCR 8）逆转录PCR 9）荧光定量 PCR
1. 不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限
但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚 合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有 实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一 种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人 们遗忘了……
PCR技术的创建
二、PCR技术的发明—Kary Mullis
1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了 PCR
(%)
100 酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
Saiki, 1988年
94℃
55℃
72℃
PCR循环
三、PCR技术的改进和发展
1988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化 1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，
PCR技术的原理
无细胞分子克隆法：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分 别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按 照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过 不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新 合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成 量呈指数型增长。
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
3. 多重PCR（复合PCR）
在同一PCR反应体系中，设计多对引物，同时扩增一份DNA样 品中几个不同靶区域的DNA片段，这一过程称为多重PCR。可 用于检测特定基因序列的大小、缺失、突变是否存在。
1983年
94℃变性
55℃退火
5’
5’ 3’
XX℃延伸（DNA聚合酶）
5’ 3’
5’
94℃
55℃
37℃
?
三、PCR技术的改进和发展
1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术，大大 提高了PCR的效率。
PCR技术的发展
Taq DNA聚合酶（Thermus aquaticus)
（PE，1989）
三个加热块 ＋ 机械手
（Strategene，1994）
半导体制冷和加热（MJ, PE, BioMetra, Eppendorf）
空气加热 (Roche)
梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪
Lab-on-chip式的PCR仪(芯片PCR)
普通PCR仪、梯度PCR仪
全新4通道实时荧光定量PCR仪
1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文 ，Mullis是共同作者；
1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始 学习PCR的方法。
有关PCR反应
• PCR反应体系 • PCR过程 • PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 Taq DNA聚合酶
缓冲液（Mg2+ ）
模板DNA
各200μmol/L 各0.1～1.0 μmol/L 0.5 ～ 2.5U 1.5～ 2.0mmol/L 1μg
有关PCR反应
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的基本原理
Mullis 有关PCR反应
的构思
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的基本原理
比喻1989年为PCR爆炸年。 1993年，Mullis因此项技术荣获诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis（1944－）
http://www.karymullis.com
PCR仪的变迁
三个水浴锅，用手移动
（Mullis等人当时用的）
电加热块 ＋ 自来水冷却
（PE，1988）
电加热块 ＋ 内置循环液冷却
Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足 够多的模板DNA而烦恼
1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下来自百度文库墅的路 上……
PCR从构想成为现实
1983年12月， Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp 长度的第一个PCR片段；
1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利 号4,683,202 ），Mullis是第一发明人；
过程
变性
退火
1st cycle
2nd cycle
3rd cycle
延伸
经典循环参数（500bp以内）
94℃
94℃ 55 ℃ 72 ℃ 72℃
4℃
5min
30s 45s 1min 7min
×30次
forever
PCR技术的特点
灵敏度高
1. 30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝） 2. 将模板从皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 3. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 4. 病毒检测的灵敏度可达3个PFU 5. 细菌检测的最小检出率为3个细菌
制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制 性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR)
用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已 知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
生物化学与分子生物学进展
目录
PCR技术的创建 PCR的原理 PCR的类型 PCR的应用
神奇而又简单的PCR
染色体
PCR 可以在3小时内把 特定的基因指数放大
PCR：Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
PCR技术的创建
一、最初的理论描述—Khorana
Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经 DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物， 并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”
特异性强
引物序列与模板结合的特异性
快速简便
一次性加好反应液，2～4小时即可完成扩增
PCR的类型
1）不对称PCR 2) 反向PCR 3）多重PCR 4）LP-PCR 5）锚定PCR 6）PCR固相分析法 7) 原位PCR 8）逆转录PCR 9）荧光定量 PCR
1. 不对称PCR
目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限
但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚 合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有 实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一 种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人 们遗忘了……
PCR技术的创建
二、PCR技术的发明—Kary Mullis
1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了 PCR
(%)
100 酶 80 活 性 60
40 20
40 50 60 70 80 90 100
温度(℃)
Saiki, 1988年
94℃
55℃
72℃
PCR循环
三、PCR技术的改进和发展
1988年第一台PCR仪问世，PCR逐步实现自动化 1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首，
PCR技术的原理
无细胞分子克隆法：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分 别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按 照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。通过 不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。另一方面，新 合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成 量呈指数型增长。